茯苓多糖對(duì)2型糖尿病小鼠腎組織抗氧化能力及Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)影響

黃聰亮，　鄭佳俐，　李鳳林，　宮敬利（1．漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系，福建漳州6000；2.農(nóng)產(chǎn)品深加工及安全福建省高校應(yīng)用技術(shù)工程中心，福建漳州6000；.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林吉林12101）

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茯苓多糖對(duì)2型糖尿病小鼠腎組織抗氧化能力及Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)影響

黃聰亮1，2，鄭佳俐1，2，李鳳林3，宮敬利3
（1．漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系，福建漳州363000；2.農(nóng)產(chǎn)品深加工及安全福建省高校應(yīng)用技術(shù)工程中心，福建漳州363000；3.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林吉林132101）

摘要：研究探討茯苓多糖（WRP）對(duì)2型糖尿?。∟IDDM）小鼠腎組織抗氧化能力及Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)影響。采用高糖高脂飼料＋小劑量鏈脲佐菌素（STZ）方式誘導(dǎo)NIDDM動(dòng)物模型，然后將動(dòng)物分成正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、WRP灌胃組、羅格列酮灌胃組，藥物連續(xù)灌胃42 d，檢測(cè)小鼠腎組織抗氧化能力以及Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，WRP能使NIDDM小鼠腎組織中超氧化物岐化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶水平明顯升高，丙二醛的水平明顯降低；即WRP能增強(qiáng)機(jī)體腎臟的抗氧化性，降低脂質(zhì)過(guò)氧化，保護(hù)自由基介導(dǎo)的氧化損傷，減輕糖尿病對(duì)腎臟的損害。WRP能抑制NIDDM小鼠腎組織中Bax基因過(guò)多表達(dá)；使糖尿病狀態(tài)下腎組織細(xì)胞凋亡趨勢(shì)受到抑制，對(duì)糖尿病腎病具有一定預(yù)防作用。

關(guān)鍵詞：茯苓多糖；2型糖尿?。荒I組織；Bax；Bcl-2

糖尿病（DM）是一種因體內(nèi)胰島素絕對(duì)或者相對(duì)不足所導(dǎo)致的慢性代謝性疾病，其不僅能導(dǎo)致高血糖癥，同樣還會(huì)引起許多并發(fā)癥[1]。其中，糖尿病腎?。―N）是DM最常見(jiàn)的嚴(yán)重微血管并發(fā)癥，近年來(lái)在我國(guó)的發(fā)病率亦呈上升趨勢(shì)，在早、中期以臟體積增大、血壓增高、持續(xù)性蛋白尿、低蛋白血癥等為主要特征，晚期則發(fā)展為終末期糖尿病腎病，出現(xiàn)氮質(zhì)血癥、腎功能衰竭等。統(tǒng)計(jì)資料表明，目前由糖尿病腎病造成的腎功能衰竭比非糖尿病患者高17倍，是糖尿病患者主要死亡原因之一[2-3]。研究表明，細(xì)胞凋亡與DN的發(fā)病機(jī)制有直接的關(guān)系，是導(dǎo)致胰島β細(xì)胞數(shù)目逐漸減少的主要原因[4-5]。Bcl-2是一個(gè)抑制凋亡的基因，其蛋白表達(dá)產(chǎn)物能抑制細(xì)胞凋亡；Bcl-2家族中還包括它的同源蛋白Bcl-x1、Bcl-xs、Bax等。Bcl-2與Bax形成同源二聚體時(shí)，便可誘導(dǎo)凋亡；Bcl-2與Bax蛋白表達(dá)水平的高低與細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系[6-9]。作者前期已對(duì)茯苓多糖（WRP）抗2型糖尿?。∟IDDM）的作用及其機(jī)理進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)中、高劑量（100、200 mg/kg）的WRP能有效降低NIDDM小鼠高血糖、血脂的水平，改善IR狀態(tài)，且高劑量（200 mg/kg）效果最佳。為進(jìn)一步研究WRP對(duì)NIDDM小鼠腎臟保護(hù)作用，作者采用高劑量WRP（200 mg/kg）灌胃NIDDM小鼠，通過(guò)測(cè)定腎組織中超氧化物岐化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPx）和丙二醛（MDA）含量；免疫組化SP法檢測(cè)腎組織中Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)來(lái)評(píng)價(jià)其保護(hù)作用，為WRP的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

