米曲霉酸性蛋白酶Ap的結(jié)構(gòu)分析

柯　野，　李嘉盛，　曾松榮，　朱兆靜，　黃小惠（韶關(guān)學(xué)院英東生命科學(xué)學(xué)院，廣東韶關(guān)512005）

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米曲霉酸性蛋白酶Ap的結(jié)構(gòu)分析

柯野，李嘉盛，曾松榮，朱兆靜，黃小惠
（韶關(guān)學(xué)院英東生命科學(xué)學(xué)院，廣東韶關(guān)512005）

摘要：米曲霉（Aspergillus oryzae）酸性蛋白酶與部分商品化的蛋白酶相比，具有對(duì)大豆蛋白水解效率高且水解產(chǎn)物苦味弱的特性。作者采用RT-PCR技術(shù)克隆獲得酸性蛋白酶（Ap）基因，結(jié)合生物信息學(xué)手段，對(duì)Ap進(jìn)行分析與預(yù)測(cè)。結(jié)果表明：Ap基因?qū)γ艽a子使用頻率具有偏好性，特別是第3位密碼子對(duì)GC堿基的使用頻率高，達(dá)到74%；編碼404個(gè)氨基酸殘基。Ap屬于胞外天冬氨酸蛋白酶。以海棗曲霉（A. phoenicis）的酸性蛋白酶（PDB code：1IBQ）作為模板同源建模結(jié)果可知，Ap分子至少能與2個(gè)Zn2+結(jié)合，內(nèi)含1個(gè)二硫鍵、163個(gè)氫鍵、35個(gè)鹽堿。該酶與1IBQ相比空間結(jié)構(gòu)總體相似，部分重要位點(diǎn)（如flap環(huán)、轉(zhuǎn)角和ψ-loops）的氨基酸殘基較為保守。

關(guān)鍵詞：米曲霉；酸性蛋白酶；結(jié)構(gòu)分析

蛋白酶是一類(lèi)重要的工業(yè)酶，占整個(gè)酶制劑總量的60%以上，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、皮革、食品和化工等多種行業(yè)[1]。目前商品化的蛋白酶制劑主要來(lái)源于細(xì)菌和植物；而霉菌源蛋白酶主要來(lái)自于毛霉和曲霉，且商品化相對(duì)較少。霉菌蛋白酶對(duì)植物蛋白的水解效率高、無(wú)苦味，水解產(chǎn)物具有多種生理活性，具有其他商品化蛋白酶無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)而日趨受到關(guān)注[2]。

米曲霉（Aspergillus oryzae）是生物技術(shù)中重要的一種曲霉。該菌廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)的酒類(lèi)、醬油和豆醬等食品發(fā)酵工業(yè)；主要是由于米曲霉能產(chǎn)生多種蛋白酶，這些蛋白酶對(duì)大豆蛋白的水解效率高、水解產(chǎn)物苦味少以及對(duì)獨(dú)特風(fēng)味起關(guān)鍵作用[1，3]，對(duì)提高食品發(fā)酵行業(yè)原料蛋白質(zhì)的氨基酸態(tài)氮轉(zhuǎn)化率和利用率起重要作用；因此，米曲霉蛋白酶受到科研工作者的普遍關(guān)注。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究主要集中于利用傳統(tǒng)的育種手段和優(yōu)化發(fā)酵條件方式來(lái)提高米曲霉的產(chǎn)蛋白酶量；或分離純化蛋白酶，對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)方面的研究[4]。對(duì)于蛋白酶的分子生物學(xué)方面的研究，主要體現(xiàn)在對(duì)米曲霉全基因組的測(cè)序；據(jù)2007年全基因組的測(cè)序結(jié)果預(yù)測(cè)可知，該菌一共編碼134個(gè)蛋白酶，其中65個(gè)內(nèi)肽酶、69個(gè)外肽酶，只有少數(shù)幾個(gè)蛋白酶的功能與性質(zhì)有所掌握，而絕大多數(shù)蛋白酶的結(jié)構(gòu)與功能方面的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，作者根據(jù)Genbank中報(bào)道的米曲霉酸性蛋白酶（Ap）的基因序列，對(duì)該基因進(jìn)行RTPCR克隆及測(cè)序；利用生物信息學(xué)對(duì)該基因及其推導(dǎo)編碼的酶學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)與功能等方面進(jìn)行分析，以期對(duì)該酶的結(jié)構(gòu)功能、外源表達(dá)和定向改造等方面的研究提供參考。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1菌株米曲霉（A. oryzae）：購(gòu)自上海迪發(fā)釀造生物制品有限公司。

