高山被孢霉發(fā)酵生產(chǎn)花生四烯酸的優(yōu)化

曹剛剛，　管政兵，　廖祥儒，　蔡宇杰*（.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實驗室，江蘇無錫4；.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫4）

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高山被孢霉發(fā)酵生產(chǎn)花生四烯酸的優(yōu)化

曹剛剛1，管政兵2，廖祥儒1，蔡宇杰*1
（1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實驗室，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫214122）

摘要：研究了高山被孢霉液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)花生四烯酸過程中主要底物和培養(yǎng)條件對花生四烯酸產(chǎn)量的影響。采用單因素和正交試驗設(shè)計優(yōu)化了碳源、氮源、無機(jī)鹽的種類及濃度，找出了最佳的培養(yǎng)溫度和變溫策略。試驗結(jié)果顯示最佳碳源和氮源及濃度是：玉米粉66 g/L，豆粕粉54 g/L；最佳無機(jī)鹽配方是：KH2PO43 g/L，MgSO41 g/L，Na2SO42 g/L。采取逐級變溫培養(yǎng)：30℃（3 d），25℃（4 d），20℃（4 d）。優(yōu)化后生物量和花生四烯酸產(chǎn)量分別達(dá)到52.3和13.6 g/L。

關(guān)鍵詞：谷物粗粉；碳氮比；變溫策略；無機(jī)鹽；花生四烯酸；高山被孢霉

花生四烯酸即全順式Δ-5，8，11，14-二十碳四烯酸，縮寫為ARA。ARA是重要的人體生長發(fā)育必需的三大脂肪酸之一，在維持人體的健康和正常的生長發(fā)育中扮演重要的角色。作為多不飽和脂肪酸家族的重要一員，ARA是ω-6系列脂肪酸的代謝樞紐。ARA主要在以下兩個方面發(fā)揮它的生理功能：（1）結(jié)構(gòu)組分。ARA是膜磷脂的組分之一，對于細(xì)胞的生長和分裂不可或缺。另外，其在人腦和視網(wǎng)膜等特殊結(jié)構(gòu)中含量很高，對于智力和視力發(fā)育至關(guān)重要[1]；（2）調(diào)節(jié)功能。ARA能被人體吸收并轉(zhuǎn)化為多種二十碳衍生物，其中包括多種代謝調(diào)節(jié)物質(zhì)，比如前列腺素、白細(xì)胞三烯和凝血噁烷等[2]，對于維持人體的內(nèi)穩(wěn)態(tài)具有重要作用[3]。另外，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，ARA與信號傳導(dǎo)和癌癥的發(fā)生也有較為密切的關(guān)系[4-5]。目前，ARA在食品、水產(chǎn)養(yǎng)殖、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用[6-8]。

ARA的傳統(tǒng)來源主要是植物草籽、動物肝臟和豬腎上腺等。但是這些來源一方面ARA含量很低，資源少，提取成本高昂，而且產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到市場需求。近年來實現(xiàn)的微生物發(fā)酵生產(chǎn)，相對而言優(yōu)勢明顯：ARA含量高，大大降低了提取成本；發(fā)酵周期短，產(chǎn)量高；生產(chǎn)可操作性強(qiáng)，不受季節(jié)、氣候影響等[1，9]。

目前利用高山被孢霉已經(jīng)實現(xiàn)了ARA的商業(yè)化生產(chǎn)，主要底物是葡萄糖、酵母粉等[10-11]，生產(chǎn)成本仍然較高，作者探索玉米和豆粕等生物質(zhì)原料經(jīng)生物轉(zhuǎn)化發(fā)酵生產(chǎn)ARA，并在此基礎(chǔ)上優(yōu)化培養(yǎng)條件以期進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)量。

1　材料與方法

1.1菌種

高山被孢霉Mortierellaalpina，作者所在實驗室保藏。

1.2培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基（g/L）：去皮馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂20；種子培養(yǎng)基：玉米粉40 g/L，pH自然；發(fā)酵初始培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，酵母粉5，KH2PO43，MgSO40.5，Na2SO41，CaCl20.5，pH自然。以上培養(yǎng)基均經(jīng)過115℃滅菌20 min。

1.3方法

1.3.1菌絲和孢子懸液的制備斜面種子在25℃培養(yǎng)7 d至白色菌絲鋪滿斜面。加入5 mL無菌水用接種環(huán)刮下斜面表面菌絲和孢子，取出后置于三角瓶中用玻璃珠打碎，使得菌絲分散均勻。然后接入種子培養(yǎng)基。