茯苓：購(gòu)買于漳州藥材市場(chǎng)；鏈脲佐菌素（STZ）：購(gòu)于美國(guó)Sigma有限公司；羅格列酮（文迪雅，Rosiglitazone）：購(gòu)于葛蘭素史克（天津）有限公司；SOD、GPx、MDA試劑盒：購(gòu)于南京建成生物工程研究所；兔抗鼠Bax單克隆抗體、兔抗鼠Bcl-2單克隆抗體、鼠、兔免疫組化試劑盒、DAB（對(duì)二氨基聯(lián)苯）顯色試劑盒：購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；其它化學(xué)試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海榮生化儀器廠產(chǎn)品；中草藥萬(wàn)能粉碎機(jī)：江陰市偉翔藥化機(jī)械廠產(chǎn)品；Gel Doc XR System凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)Gene公司產(chǎn)品；SMZ1500熒光顯微鏡及照相系統(tǒng)：日本尼康公司產(chǎn)品；ALCYON 300全自動(dòng)生化分析儀：美國(guó)Abbott公司產(chǎn)品；超純水制備機(jī)：美國(guó)PureLab Plus公司產(chǎn)品。

1.3試驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性昆明系小鼠（體重20.0±2.0 g）由吉林市生物制品廠提供。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)化清潔級(jí)飼養(yǎng)室（使用許可證號(hào)：JLNSPX211-0037），室內(nèi)溫度控制在（23±2）℃，相對(duì)濕度控制在（50± 5）%。小鼠自由攝食與飲水，提供標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料（配方為：質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%蛋白質(zhì)＋60%碳水化合物＋9%脂肪＋11%纖維素）。動(dòng)物試驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d以適應(yīng)環(huán)境。試驗(yàn)動(dòng)物照顧按照國(guó)家《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》與國(guó)際通用《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南（NAP）》進(jìn)行，并分別經(jīng)漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)及吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.4試驗(yàn)方法

1.4.1茯苓多糖提取將塊狀茯苓清理干凈，粉碎后過(guò)100目篩獲茯苓粉；將茯苓粉按1 g∶5 mL比例加入石油醚，回流脫脂2次，每次1.5 h，濾去石油醚，濾渣揮干后獲預(yù)處理茯苓粉。按1 g∶10 mL加入蒸餾水，90℃下提取8 h左右，離心除去殘?jiān)?。濾液減壓濃縮，4℃下進(jìn)行醇析、離心，所得沉淀用乙醇、丙酮及乙醚反復(fù)洗滌數(shù)次，干燥后得茯苓粗多糖（WRP）。

1.4.2 NIDDM動(dòng)物模型的建立與分組采用高糖高脂飼料+小劑量STZ方式誘導(dǎo)NIDDM動(dòng)物模型。取100只雄性小鼠，給予高糖高脂飼料（配方為：質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%蔗糖+ 10%豬油+ 1%膽固醇+ 79%標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料）飼喂4周。在第4周末，小鼠飼喂8 h后，按照100 mg/kg劑量一次性腹腔注射0.25% STZ（pH 4.2，0.l mol/L檸檬酸緩沖液冰浴中新鮮配置）0.2 mL，之后繼續(xù)飼喂高糖高脂飼料1周，測(cè)空腹血糖，以血糖值大于11.1 mmol／L為NIDDM建模成功[10-11]。NIDDM小鼠建模成功后，隨機(jī)取64只NIDDM小鼠分成4組（每組16只），分別是：正常對(duì)照組（NC）、模型對(duì)照組（DC）、WRP灌胃組（WT，200 mg/kg）、羅格列酮灌胃組（RT，3 mg/ kg），NC組和DC組給予dH2O，連續(xù)灌胃42 d。42 d后，小鼠斷頭處死后，取腎臟組織，- 80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3小鼠腎組織抗氧化能力及Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)檢測(cè)按試劑盒方法檢測(cè)SOD、GPx活性和MDA水平；采用免疫組化SP法測(cè)定腎組織中Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)，試驗(yàn)同時(shí)采用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。顯色結(jié)果在高倍鏡下隨機(jī)選取20個(gè)連續(xù)不重復(fù)的視野，計(jì)數(shù)每視野Bax和Bcl-2（棕黃色）陽(yáng)性細(xì)胞的百分率，取其均值表示該因子表達(dá)強(qiáng)度。所有操作嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5統(tǒng)計(jì)分析