1.1.2工具酶和試劑PCR擴(kuò)增引物：購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；RT-PCR試劑：購(gòu)自寶生物（大連）有限公司；Trizol試劑：購(gòu)自Invitrogen公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1米曲霉的培養(yǎng)在麩皮固體培養(yǎng)基平板上先鋪上滅菌后的玻璃紙，然后接種米曲霉，25.0℃培養(yǎng)48 h后收集菌絲體。麩皮培養(yǎng)基成分的具體組成如下（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：0.74% KH2PO4，0.06% FeSO4· 7H2O，1.56%蛋白胨，0.23%麥芽糖，96.41%麩皮，培養(yǎng)基初始含水量為1.0～1.5 mL/g。

1.2.2 RNA的提取將收集的菌絲體浸泡在液氮中進(jìn)行研磨至粉末，根據(jù)Trizol試劑盒的操作手冊(cè)提取并鑒定總RNA質(zhì)量，將提取的總RNA放置于-70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 cDNA的合成利用寶生物（大連）有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照試劑盒的操作手冊(cè)，對(duì)RNA反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。

1.2.4 Ap基因的克隆由Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道的米曲霉Ap基因序列（登錄號(hào)：XM_001824123），利用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)引物，上游引物：5’-CTATGGTTATCTTGAGCAAAG-3’，下游引物：5’-ATTAGTCAGGCATTTAAG-3’，以1.2.3的cDNA作為模板，采用上下游引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性15 s，50℃退火15 s，72℃延伸2.5 min，30個(gè)循環(huán)；然后72℃保溫5 min。電泳鑒定PCR產(chǎn)物，對(duì)PCR產(chǎn)物回收加A后，克隆至載體pMD18-T上，化轉(zhuǎn)于大腸桿菌DH5α菌株中，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子測(cè)序確認(rèn)。

1.2.5 Ap基因的分析利用Bio-Edit 7.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)，http：//www.expasy.org/中的部分程序?qū)γ感蛄械墓δ芪稽c(diǎn)進(jìn)行初步分析，http：//www.cbs. dtu.dk/services /TargetP/的信號(hào)肽分析，http：// swissmodel.expasy.org/進(jìn)行空間結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，http：// swift.cmbi.ru.nl/ servers/html/分析拉曼圖對(duì)結(jié)構(gòu)合理性的評(píng)價(jià)，Swiss -Pdb Viewer 4.0.3和Discovery studio 2.5等軟件進(jìn)行酶空間的比對(duì)分析，http：// swift.cmbi.ru.nl/servers/html/的程序?qū)γ傅臍滏I數(shù)、鹽鍵數(shù)和溶劑可及表面積等方面的預(yù)測(cè)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1米曲霉的總RNA提取及Ap基因全長(zhǎng)cDNA的克隆結(jié)果

米曲霉的總RNA提取結(jié)果見(jiàn)圖1。圖1可見(jiàn)，28s rRNA和18s rRNA條帶清晰可見(jiàn)，28s rRNA的寬度和亮度分別約為18s rRNA亮度的1倍和2倍，且RNA未見(jiàn)明顯降解；該結(jié)果表明提取的RNA質(zhì)量較高，達(dá)到RT-PCR的質(zhì)量要求。

