有機(jī)溶劑處理提高固定化脂肪酶活性及穩(wěn)定性

祖　昕，　杜　凱，　曹　方，　孫玉梅（大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連116034）

?

有機(jī)溶劑處理提高固定化脂肪酶活性及穩(wěn)定性

祖昕，杜凱，曹方，孫玉梅*
（大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連116034）

摘要：為提高固定化脂肪酶催化轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的活性和穩(wěn)定性，采用活性炭、硅膠G和DM-130樹(shù)脂吸附固定脂肪酶LVK-F100，并用甲醇、丙酮、丙醇、異丙醇、乙酸乙酯、正己烷以及環(huán)己烷處理濕的固定化脂肪酶。結(jié)果表明，甲醇、正己烷和環(huán)己烷處理對(duì)固定化脂肪酶有鈍化作用，而丙酮、丙醇、異丙醇和乙酸乙酯處理能顯著提高固定化脂肪酶的活性。用乙酸乙酯和異丙醇處理吸附固定的脂肪酶1 h，可使固定化脂肪酶活力分別提高1.70～2.25倍、半衰期延長(zhǎng)3.2～8.4 h、催化大豆油轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)延長(zhǎng)使用周期2～5批。異丙醇和乙酸乙酯處理還可提高固定化脂肪酶的熱穩(wěn)定性。

關(guān)鍵詞：脂肪酶；固定化；有機(jī)溶劑；活性；穩(wěn)定性

脂肪酶在工業(yè)上通常被用于催化有機(jī)媒介中的酯化或轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)。其在有機(jī)溶劑或無(wú)溶劑系統(tǒng)催化植物油酯化是制備生物柴油的環(huán)境友好工藝[1]。

酶的固定化技術(shù)解決了脂肪酶在酯化或轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)過(guò)程中易結(jié)塊、不易回收和重復(fù)利用等問(wèn)題，提高了脂肪酶的活性和穩(wěn)定性[2]。吸附法固定化酶具有操作簡(jiǎn)單、成本低、空間位阻小、在有機(jī)介質(zhì)中催化反應(yīng)時(shí)脫附量較小、保留活性高、可再生等優(yōu)點(diǎn)[3]。固定化脂肪酶在有機(jī)介質(zhì)中的催化活性明顯低于在水相介質(zhì)中的催化活性，提高固定化酶在有機(jī)介質(zhì)中的催化活性和穩(wěn)定性具有很大的研究?jī)r(jià)值。

將游離脂肪酶溶解于某些純的極性有機(jī)溶劑或含有少量極性有機(jī)溶劑的水溶液中可以明顯提高脂肪酶的催化活性和穩(wěn)定性[4-6]。采用異丙醇干燥固定化酶可明顯提高固定化酶的活性和對(duì)映體選擇性[7]。一般認(rèn)為極性有機(jī)溶劑改變了脂肪酶分子的構(gòu)象，促進(jìn)了酶與底物的結(jié)合，從而提高酶的催化性能。但以極性有機(jī)溶劑處理固定化Candida Antarctica脂肪酶，未表現(xiàn)出酶活性和穩(wěn)定性的提高[8]。

采用不同載體在水相環(huán)境中吸附固定化脂肪酶（國(guó)產(chǎn)），用純有機(jī)溶劑處理濕的固定化脂肪酶，并采用處理的脂肪酶催化大豆油轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，考察有機(jī)溶劑處理對(duì)固定化脂肪酶的催化活性和穩(wěn)定性的影響。

1　材料與方法

1.1材料

脂肪酶LVK-F100：10000 U/g，深圳市綠維康生物工程有限公司產(chǎn)品；牛血清蛋白（BSA）：美國(guó)Xiasi生物公司產(chǎn)品；硅膠G：青島裕民源硅膠試劑廠產(chǎn)品；吸水硅膠：深圳市紅葉杰科技有限公司產(chǎn)品；80-100、300-400目層析硅膠，青島裕民源硅膠試劑廠產(chǎn)品；DM-130大孔樹(shù)脂：山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司樹(shù)脂分廠產(chǎn)品；大豆油，大連日清制油有限公司產(chǎn)品；氣相色譜分析用脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)SUPELCO公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1脂肪酶的固定化將15 g酶粉溶于300 mL磷酸緩沖液（50 mmol/L KH2PO4-K2HPO4，pH 7.0），于室溫、200 r/min攪拌2 h后，于2 680 g離心10 min，得上清液。再用磷酸緩沖液稀釋上清液，制得濃度為0.05 mg/mL的脂肪酶液。分別將1 g經(jīng)預(yù)處理的活性炭、硅膠G以及DM-130樹(shù)脂加入30 mL上述酶液中，于30℃、150 r/min振蕩吸附2 h后，過(guò)濾出濕固定化酶，于4℃放置24 h。