1.3.2種子培養(yǎng)菌絲和孢子懸液按照體積分?jǐn)?shù)10%的接種量接入種子培養(yǎng)基，30℃、200 r/min條件下培養(yǎng)36 h。

1.3.3搖瓶培養(yǎng)種子液以體積分?jǐn)?shù)10%的接種量接入發(fā)酵生產(chǎn)培養(yǎng)基，200 r/min培養(yǎng)7 d。

1.3.4碳源和氮源優(yōu)化分別以葡萄糖和酵母粉為碳源和氮源，研究不同氮源和碳源對菌絲生長和ARA產(chǎn)量的影響。

1.3.5 4種無機(jī)鹽質(zhì)量濃度的優(yōu)化玉米粉和豆粕粉作為碳源和氮源，按表1設(shè)計4因素三水平正交試驗。

表1　L9（34）正交優(yōu)化設(shè)計因素水平表Table 1 Orthogonal design

1.3.6最佳培養(yǎng)溫度的確定發(fā)酵培養(yǎng)基接種后分別在20、25、30℃和分步降溫條件下培養(yǎng)13 d，并且每隔2 d測定生物量、總油脂和油脂組成。

1.3.7生物量的測定發(fā)酵結(jié)束后，用雙層紗布過濾發(fā)酵液，用去離子水洗滌菌體至濾液澄清。菌體70℃烘干至恒重。

1.3.8胞內(nèi)油脂提取烘干后的菌體用研缽研磨成粉末，取0.5 g置于50 mL離心管中，加入2 mL去離子水和1.5 mL濃鹽酸，密封后80℃水浴消化1 h。細(xì)胞經(jīng)消化裂解后用6 mL v（氯仿）∶v（甲醇）= 2∶1，分3次提取油脂。合并每次的氯仿抽提液，烘干揮發(fā)除去溶劑，稱重得油脂質(zhì)量。

1.3.9脂肪酸組成分析取50 μL粗油脂加入50 mL離心管中，以2 mg十九烷酸作為內(nèi)標(biāo)，混合后加入2 mL 0.5 mol/L氫氧化鉀甲醇溶液，70℃水浴保溫0.5 h；冷卻后再加入2 mL體積分?jǐn)?shù)14%三氟化硼甲醇溶液，70℃水浴保溫0.5 h。脂肪酸甲酯化后加入6 mL正己烷和3 mL飽和氯化鈉溶液，震蕩后離心分層。上層正己烷用于氣相色譜檢測。

脂肪酸甲酯采用配備FID檢測器和EC-Wax （30 m×0.32 mm×0.25 μm）色譜柱的氣相色譜儀GC-9160進(jìn)行分析。條件如下：載氣為氮?dú)猓M(jìn)樣量1 μL；進(jìn)樣口和檢測器溫度分別設(shè)定為250和280℃；程序升溫：柱爐初始溫度120℃，保持3 min，然后以2℃/min升溫至160℃，再以4℃/min升溫至190℃。

2　結(jié)果與分析

2.1不同碳源的比較

碳源是影響微生物生長和產(chǎn)物形成最重要的因素之一。用于構(gòu)成細(xì)胞和代謝產(chǎn)物的碳鏈支架。高山被孢霉胞內(nèi)油脂的主要存在形式是甘油三酯[12-13]，主要元素即為碳。因此，要獲得生物量和油脂的高產(chǎn)就必須找到對生長和油脂積累最佳的碳源種類，并且供應(yīng)量必須充足。

圖1顯示了使用不同碳源時的生物量、總油脂和ARA的產(chǎn)量。由圖可見，淀粉作為碳源時最有利于菌體的生長，以可溶性淀粉和玉米粉作為碳源時的生物量遠(yuǎn)高于其它碳源。由于油脂是胞內(nèi)產(chǎn)物，使用這兩種碳源也就得到了相對較高的總油脂和ARA產(chǎn)量。之前，國內(nèi)外的相關(guān)研究普遍指出葡萄糖是高山被孢霉生長和產(chǎn)油的最佳碳源[11，14]，區(qū)別可能源于使用的菌株不同。另外，玉米磨粉直接用于高山被孢霉液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)ARA還沒有專門報道。由作者的研究結(jié)果可見，使用玉米粉作為碳源不僅可以大幅度降低原料成本，同時還可以獲得更高的產(chǎn)量。最高的生物量和ARA產(chǎn)量分別達(dá)到10.34、1.86 g/L，接近葡萄糖做碳源時的3倍。