利用Ap基因的引物和以cDNA為模板，獲得預(yù)期的PCR產(chǎn)物（見(jiàn)圖2）。該P(yáng)CR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果表明，Ap核苷酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)報(bào)道的同源性達(dá)到99 %以上，僅核苷酸T981突變?yōu)镃；而相應(yīng)的氨基酸殘基未突變。利用http：//www.kazusa.or.jp/ codon/對(duì)A. oryzae的12 388條CDS序列的密碼子使用頻率分析可知，該菌對(duì)密碼子使用存在偏好性，即第1位、第2位和第3位的密碼子GC使用頻率分別為56.53 %、43.87 %和55.88 %；對(duì)Ap基因而言，第1位、第2位和第3位的密碼子GC使用頻率分別為58.0%、46.0%和74.0%。在一般情況下，密碼子在同一生物存在相似的密碼子偏好性；該結(jié)果也表明Ap基因的密碼子使用偏好性與米曲霉中基因密碼子使用偏好性較一致。

2.2 Ap的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析

Ap是由404個(gè)氨基酸殘基組成，其中Met和Cys殘基數(shù)最少（2個(gè)），Gly殘基數(shù)最多（44個(gè)）。G、S、T、C、Y、N和Q極性氨基酸為162個(gè)，A、V、L、I、F、W、M和P非極性氨基酸殘基數(shù)為167個(gè)；該結(jié)果表明極性和非極性氨基酸殘基的含量較一致。氨基酸殘基序列中1-20氨基酸序列為信號(hào)肽，21-78氨基酸序列為前導(dǎo)肽，79-404氨基酸序列為成熟肽；成熟肽的理論等電點(diǎn)為4.03，該酶屬于胞外的天冬氨酸蛋白酶。利用http：//www.expasy.org/prosite對(duì)活性位點(diǎn)的預(yù)測(cè)可知，Ap的活性位點(diǎn)殘基為D111和D293。

圖1　米曲霉的總RNA瓊脂糖凝膠電泳Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of isolated RNA from A. oryzae

圖2　Ap基因的PCR產(chǎn)物電泳Fig. 2 Electrophoresis of PCR products of Ap gene

2.3 Ap的同源建模及二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

用Ap的成熟肽序列（即Ap全長(zhǎng)氨基酸序列的第79-404肽鏈）與海棗曲霉（A. phoenicis）酸性蛋白酶的序列（該序列是PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.rcsb. org/pdb/home/home.do）中提供的成熟蛋白酶晶體結(jié)構(gòu)的全長(zhǎng)氨基酸序列，該酶晶體結(jié)構(gòu)的編號(hào)為1IBQ）同源性達(dá)到73.375%，（見(jiàn)圖3）；據(jù)序列同源性達(dá)到30%以上可以進(jìn)行同源建模的原則，這表明1IBQ可以作為Ap的模板進(jìn)行同源建模。模擬的Ap結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖4，利用Ramachandran對(duì)該模型分析，結(jié)果表明其主鏈ψ和φ角均在合理范圍之內(nèi)，這表明構(gòu)建的3-D結(jié)構(gòu)合理。

圖3　Ap與海棗曲霉酸性蛋白酶（PDB code：1IBQ：B）的序列比對(duì)及二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Fig. 3 Comparison of sequences and secondary structures of Ap and acid protease（PDB code：1IBQ.B）from A. phoenicis

圖4　Ap的3-D結(jié)構(gòu)模型Fig. 4 Overall 3-D structure model of Ap

由圖4可見(jiàn)，Ap是由兩個(gè)明顯的C-端和N-端結(jié)構(gòu)域的β-barrel構(gòu)成。N-端結(jié)構(gòu)域和C-端結(jié)構(gòu)域中均分別包含3個(gè)β折疊，即1N、2N、3N、1C、2C 和3C；N-端結(jié)構(gòu)域與C-端結(jié)構(gòu)域是由6個(gè)β折疊鏈連接在一起，并且兩結(jié)構(gòu)域之間形成的cleft是底物結(jié)合區(qū)域[5]，此外Ap中還包含3個(gè)310-螺旋和5 個(gè)α螺旋?；钚晕稽c(diǎn)殘基D33（根據(jù)Ap的成熟肽序列編號(hào)，下同）和D215分別位于N-端結(jié)構(gòu)域與C-端結(jié)構(gòu)域上。由Y75-G78殘基片段形成的β發(fā)夾結(jié)構(gòu)為flap結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)保護(hù)活性殘基免受溶劑的攻擊[6]。Ap與模板1IBQ的結(jié)構(gòu)比較可知，雖然這兩種蛋白酶的結(jié)構(gòu)大體相似，但是部分二級(jí)結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)短和連接二級(jí)結(jié)構(gòu)間的loop環(huán)等方面的殘基具有差異，這些差異可能是導(dǎo)致兩種酶性質(zhì)不同的原因之一[7]。