各組試驗(yàn)數(shù)據(jù)以mean±SD表示，應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)為方差齊性，兩組間差異采用t檢驗(yàn)；多組資料采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果與分析

2.1茯苓多糖對(duì)小鼠腎組織SOD與GPx活性的影響

茯苓多糖對(duì)小鼠腎組織SOD與GPx活性的影響見(jiàn)圖1。由圖1可以看出，與NC組比較，WT組小鼠SOD活性無(wú)明顯差異（P＞0.05）；與DC組比較，其它各組（NC，WT，RT組）小鼠SOD、GPx活性均明顯升高（P＜0.05）。這表明，WRP能夠增強(qiáng)NIDDM小鼠機(jī)體腎臟組織抗氧化酶的活性，有利于自由基的清除。

圖1　茯苓多糖對(duì)小鼠腎組織SOD與GPx活性的影響Fig. 1 Effect of WRP on the SOD and GPx levels of the renal tissue in mice

2.2茯苓多糖對(duì)小鼠腎組織MDA水平的影響

茯苓多糖對(duì)小鼠腎組織MDA水平的影響見(jiàn)圖2。由圖2可以看出，與NC組比較，其它各組小鼠（DC，WT，RT組）MDA水平均明顯升高（P＜0.05）；與DC組比較，其它各組（NC，WT，RT組）小鼠MDA水平均明顯降低（P＜0.05）。這表明，WRP能夠降低NIDDM小鼠機(jī)體腎臟脂質(zhì)過(guò)氧化，保護(hù)自由基介導(dǎo)的氧化損傷。

圖2　茯苓多糖對(duì)小鼠腎組織MDA水平的影響Fig. 2　 Effect of WRP on the MDA levels of the renaltissue in mice

2.3茯苓多糖對(duì)小鼠腎組織中Bax和Bcl-2表達(dá)的影響

茯苓多糖對(duì)小鼠腎組織中Bax和Bcl-2表達(dá)的影響見(jiàn)圖3與圖4。由圖4可以看出，與DC組比較，WT組和RT組小鼠Bcl-2蛋白量明顯增加，Bax蛋白量明顯降低（P＜0.05）。與DC組比較，其它各組（NC，WT，RT組）小鼠Bax/ Bcl-2比值明顯增加，其中NC組比值最高（P＜0.05）（圖2）。這表明，WRP抑制了NIDDM小鼠Bax蛋白的過(guò)多表達(dá)。

3　討論

圖3　免疫組化SP法測(cè)定小鼠腎組織Bax和Bcl-2表達(dá)（×400）Fig. 3 Expression of Bax and Bcl-2 protein in the renal tissues in mice by Immunohistochemical SP method

前期結(jié)果已經(jīng)證實(shí)，WRP能有效的降低血糖、血清胰島素、胰高血糖素、TC、TG和LDL-C水平，增加HDL-C水平；并且WRP能提高NIDDM小鼠葡萄糖耐受力，改善糖耐量的異常。這說(shuō)明，WRP 對(duì)NIDDM小鼠具有降糖作用，同時(shí)能一定程度上改善糖尿病引起脂代謝紊亂情況。但WRP對(duì)DM糖尿病腎?。―N）的作用及其能否作為預(yù)防DN的理想藥物還有待進(jìn)一步研究。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者對(duì)DN發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了大量研究，目前主要認(rèn)為其與遺傳易感性、糖代謝紊亂及由此所致的非酶糖化、多元醇通路激活、PKC激活，脂代謝紊亂、鈣代謝紊亂、高血壓所致腎血流動(dòng)力學(xué)改變、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡及激肽系統(tǒng)激活有關(guān)。其中，氧化應(yīng)激在DN的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用已被多種研究證實(shí)。糖尿病導(dǎo)致的腎臟損傷是通過(guò)復(fù)雜交叉的通路，包括糖基終末化產(chǎn)物（AGEs）的形成、蛋白激酶C（PKC）的活化、活性氧自由基（ROS）的生成等。ROS可通過(guò)刺激轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、AGEs的過(guò)度表達(dá)和產(chǎn)生，激活PKC和絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）、介導(dǎo)AGEs激活核轉(zhuǎn)錄因子KB（NF-κB）、PKC-β1以及介導(dǎo)AGES刺激TGF-β1的轉(zhuǎn)錄等作用而參與DN細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）聚積和發(fā)展。ROS特有的化學(xué)活性可以直接氧化損害DNA蛋白脂質(zhì)和碳水化合物，在DN的發(fā)病機(jī)制中是關(guān)鍵因素[12]。Calabrese等研究證實(shí)，DN小鼠血清環(huán)磷鳥(niǎo)苷（cGMP）增加，GPx減少，腎臟組織MDA和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）水平增加[13]。MDA則常常作為反應(yīng)機(jī)體氧化應(yīng)激的一個(gè)良好指標(biāo)，MDA的量可反映機(jī)體自由基的含量和脂質(zhì)過(guò)氧化程度。SOD是以為唯一底物的酶類清除劑，能夠?qū)⑥D(zhuǎn)化為H2O2或O2，構(gòu)成抗ROS的第一道防線；GPx不但能直接清除ROS反應(yīng)生成的H2O2和LPO，還可以使維生素E、C保持在還原狀態(tài)。因此，SOD、GPx的活力可反映機(jī)體抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力。本研究結(jié)果表明，與模型對(duì)照組比較，WT組小鼠腎組織SOD與GPx活性均明顯升高；MDA水平明顯降低；這表明，DM時(shí)機(jī)體腎組織內(nèi)自由基生成增多，抗氧化防御能力下降，產(chǎn)生了高水平的氧化應(yīng)激；WRP能夠增強(qiáng)機(jī)體腎臟的抗氧化性，降低脂質(zhì)過(guò)氧化，保護(hù)自由基介導(dǎo)的氧化損傷，減輕糖尿病對(duì)腎臟的損害。