圖1　不同碳源對于生長、總油脂和ARA產(chǎn)量的影響Fig. 1 Effect of different carbon sources on biomass，total lipids and ARA yield

2.2不同氮源的比較

氮源是又一決定產(chǎn)量的因素。作為氮源的營養(yǎng)物質(zhì)主要為發(fā)酵體系提供氮元素。雖然氮并不直接參與ARA的元素組成，但是對于形成細(xì)胞成分的蛋白質(zhì)及催化合成代謝產(chǎn)物的酶必不可少，因此間接影響了ARA產(chǎn)量。因為高生物量是高產(chǎn)的關(guān)鍵，因此，與碳源的優(yōu)化相似，優(yōu)良的氮源必須易于被菌體吸收同化并促進(jìn)生長。

圖2顯示了不同氮源對于高山被孢霉生物量、總油脂和ARA產(chǎn)量的影響。總體上，高山被孢霉難于利用無機(jī)氮源而易于利用有機(jī)氮源。無機(jī)態(tài)氮作為唯一氮源時的生物量普遍極低，而有機(jī)氮源相反，尤其是豆粕粉，生物量達(dá)到14.45 g/L，相應(yīng)的ARA產(chǎn)量達(dá)到了3.18 g/L。之前的研究者普遍報道酵母粉是ARA生產(chǎn)的最佳氮源[10，15]。作者的研究結(jié)果顯示高山被孢霉對于豆粕粉具有優(yōu)良的利用能力。另外，豆粕本身油脂含量較高，能被細(xì)胞作為碳源利用，也可以作為多不飽和脂肪酸合成的前體[16]。因此，豆粕作為氮源時菌體的總油脂含量較其他有機(jī)氮源為高。

圖2　不同氮源對于生長、總油脂和ARA產(chǎn)量的影響Fig. 2　 Effect of different nitrogen sources on biomass，total lipids and ARA yield

2.3無機(jī)鹽的正交優(yōu)化

KH2PO4，MgSO4，Na2SO4，CaCl2是已報道的對高山被孢霉發(fā)酵產(chǎn)ARA產(chǎn)量影響較大的4種無機(jī)鹽[17]。由于采用玉米粉和豆粕粉作為碳源和氮源，本身已經(jīng)含有豐富的微量元素和生長因子，因此只選擇以上幾種優(yōu)化濃度以提供充足的K、Na、Mg、Ca、P、S等元素。正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

由表所示極差計算結(jié)果可知各因素對于ARA的產(chǎn)量影響大小依次為CaCl2＞KH2PO4＞Na2SO4＞MgSO4。最佳組合為A2B3C3D1，最佳的無機(jī)鹽添加配方為（g/L）：KH2PO43，Na2SO42，MgSO41。其中MgSO4和Na2SO4質(zhì)量濃度均是初始培養(yǎng)基的兩倍。在最佳添加量時ARA的產(chǎn)量比優(yōu)化前有了較大幅度的提高。

2.4碳氮質(zhì)量比的優(yōu)化

Koike等[18]研究表明，碳氮質(zhì)量比對于菌體的油脂含量影響明顯。低碳氮質(zhì)量比時，氮源相對豐富，更有利于菌體的生長，此時菌體的總油脂質(zhì)量濃度則相對偏低；反之，氮源相對匱乏，更有利于菌體的油脂積累，此時的生物量則相對偏低。為了獲得較高的ARA產(chǎn)量，需要找到最佳的碳氮質(zhì)量比，使得生物量和油脂質(zhì)量濃度得以平衡，從而獲得較高的總油脂產(chǎn)量。

表2　無機(jī)鹽優(yōu)化L9（34）正交實驗數(shù)據(jù)和結(jié)果Table 2 Data and results of orthogonal design for optimization of mineral addition

圖3顯示了碳氮質(zhì)量比在13～28范圍時生物量、菌體的油脂質(zhì)量濃度和油脂中ARA質(zhì)量濃度隨碳氮質(zhì)量比改變的變化趨勢。隨碳氮質(zhì)量比的升高，生物量逐漸減少；菌體的油脂質(zhì)量濃度逐漸增大；而油脂中的ARA質(zhì)量濃度則先升高后降低，在19時達(dá)到最大，達(dá)到34 g/dL?？梢娮髡叩难芯拷Y(jié)果與先前的報道相符。最佳碳氮質(zhì)量比下ARA產(chǎn)量比初始碳氮質(zhì)量比13時提高了17%。