1.2.2有機(jī)溶劑處理固定化脂肪酶取上述濕固定化酶1 g置于100 mL具塞三角瓶中，加入20 mL有機(jī)溶劑，于30℃、150 r/min振蕩處理1h，抽濾得處理過(guò)的固定化酶，于4℃放置24 h，測(cè)定脂肪酶活力。

選取作用效果較好的有機(jī)溶劑，按上述條件分別振蕩處理0.5～8 h，抽濾得處理過(guò)的固定化酶，于4℃放置24 h，測(cè)定脂肪酶活力。

1.2.3蛋白質(zhì)測(cè)定采用Bradford法[9]，使用牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.2.4固定化脂肪酶活力測(cè)定采用改進(jìn)的橄欖油乳化法[10]。向150 mL 40 g/L的聚乙二醇溶液中加入50 mL橄欖油，混合均勻制成底物乳化液。在100 mL三角瓶中加入5 mL底物乳化液和4 mL的磷酸緩沖液（50 mmol/L KH2PO4-K2HPO4，pH 7.0），于38℃預(yù)熱5 min，加入待測(cè)定的固定化脂肪酶，于38℃攪拌10 min，用10 mL體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇終止反應(yīng)。以酚酞為指示劑，用0.025 mol/L的NaOH滴定水解產(chǎn)生的脂肪酸。

酶活力定義：在38℃、pH 7.0的條件下，每分鐘水解橄欖油產(chǎn)生1 μmol脂肪酸所需的酶量為一個(gè)酶活單位（U）。

1.2.5固定化脂肪酶催化大豆油轉(zhuǎn)酯化將22.5 g大豆油、11 mL正己烷及1 g固定化脂肪酶置于250 mL具塞三角瓶中，經(jīng)30℃預(yù)熱15 min，按醇油摩爾比3∶1，從反應(yīng)開(kāi)始每8 h等摩爾加入無(wú)水甲醇3次，于150 r/min振蕩反應(yīng)24 h。將轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)液在0.1 MPa減壓蒸餾，收集140℃～200℃脂肪酸甲酯組份，進(jìn)行氣相色譜定量分析。

1.2.6大豆油的完全甲酯化取1 g大豆油置于50 mL具塞三角瓶中，加入5 %的KOH-甲醇溶液2 mL，于75℃水浴中皂化15 min，再加入14 %的三氟化硼乙醚溶液2 mL，振蕩反應(yīng)2 min，待冷卻至室溫后，加入1 mL正己烷，充分振蕩后靜置，取上清液進(jìn)行氣相色譜定量分析。

1.2.7脂肪酸甲酯測(cè)定采用山東經(jīng)緯GC8900型氣相色譜儀，PEG-20M（30 m×0.32 mm×0.35 μm）毛細(xì)管柱；柱箱溫度180℃，汽化室溫度250℃，F(xiàn)ID檢測(cè)器溫度250℃；載氣為氮?dú)猓皦?.1 MPa；氫氣流量30 mL/min，空氣流量50 mL/min；進(jìn)樣量0.4 μL，無(wú)分流。

1.2.8大豆油的脂肪酸甲酯轉(zhuǎn)化率X計(jì)算計(jì)算公式如下：

1.2.9固定化酶半衰期測(cè)定轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)結(jié)束后，用15 mL丙酮分3次洗滌固定化脂肪酶，過(guò)濾分離固定化脂肪酶，于4℃干燥24 h，測(cè)定其脂肪酶活力，根據(jù)Inverted linear decay model計(jì)算固定化酶半衰期t1/2[11-12]。

1.2.10固定化酶熱穩(wěn)定性測(cè)定將1 g固定化酶置于100 mL三角瓶，加入20 mL磷酸緩沖液（50 mmol/L KH2PO4-K2HPO4，pH 7.0），分別置于30℃～70℃水浴搖床中振蕩1 h，反應(yīng)結(jié)束后，過(guò)濾分離固定化脂肪酶，于4℃放置24 h，測(cè)定其脂肪酶活力。