圖4　小鼠腎組織Bax和Bcl-2表達(dá)比較Fig. 4　 Comparison of expression of Bax and Bcl -2 protein in the renal tissue in mice

研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞調(diào)亡機(jī)制同樣在DN的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。細(xì)胞凋亡是一個(gè)由Caspase蛋白激酶家族介導(dǎo)的蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程。正常組織中，凋亡去除衰老細(xì)胞代之以有絲分裂產(chǎn)生的新生細(xì)胞，使組織器官維持正常從而維持自身穩(wěn)態(tài)，而細(xì)胞過(guò)早過(guò)多或過(guò)遲過(guò)少都與多種疾病的發(fā)生有關(guān)[14]。研究表明，細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致機(jī)體胰島β細(xì)胞數(shù)目逐漸減少的主要原因。調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因有兩類，包括促進(jìn)基因和抑制基因。Bcl-2基因家族是目前最受重視的調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因家族，屬于一類新的癌基因家族；Bcl-2和Bax是Bcl-2家族的兩個(gè)重要成員，Bcl-2是抑制凋亡的主要基因，而B(niǎo)ax是促凋亡基因，它們和其家族成員共同構(gòu)成了復(fù)雜的相互作用的網(wǎng)絡(luò)，調(diào)控細(xì)胞凋亡的發(fā)生，兩者比例失調(diào)則導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[15]。近期的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，Bcl-2基因的表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡具有重要作用，其高表達(dá)能明顯抑制細(xì)胞凋亡、延長(zhǎng)細(xì)胞壽命，并能對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的各種因素，如自由基、藥物、射線、高溫、強(qiáng)酸、毒素等有較明顯抵抗作用[16]。一般認(rèn)為，Bcl-2基因抑制細(xì)胞凋亡具有多種作用機(jī)制。如Can等研究認(rèn)為Bcl-2基因可能是通過(guò)阻止細(xì)胞凋亡的早期環(huán)節(jié)發(fā)揮作用的，可阻止或降低細(xì)胞皺縮，染色質(zhì)濃縮和DNA裂解的發(fā)生[17]。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)，Bax雖然自身是促凋亡基因，還能形成同源二聚體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；但其也能調(diào)節(jié)Bcl-2基因的活性，可與Bax形成異源二聚體來(lái)抑制細(xì)胞凋亡；如果Bcl-2蛋白表達(dá)量上升，就會(huì)促使Bax的同源二聚體分離而與Bcl-2形成更多的異源二聚體來(lái)抑制細(xì)胞凋亡。但Bax蛋白單獨(dú)并不足以啟動(dòng)凋亡途徑，Bax蛋白只是作為P53的下游應(yīng)答蛋白，與Bcl-2，P53共同參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[18]。Bcl-2和Bax之間的關(guān)系極為密切，Bax/Bcl-2比例越大，說(shuō)明異源二聚體的形成越多，則抑制細(xì)胞凋亡；Bax/Bcl-2比例越小，說(shuō)明同源二聚體的形成越多，則誘發(fā)細(xì)胞凋亡。因此，Bcl-2/Bax比例是抑制細(xì)胞凋亡作用最重要因素[19-20]。相關(guān)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，DM大鼠腎小管上皮細(xì)胞中由于Bcl-2表達(dá)降低，Bax表達(dá)增加，進(jìn)而導(dǎo)致增加細(xì)胞凋亡，其原因可能是DM狀態(tài)下的糖脂代謝紊亂改變了Bcl-2與Bax基因的表達(dá)[21]。作者結(jié)果表明，與模型對(duì)照組比較，WT組小鼠Bcl-2蛋白明顯增加，Bax蛋白量明顯降低。與模型對(duì)照組比較，各組小鼠Bax/ Bcl-2比值明顯增加。這表明，WRP抑制了NIDDM小鼠Bax蛋白的過(guò)表達(dá)，使DM狀態(tài)下腎組織細(xì)胞凋亡趨勢(shì)受到抑制，能對(duì)DN具有一定預(yù)防作用。