2.4 Ap保守殘基的分析

通過(guò)對(duì)多種蛋白酶（如PDB code：1IBQ、3APP、4APE和2APR等）的分析可知：在這些酶中，部分位點(diǎn)的氨基酸非常保守，且這些位點(diǎn)主要位于N-端結(jié)構(gòu)域，少數(shù)位于C-端結(jié)構(gòu)域；如24、35、76、78、83、120、123、168、177、217和302位點(diǎn)均是G，該G對(duì)酶二級(jí)結(jié)構(gòu)中的轉(zhuǎn)角構(gòu)象起重要作用。33-35片段和215-217片段形成保守的活性位點(diǎn)“DTG”Motif結(jié)構(gòu)；在酶的空間結(jié)構(gòu)中，T34和T216殘基的側(cè)鏈羥基分別與對(duì)面活性位點(diǎn)“DTG”Motif結(jié)構(gòu)中活性殘基D的上一個(gè)殘基主鏈上的N或O形成氫鍵，因此，該氫鍵鏈接兩個(gè)ψ-loops環(huán)，維持和穩(wěn)定活性位點(diǎn)區(qū)域的局部結(jié)構(gòu)具有重要作用，該結(jié)構(gòu)被稱(chēng)為“fireman’s grip”結(jié)構(gòu)[6]。Y17、W40、S60、Y75、D88、Q100和A323等位點(diǎn)較為保守，這些殘基間通過(guò)氫鍵作用連接或調(diào)控相鄰的loop環(huán)或鏈，具有維持局部結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用，如N-端結(jié)構(gòu)域β鏈上的Y17側(cè)鏈上的H與鄰近β鏈上K158主鏈上的羰基O形成了氫鍵，這個(gè)氫鍵維持兩個(gè)β鏈間的穩(wěn)定性起到重要作用。

2.5 Ap中Zn2+和二硫鍵分析

Zn2+離子在較多的酶中具有催化或維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用[8]。對(duì)于1IBQ而言，該酶結(jié)合了4個(gè)Zn2+結(jié)合（見(jiàn)圖5）；其中2個(gè)Zn2+（即Zn1和Zn2）位于酶分子的內(nèi)部，另外2個(gè)Zn2+（即Zn3和Zn4）位于酶分子表面，該兩個(gè)Zn2+調(diào)控對(duì)稱(chēng)的兩個(gè)酶分子間的接觸。對(duì)于Zn1而言，Zn2+位于1IBQ結(jié)構(gòu)中的H28、D55和D119殘基之間，并且Zn2+與D55側(cè)鏈上的O結(jié)合；在Ap中，D55和D119的殘基均保守，N28殘基的側(cè)鏈基團(tuán)比1IBQ中的H殘基的側(cè)鏈基團(tuán)小，占用的空間位置也就相應(yīng)的減少，因此在該空間中能容納Zn2+，Ap在Zn1位點(diǎn)能夠結(jié)合Zn2+（見(jiàn)圖5 b）。對(duì)于Zn2而言，Zn2+位于模板1IBQ的活性殘基D33和D215間，Zn2+與D214側(cè)鏈上的O結(jié)合；在Ap中，活性位點(diǎn)D32和D215殘基為保守殘基，空間大小和距離均與1IBQ一致，這表明Ap在Zn2位點(diǎn)能結(jié)合Zn2+。對(duì)于Zn3而言，Zn2+位于1IBQ 的D149與Ser2之間，且Zn2+與D149的殘基側(cè)鏈相結(jié)合；對(duì)于Ap，在位點(diǎn)1具有S殘基，但空間結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)中未含S1殘基，因此無(wú)法判斷是否結(jié)合Zn2+。對(duì)于Zn4而言，Zn2+位于1IBQ的E233位點(diǎn)；在Ap中為K殘基，K殘基的側(cè)鏈基團(tuán)比E長(zhǎng)，占據(jù)了Zn2+空間，因此Ap可能Zn4位點(diǎn)無(wú)Zn2+結(jié)合。