2　結(jié)果與討論

2.1不同有機(jī)溶劑處理對(duì)固定化脂肪酶活力的影響

以40目活性炭、硅膠G以及DM-130樹(shù)脂吸附固定脂肪酶，再用不同有機(jī)溶劑處理固定化脂肪酶，處理前后的固定化脂肪酶相對(duì)酶活見(jiàn)表1。

表1　不同有機(jī)溶劑處理的固定化脂肪酶相對(duì)酶活Table 1 Relative activities of immobilized lipases treated by various organic solvents

由表1可知，甲醇、正己烷和環(huán)己烷對(duì)固定化脂肪酶有鈍化作用，而丙酮、丙醇、異丙醇、乙酸乙酯明顯提高了固定化脂肪酶的活性，對(duì)硅膠G和DM-130樹(shù)脂吸附固定脂肪酶的處理效果較好。

水因直接或間接參與所有的非共價(jià)相互作用而維持脂肪酶催化部位的構(gòu)象[13-14]。丙酮、丙醇、異丙醇、乙酸乙酯的極性較大，與水的親和作用較大，能吸收濕固定化脂肪酶結(jié)構(gòu)中的多余水分，激活脂肪酶分子上某些處于關(guān)閉狀態(tài)的活性部位，改變脂肪酶的分子構(gòu)象，促進(jìn)酶與底物的結(jié)合[15]，而且有利于固定化酶的干燥。用具有較大極性的甲醇處理后的脂肪酶活力降低很多。而正己烷和環(huán)己烷的極性較小，與固定化脂肪酶結(jié)構(gòu)中的水親和作用較小，使固定化脂肪酶結(jié)構(gòu)中的水較多殘留，從而降低脂肪酶催化活性[16-17]。因此，有機(jī)溶劑對(duì)固定化脂肪酶的作用與溶劑極性強(qiáng)弱及其相關(guān)基團(tuán)有關(guān)。

有機(jī)溶劑對(duì)固定化脂肪酶的作用還與溶劑分子的結(jié)構(gòu)以及酶在載體上的吸附狀態(tài)有關(guān)。Wu等[15]采用極性相同的辛烷和異辛烷處理表面包被的脂肪酶，發(fā)現(xiàn)辛烷和異辛烷對(duì)固定化脂肪酶均有鈍化作用，且辛烷的鈍化作用明顯高于異辛烷。Park等[1]證明了固定化脂肪酶的多層包被或皺褶結(jié)構(gòu)會(huì)形成空間位阻，阻礙底物與脂肪酶的接觸以及反應(yīng)產(chǎn)物的擴(kuò)散，也會(huì)阻礙有機(jī)溶劑與脂肪酶分子的接觸，降低極性溶劑的激活作用。

2.2有機(jī)溶劑處理時(shí)間對(duì)固定脂肪酶活力的影響

用乙酸乙酯處理活性炭吸附固定的脂肪酶，用異丙醇處理硅膠G、DM-130樹(shù)脂吸附固定的脂肪酶，經(jīng)處理不同時(shí)間的固定化脂肪酶相對(duì)酶活力如圖1所示。

圖1　不同有機(jī)溶劑處理時(shí)間的固定化脂肪酶相對(duì)酶活力Fig. 1 Relative activities of immobilized lipases treated by organic solvents for various time

由圖1可知，乙酸乙酯處理活性炭吸附固定脂肪酶以及異丙醇處理硅膠G、DM-130樹(shù)脂吸附固定脂肪酶的適宜時(shí)間均為1 h，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活力不斷下降。乙酸乙酯和異丙醇與固定化脂肪酶結(jié)構(gòu)中的水親和作用較大，雖然適當(dāng)浸泡能吸收濕固定化脂肪酶結(jié)構(gòu)中多余的水分，有利于穩(wěn)定固定化脂肪酶分子構(gòu)象和減少固定化脂肪酶結(jié)構(gòu)中的非必需水，但較長(zhǎng)時(shí)間浸泡會(huì)延長(zhǎng)溶劑與其中水的親和作用時(shí)間，剝奪固定化脂肪酶的必需水，破壞了脂肪酶的分子構(gòu)象，導(dǎo)致部分脂肪酶變性失活。已有研究表明適量的極性有機(jī)溶劑處理對(duì)載體吸附酶量沒(méi)有影響[18]。