4　結(jié)語(yǔ)

WRP對(duì)NIDDM小鼠具有降糖作用，同時(shí)能一定程度上改善糖尿病引起脂代謝紊亂情況；WRP能使NIDDM小鼠腎組織中SOD、GPx水平明顯升高；MDA的水平明顯降低，增強(qiáng)機(jī)體腎臟的抗氧化性，降低脂質(zhì)過(guò)氧化，保護(hù)自由基介導(dǎo)的氧化損傷，減輕糖尿病對(duì)腎臟的損害。WRP能抑制NIDDM小鼠腎組織中bax基因過(guò)多表達(dá)，使DM狀態(tài)下腎組織細(xì)胞凋亡趨勢(shì)受到抑制，能對(duì)DN具有一定預(yù)防作用。WRP有可能作為一種潛在的抗糖尿病及其微血管并發(fā)癥藥物來(lái)發(fā)揮作用，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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Effect of Pachymaran to the Antioxidant Capacity and Bax, Bcl-2 Protein Expression of Renal Tissue in Mice with Type II Diabetes

HUANG Congliang1，2，ZHENG Jiali1，2，LI Fenglin3，GONG Jingli3
（1. Department of Food and Biological Engineering，Zhangzhou Institute of Technology，Zhangzhou 363000，China；2. Applied Technology Engineering Center of Fujian Provincial University for Deep Processing of Agricultural Products and Safety，Zhangzhou 363000，China；3. Department of Food Engineering，Jilin Agricultural Science And Technology College，Jilin 132101，China）

Abstract：The effect of polysaccharides from Wolfiporia cocos（Schw.）Ryv. & Cilbn（WRP）to the antioxidant capacity and protein Bax，Bcl-2 gene expression of renal tissues in mice with type II diabetes were studied. Non insulin dependent（type II）diabetes mellitus（NIDDM）was induced by the combination of high-carbohydrate/high-fat diet-fed and low dose of streptozotocin（STZ）. Mice were randomly assigned to four treatment groups：the control group，the NIDDM group，the group fed WRP diet and the group fed rosiglitazone diet. The antioxidant capacity and the expression of Bax and Bcl-2 in renal tissues of mice were investigated. The superoxide dismutase（SOD）and glutathione peroxidase（GPx）levels in NIDDM mice were increased while the malondialdehydebook=83,ebook=89（MDA）level was decreased after fed with WRP，which indicated that WRP could protect kidney from the damage caused by diabetes by improving the antioxidation activity of kidney，reducing lipid peroxidation and preventing free radical induced oxidative stress. WRP could restrain excessive expression of bax gene in NIDDM mice and inhibit apoptosis of renal cells，which indicated preventive of diabetic nephropathy.

Keywords：polysaccharides from Wolfiporia cocos（Schw.）Ryv. & Cilbn，type II diabetes mellitus，kidney，Bax，Bcl-2

作者簡(jiǎn)介：黃聰亮（1976—），男，福建漳州人，副教授，主要從事功能性食品研究。E-mail：huangcoliang@126.com

基金項(xiàng)目：吉林省科技發(fā)展計(jì)劃重點(diǎn)支撐項(xiàng)目（20090905）。

收稿日期：2014-08-27

中圖分類號(hào)：TS 201.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1673—1689（2016）01—0082—07