在一般情況下，二硫鍵利于酶的熱穩(wěn)定性與結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[9]。在1IBQ中C251和C281殘基間形成二硫鍵；在Ap中該2位點(diǎn)也有C殘基，且其與1IBQ的空間結(jié)構(gòu)一致，因此Ap中該2個(gè)C之間形成一個(gè)二硫鍵。

2.6 Ap氫鍵和鹽鍵的分析

酶中的氫鍵對(duì)酶整體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性具有極其重要的作用；相對(duì)而言，鹽鍵更有助于局部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[10]。利用http：//swift.cmbi.ru.nl/servers/html/中的Optimal Hydrogen Bonding Network算法可知，1IBQ B的氫鍵數(shù)為164個(gè)，Ap為163個(gè)。1個(gè)鹽鍵的定義：以相距為7.0?以?xún)?nèi)且?guī)喾措姾傻?個(gè)殘基之間可形成1個(gè)鹽鍵，H殘基定義為帶正電荷；因此，1IBQ B的鹽鍵數(shù)為41個(gè)，Ap為35個(gè)；在這些鹽鍵中，大部分位點(diǎn)的鹽鍵較保守，對(duì)酶的穩(wěn)定性起重要的作用，如位于N端結(jié)構(gòu)域的D14殘基和位于C端結(jié)構(gòu)域的K307殘基間形成1個(gè)鹽鍵，該鹽鍵對(duì)兩結(jié)構(gòu)域間的相對(duì)穩(wěn)定性起到一定的作用。由上可知，兩種酶間的氫鍵和鹽鍵的位置與數(shù)量具有一定的差異，這種差異可能是導(dǎo)致兩種酶穩(wěn)定性不同的原因之一。

圖5　Ap與海棗曲霉酸性蛋白酶的Zn2+結(jié)合位點(diǎn)分析Fig. 5 Analysis of the zinc binding sites of Ap and acid protease（PDB code：1IBQ.B）from A. phoenicis

2.7 Ap活性位點(diǎn)的溶劑可及表面積的分析

天冬氨酸蛋白酶的催化機(jī)制是：利用一個(gè)活性催化殘基D側(cè)鏈的O原子和溶液中的H2O結(jié)合后激活H2O分子，激活后的H2O對(duì)底物肽鏈骨架中羰基的C原子進(jìn)行親核攻擊，另一個(gè)催化殘基D對(duì)底物的質(zhì)子化導(dǎo)致底物肽鏈的切斷[11]。溶劑可及表面積表明酶與底物和H2O等的接觸情況，對(duì)酶的催化效率和催化環(huán)境的適應(yīng)性等方面具有重要的影響[12]。對(duì)兩種酶的活性位點(diǎn)殘基的溶劑可及表面積計(jì)算可知：兩種酶活性位點(diǎn)殘基主鏈的溶劑可及表面積均為0；而側(cè)鏈的溶劑可及表面積的差異較大，Ap的活性位點(diǎn)殘基的側(cè)鏈溶劑可及表面積均高于1IBQ，這就表明Ap的側(cè)鏈基團(tuán)更易與H2O結(jié)合，可能更利于親核攻擊，提高酶的催化活性。