2.3有機(jī)溶劑處理對(duì)固定化脂肪酶熱穩(wěn)定性的影響

用乙酸乙酯處理活性炭吸附固定的脂肪酶1 h，用異丙醇處理硅膠G、DM-130樹(shù)脂吸附固定的脂肪酶1 h，經(jīng)有機(jī)溶劑處理與未經(jīng)處理的固定化脂肪酶在不同溫度下的相對(duì)酶活力如圖2所示。

與未經(jīng)有機(jī)溶劑處理的固定化脂肪酶相比，經(jīng)乙酸乙酯處理的活性炭吸附固定脂肪酶和經(jīng)異丙醇處理的硅膠G吸附固定脂肪酶在各溫度下的酶活力均較高，說(shuō)明極性有機(jī)溶劑處理能提高固定化脂肪酶的熱穩(wěn)定性。但經(jīng)異丙醇處理的硅膠G吸附固定的脂肪酶比經(jīng)乙酸乙酯處理的活性炭吸附固定的脂肪酶具有更好的高溫穩(wěn)定性，這與活性炭孔隙較大，被吸附固定的酶呈片層堆積有關(guān)[19]。

圖2　經(jīng)有機(jī)溶劑處理的固定化脂肪酶熱穩(wěn)定性Fig. 2 Thermal stability of immobilized lipases treated by organic solvents

2.4有機(jī)溶劑處理對(duì)固定化脂肪酶半衰期的影響

用乙酸乙酯處理活性炭吸附固定的脂肪酶1 h，用異丙醇處理硅膠G、DM-130樹(shù)脂吸附固定的脂肪酶1h，經(jīng)有機(jī)溶劑處理與未經(jīng)處理的固定化脂肪酶半衰期如圖3所示。

圖3　經(jīng)有機(jī)溶劑處理的固定化脂肪酶半衰期Fig. 3　 Half -lives of immobilized lipases treated by organic solvents

由圖3可知，與未經(jīng)有機(jī)溶劑處理的相應(yīng)固定化脂肪酶相比，經(jīng)乙酸乙酯處理的活性炭吸附固定脂肪酶半衰期延長(zhǎng)6.6 h，是未處理對(duì)照的1.1倍，經(jīng)異丙醇處理的硅膠G吸附固定脂肪酶的半衰期延長(zhǎng)8.4 h，是未處理對(duì)照的1.1倍，經(jīng)異丙醇處理的MD-130樹(shù)脂吸附固定脂肪酶半衰期延長(zhǎng)3.2 h，是未處理對(duì)照的1.04倍?？梢?jiàn)，極性有機(jī)溶劑處理能有效延長(zhǎng)固定化酶的半衰期。一般認(rèn)為，酶活力下降的主要原因是反應(yīng)過(guò)程中酶分子活性部位的鈍化和酶蛋白結(jié)構(gòu)的變性失活，但酶蛋白結(jié)構(gòu)改變并不一定導(dǎo)致酶活力下降[20]。適量的極性有機(jī)溶劑處理雖然改變了酶分子的部分結(jié)構(gòu)，但卻增強(qiáng)了脂肪酶的催化活性，并且穩(wěn)定了酶分子的構(gòu)象，延長(zhǎng)了半衰期。硅膠G具有極性，對(duì)極性有機(jī)溶劑也有較強(qiáng)吸附作用，能促使極性有機(jī)溶劑進(jìn)入到包被或載體結(jié)構(gòu)的內(nèi)部[19]，對(duì)脂肪酶的激活或穩(wěn)定作用效果更明顯。

2.5有機(jī)溶劑處理對(duì)固定化脂肪酶操作穩(wěn)定性的影響

用乙酸乙酯處理活性炭吸附固定的脂肪酶1 h，用異丙醇處理硅膠G、DM-130樹(shù)脂吸附固定的脂肪酶1 h，經(jīng)有機(jī)溶劑處理與未經(jīng)處理的固定化脂肪酶重復(fù)應(yīng)用于催化大豆油轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的酯轉(zhuǎn)化率如圖4所示。