圖3　碳氮質(zhì)量比對生物量、菌體的油脂質(zhì)量濃度以及油脂中ARA質(zhì)量濃度的影響Fig. 3　 Effect of C/N ratio on biomass yield，lipids and ARA content

在以上優(yōu)化的基礎(chǔ)上，把碳源和氮源質(zhì)量濃度均提高3倍，在同樣的發(fā)酵時間和發(fā)酵條件下，生物量、總油脂和ARA產(chǎn)量分別達(dá)到45.1、21.8、8.7 g/L。

2.5溫度對生長及ARA產(chǎn)量的影響

溫度從多個方面影響ARA的生產(chǎn)效率。溫度偏低，菌體生長和分裂緩慢，造成遲滯期和對數(shù)期延長，延長了發(fā)酵周期，但是ARA含量高；溫度偏高，雖然可以快速進(jìn)入穩(wěn)定期，但是ARA含量減少。因為在低溫條件下菌體需要合成更多的多不飽和脂肪酸以維持細(xì)胞膜的流動性[19]。

不同溫度下生物量、總油脂和ARA產(chǎn)量列于表3中。隨著溫度的升高，達(dá)到穩(wěn)定期所需的時間縮短。20℃時，第7天生物量才達(dá)到最大值；而在30℃時只需要3天生物量即達(dá)到最大值。但是，較低的溫度能得到更高的生物量（圖4）。不同溫度下菌體的油脂含量差別相對較小。油脂中ARA質(zhì)量濃度也取決于溫度，20℃、13 d時，ARA達(dá)到了總油脂的57%，比30℃時高了17%?？傮w上，20℃時ARA產(chǎn)量最高，發(fā)酵13 d達(dá)到13.4 g/L。但是過長的發(fā)酵時間降低了生產(chǎn)效率。為了縮短發(fā)酵周期，采取逐級降溫的策略。如圖4所示，即30℃培養(yǎng)3 d，降溫到25℃培養(yǎng)4 d，最后降溫到20℃再培養(yǎng)4 d。此時的生物量和ARA的產(chǎn)量達(dá)到了20℃的水平，發(fā)酵時間縮短了2 d，提高了經(jīng)濟(jì)效益。變溫培養(yǎng)時的生物量、總油脂和ARA產(chǎn)量隨時間的變化列于表3中。

表3　延長發(fā)酵時間時不同溫度及變溫條件下的生物量、總油脂和ARA產(chǎn)量比較Table 3　 Culture profiles of M. alpina grown at constant and stepwise temperature decreasing strategy associated with prolonged incubation time

圖4　不同溫度下生物量隨時間的變化Fig. 4　 Time courses of M. alpina under different temperatures

3　結(jié)語

作者通過優(yōu)化高山被孢霉發(fā)酵產(chǎn)花生四烯酸的培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件，發(fā)現(xiàn)碳源、氮源、無機(jī)鹽和溫度都對產(chǎn)量有重要影響。前兩者主要影響生物量，溫度則影響生物量和總油脂中的ARA產(chǎn)量。研究得出培養(yǎng)基最佳組成為：玉米粉66 g/L，豆粕粉54 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO41 g/L，Na2SO42 g/L。采用玉米粉和豆粕粉等作為原料，可降低生產(chǎn)成本，變溫培養(yǎng)可以在不減少產(chǎn)量的同時縮短發(fā)酵時間。

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Optimization for the Production of Arachidonic Acid from Mortierellaalpina

CAO Ganggang1，GUAN Zhengbing2，LIAO Xiangru1，CAI Yujie*1
（1. Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2. School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Abstract：Single factor and orthogonal experiments were applied to investigate effects of different nutrients and conditions on the fermentation of arachidonic acid by M. alpina. Results indicated that corn and soybean meal were preferred for fungal growth and lipid accumulation. With a temperature-shift strategy the fermentation time was shortened two days. Arachidonic acid reached the maximum yield（13.6 g/L）when the medium was comprised of 66 g/L corn meal，54 g/L soybean meal，3 g/L KH2PO4，1 g/L MgSO4and 2 g/L Na2SO4.

Keywords：raw crop materials，C/N ratio，temperature-shift strategy，arachidonic acid，Mortierella alpina

*通信作者：蔡宇杰（1973—），男，江蘇無錫人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事生物工程研究。E-mail：yjcai@jiangnan.edu.cn

收稿日期：2014-08-21

中圖分類號：Q 815

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1673—1689（2016）01—0101—06