2.8 Ap底物結(jié)合區(qū)域的ψ-loop結(jié)構(gòu)分析

酶的底物結(jié)合區(qū)域與底物結(jié)合后，才能對(duì)底物進(jìn)行水解切割；因此，底物結(jié)合區(qū)域?qū)γ傅碾逆I選擇性、水解特性和水解效率等方面起關(guān)鍵性的作用[13]。由圖3-4可知，兩個(gè)靈活的ψ-loops分別均是Ap和1IBQ B的底物結(jié)合區(qū)域S1’-S2的重要組成部分；這兩個(gè)ψ-loops均位于酶的1C區(qū)域，每個(gè)ψloop均包含2個(gè)β鏈。一個(gè)ψ-loop稱(chēng)為ψin環(huán)，主要由211-223位點(diǎn)的殘基片段構(gòu)成；活性位點(diǎn)“DTG”Motif結(jié)構(gòu)位于ψin結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)角。在兩種酶的比較可知，轉(zhuǎn)角部分的殘基保守，而β鏈頂部的2個(gè)殘基具有突變，即1IBQ是S211-A212和I221-L222，在Ap中分別突變?yōu)門(mén)G和VM，而該幾個(gè)突變殘基的空間結(jié)構(gòu)相似，且離活性位點(diǎn)相對(duì)較遠(yuǎn)，對(duì)酶的性質(zhì)影響較小。另一個(gè)稱(chēng)為ψo(hù)ut環(huán)，主要由完全保守的289～302位點(diǎn)的殘基片段構(gòu)成，該環(huán)突出于酶表面，部分覆蓋了酶的活性cleft，環(huán)中的L296 和L298殘基對(duì)S1’-S2底物結(jié)合區(qū)域的構(gòu)型起重要的作用。

3　結(jié)語(yǔ)

克隆獲得米曲霉的酸性蛋白酶（Ap）基因，然后對(duì)Ap的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)與分析。結(jié)果表明：Ap基因?qū)γ艽a子使用頻率具有明顯的偏好性。Ap屬于胞外天冬氨酸蛋白酶，且Ap分子至少能與2個(gè)Zn2+結(jié)合，含1個(gè)二硫鍵、163個(gè)氫鍵、35個(gè)鹽堿。該酶的部分重要位點(diǎn)（如flap環(huán)、轉(zhuǎn)角和ψ-loops）的氨基

參考文獻(xiàn)：酸殘基較為保守，研究可為該酶的結(jié)構(gòu)功能、異源表達(dá)和定向改造等方面的研究提供參考。

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Structural Analysis of Acid Protease ( Ap) from Aspergillus oryzae

KE Ye，LI Jiasheng，ZENG Songrong，ZHU Zhaojing，HUANG Xiaohui
（Yingdong college of life sciences，Shaoguan University，Shaoguan 512005，China）

Abstract：Compared with some commercial proteases，acid protease（Ap）from Aspergillus oryzae has high hydrolysis efficiency and produces soy hydrosates with weaker bitterness. In order to uncover the structural characteristics，Ap gene from A. oryzae was cloned by RT-PCR technology，and then was analyzed with bioinformatics technology. Results showed that Ap gene had a preference for codon usage，especially for the third codon with the 74% usage frequency of GC base，and encoded 404 amino acid residues. Ap was an extracellular aspartic proteinase. According to the structure obtained by homology modeling with acid protease from A. phoenicis（PDB code：1IBQ），Ap was found to possess at least two Zn2+binding sites，one disulfide bond，163 hydrogen bonds，35 salt bonds，and two solvent accessible surfaces of D33（4.7849?2）and D215（3.5941?2）. Though the spatial structures of Ap and 1IBQ were similar，residues of some important sites（such as flap ring，angle and ψ-loops）were conservative.

Keywords：Aspergillus oryzae，acid protease，structural analysis

作者簡(jiǎn)介：柯野（1977—），男，四川瀘縣人，理學(xué)博士，副教授，主要從事微生物學(xué)與酶工程的研究。E-mail：keye518@163.com

基金項(xiàng)目：廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011B010500018）；韶關(guān)市科技專(zhuān)項(xiàng)資金資助項(xiàng)目（2013CX/K83）；韶關(guān)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃省級(jí)立項(xiàng)項(xiàng)目（1057613-003）；韶關(guān)學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新培育項(xiàng)目（2015-6）。

收稿日期：2014-08-21

中圖分類(lèi)號(hào)：Q 816；Q 71

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1673—1689（2016）01—0095—06