由圖4可見(jiàn)，在酯轉(zhuǎn)化率不低于50%的情況下，與未經(jīng)有機(jī)溶劑處理的相應(yīng)固定化脂肪酶相比，經(jīng)乙酸乙酯處理的活性炭吸附固定脂肪酶多用5批次，是未處理對(duì)照的1.6倍，經(jīng)異丙醇處理的硅膠G吸附固定脂肪酶多用3批次，是未處理對(duì)照的1.3倍，經(jīng)異丙醇處理的MD-130樹(shù)脂吸附固定脂肪酶多用2批次，是未處理對(duì)照的1.2倍。可見(jiàn)，極性有機(jī)溶劑處理能有效延長(zhǎng)固定化脂肪酶催化大豆油轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的使用壽命。經(jīng)極性有機(jī)溶劑處理，增強(qiáng)了固定化脂肪酶對(duì)正己烷和甲醇的耐受性，從而增強(qiáng)其在大豆油、正己烷和甲醇反應(yīng)環(huán)境中催化轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的穩(wěn)定性。經(jīng)乙酸乙酯處理的活性炭吸附固定脂肪酶的使用壽命明顯高，是活性炭結(jié)構(gòu)、吸附固定脂肪酶的方式和狀態(tài)以及乙酸乙酯的處理效果使然。

圖4　經(jīng)有機(jī)溶劑處理的固定化脂肪酶的循環(huán)利用效果Fig. 4　 Recycling use of immobilized lipases with treatment in polar organic solvents

3　結(jié)語(yǔ)

有機(jī)溶劑對(duì)固定化脂肪酶LVK-F100的作用與溶劑極性強(qiáng)弱及其相關(guān)基團(tuán)以及酶在載體上的吸附狀態(tài)有關(guān)，較強(qiáng)極性的丙酮、丙醇、異丙醇、乙酸乙酯明顯提高了固定化脂肪酶的活性，對(duì)硅膠G 和DM-130樹(shù)脂吸附固定脂肪酶的處理效果普遍較好。而甲醇、正己烷和環(huán)己烷對(duì)固定化脂肪酶有鈍化作用。

綜合評(píng)價(jià)，用乙酸乙酯處理活性炭吸附固定的脂肪酶以及用異丙醇處理硅膠G吸附固定的脂肪酶，在酶活性、熱穩(wěn)定性、半衰期以及催化大豆油轉(zhuǎn)酯化使用壽命方面均有較明顯的改善作用。而硅膠G吸附固定的脂肪酶比活性炭吸附固定的脂肪酶具有更好的高溫穩(wěn)定性。經(jīng)乙酸乙酯處理的活性炭吸附固定脂肪酶的使用壽命明顯高。從而增加了固定化脂肪酶應(yīng)用的可能性并降低其催化反應(yīng)的成本。

參考文獻(xiàn)：

[1]Park E Y，Sato M，Kojima S. Fatty acid methyl ester production using lipase-immobilizing silica particles with different particle sizes and different specific surface areas[J]. Enzyme and Microbial Technology，2006，39：889-896.

[2]蔡志強(qiáng)，楊廣花，趙希岳，等.固定化酶催化高酸廢油脂合成生物柴油的研究[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2008，23（4）：160-162. CAI Zhiqiang，YANG Guanghua，ZHAO Xiyue，et al. Synthesis of biodiesel fuel from waste oil with high acid value catalyzed by imobilized lipase[J]. Journal of the Chinese Cereals and Oils Association，2008，23（4）：160-162.（in Chinese）

[3]何延青，劉俊良，楊平，等.微生物固定化技術(shù)與載體結(jié)構(gòu)的研究[J].環(huán)境科學(xué)，2004，25（S1）：101-104. HE Yanqing，LIU Junliang，YANG Ping，et al. Immobilization technology and construction of carrier[J]. Environmental Science，2004，25（S1）：101-104.（in Chinese）

[4]Kim M G，Lee E G，Chung B H. Improved enantioselectivity of Candida rugosa lipase towards ketoprofen ethyl ester by a simple two-step treatment[J]. Process Biochemistry，2000，35：977-982.

[5]Matsumoto M，Kida K，Kondo K. Enhanced activities of lipase pretreated with organic solvents[J]. Journal of Chemical Technology and Biotechnology，2001，76（10）：1070-1073.

[6]Chamorro S，Alcantara A R，Casa R M，et al. Small water amounts increase the catalytic behaviour of polar organic solvents pre-treated Candida rugosa lipase[J]. Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2001，11：939-947.

[7]Chang C S，Hsu C S. Enhancement of enantioselectivity on reaction rate of the synthesis of（S）-ketoprofen hydroxyalkyl ester in organic solvents via isopropanol-dried immobilized lipase[J]. Journal of Chemical Technology and Biotechnology，2005，80 （5）：537-544.

[8]Wu J C，Lee S S，Mahmood M M B，et al. Enhanced activity and stability of immobilized lipases by treatment with polar solvents prior to lyophilization[J]. Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2007，45：108-112.

[9]Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry，1976，72：248-254.

[10]江慧芳，王雅琴，劉春國(guó).三種脂肪酶活力測(cè)定方法的比較及改進(jìn)[J].化學(xué)與生物工程，2007，24（8）：72-75. JIANG Huifang，WANG Yaqin，LIU Chunguo. Comparison and improvement of three determination methods for lipase activity[J]. Chemistry & Bioengineering，2007，24（8）：72-75.（in Chinese）

[11]Cardoso J P，Emery A N. A new model to describe enzyme inactivation[J]. Biotechnology and Bioengineering，1978，20（9）：1471-1477.

[12]Bruno L M，Lima-Filho J L，Castro H F. Comparative performance of microbial lipases immobilized on magnetic polysiloxane polyvinyl alcohol particles[J]. Brazilian Archives of Biology and Technology，2008，51（5）：889-896.

[13]Goldberg M，Thomas D，Legoy M D. The control of lipase catalysed transesterification and esterification reaction rates. Effects of substrate polarity，water activity and water molecules on enzyme activity[J]. Eur J Biochem，1990，190：603-609.

[14]Yahya A R M，Anderson W A，Moo-Young M. Ester synthesis in lipase catalyzed reactions[J]. Enzyme Microb Technol，1998，23：438-450.

[15]Wu J C，Song B D，Xing A H，et al. Esterification reactions catalyzed by surfactant-coated Candida rugosa lipase in organic solvents[J]. Process Biochemistry，2002，37：1229-1233.

[16]Jacques S L. Lipase-catalyzed esterification of terpene alcohols in a solventfree medium[D]. Waterloo：University of Waterloo，1993.

[17]Basheer S，Mogi K，Nakajima M. Surfactant-modified lipase for the catalysis of the interesterification of triglycerides and fatty acids[J]. Biotechnol Bioeng，1995，45（3）：187-195.

[18]Goto M，Ogawa H，Isobe T，et al. 2-Propanol treatment of Candida rugosa lipase and its hydrolytic activity[J]. Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2003，24-25：67-73.

[19]杜凱.固定化催化劑催化植物油轉(zhuǎn)酯化[D].大連：大連工業(yè)大學(xué)，2010.

[20]Invernizzi G，Casiraghi L，Grandori R，et al. Deactivation and unfolding are uncoupled in a bacterial lipase exposed to heat，low pH and organic solvents[J]. Journal of Biotechnology，2009，141（1-2）：42-46.

Treatment of Organic Solvents to Improve Activity and Stability of Immobilized Lipases

ZU Xin，DU Kai，CAO Fang，SUN Yumei*
（School of Biological Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，China）

Abstract：The lipases immobilized on active carbon，silica gel G or DM-130 macro porous resin by adsorption were steeped in various organic solvents to improve the activity and stability for catalyzing transesterification. It was found that the activities of immobilized lipases could be increased with acetone，1-propanol，2-propanol and ethyl acetate，but could be deactivated with methanol，n-hexane and cyclohexane. Compared with the immobilized lipases dried directly after adsorption，the immobilized lipases treated in 2-propanol or ethyl acetate for 1 h displayed 1.70 to 2.25 times enzyme activities，their half-lives were prolonged 3.2 to 8.4 h and the operation lives were increased 2 to 5 batches for soybean oil transesterification. The thermal stability of the immobilized lipases could also be enhanced by the treatment with 2-propanol or ethyl acetate.

Keywords：lipase，immobilization，organic solvent，activity，stability

*通信作者：孫玉梅（1962—），女，吉林吉林人，教授，主要從事微生物代謝控制發(fā)酵研究。E-mail：sunyumei62@163.com

基金項(xiàng)目：遼寧省教育廳創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（LT2011008）；遼寧省科技廳遼寧省發(fā)酵工業(yè)產(chǎn)品工程技術(shù)研究中心項(xiàng)目（遼科發(fā)200923）。

收稿日期：2014-11-24

中圖分類(lèi)號(hào)：Q 814

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1673—1689（2016）01—0089—06