武當?shù)貐^(qū)馬尾松松針中原花青素含量測定研究

李　聰，鄭　芳，朱雪松，周玉濤，郭賢明

(1.湖北醫(yī)藥學院附屬東風醫(yī)院藥學部,武當特色中藥研究湖北省重點實驗室；2.湖北醫(yī)藥學院附屬第二臨床學院；3.湖北醫(yī)藥學院藥學院，湖北 十堰　442008)

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武當?shù)貐^(qū)馬尾松松針中原花青素含量測定研究

李聰1，鄭芳1，朱雪松1，周玉濤2，郭賢明3

(1.湖北醫(yī)藥學院附屬東風醫(yī)院藥學部,武當特色中藥研究湖北省重點實驗室；2.湖北醫(yī)藥學院附屬第二臨床學院；3.湖北醫(yī)藥學院藥學院，湖北 十堰442008)

摘要：目的探討武當?shù)貐^(qū)馬尾松松針中原花青素的含量測定方法。方法采用高效液相色譜法測定松針中原花青素的含量。色譜柱為Sum Fortis C(18)(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動相為乙腈∶水(15∶85)，流速為0.6 mL·min(-1)，柱溫30℃，檢測波長為280 nm。結果經(jīng)方法學考察，原花青素在0.258～2.58 g·L(-1)范圍內(nèi)，峰面積與所試濃度線性關系良好，準確度高，精密度好。武當?shù)貐^(qū)松針樣品中原花青素含量為44.65 mg·g(-1)。結論該方法操作簡便，有效成分原花青素的含量較高，開發(fā)前景廣闊，旨在其進一步研究提供依據(jù)。

關鍵詞：松針；原花青素；高效液相色譜法

松針(Pini Folium)為松科植物華山松(PinusarmandiFranch.)、黃山松(P.TaiwanensisHayata)、馬尾松(P.massonianaLamb)、油松(P.tabulaeformisCarr.)等的干燥針葉[1]。《本草綱目》記載：“松葉，溫，苦，無毒。主治風濕瘡，生毛發(fā)、安五臟、守中、不饑延年”，研究表明，松針富含黃酮類、揮發(fā)油類、維生素、氨基酸及微量元素等成分，其中黃酮類成分前花青素是目前發(fā)現(xiàn)的作用最強的高效抗氧化劑，其抗氧化能力是維生素E的50倍。基于強大的抗氧化和清除自由基能力，藥理結果表明松針黃酮具有擴張血管、改善微循環(huán)、抗動脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)血脂、防衰老等作用[2-4]。

目前，《湖北省中藥材質(zhì)量標準》“松針”項下載入的松屬植物有馬尾松、油松、云南松，其中對其性狀、鑒別、檢查(總灰分、酸不溶性灰分)、浸出物等形態(tài)組織及一般定量項目有較詳細的規(guī)范[1]，但與藥效相關的主要定量指標尚無制訂。故本課題擬初步對松針中原花青素的含量進行測定，完善松針質(zhì)量評價系統(tǒng)，為其進一步開發(fā)研究奠定基礎。

1儀器與試劑

高效液相色譜儀UltiMate3000(戴安中國有限公司)；色譜柱為Sum Fortis C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)。

松針樣品(批號：20141101)采自湖北省賽武當區(qū)，經(jīng)湖北醫(yī)藥學院陳吉炎教授鑒定為松科松屬植物馬尾松(PinusmassonianaLamb.)。原花青素對照品(北京神州科創(chuàng)生物科技有限公司，批號：MUST-12032802)；石油醚(天津化學試劑有限公司)；甲醇、乙醇(武漢市中天化工有限責任公司)；乙腈、甲醇(色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司)。

2實驗與結果

2.1樣品溶液的制備將所得松針粉用石油醚脫脂，過濾，將濾渣放置在陰涼通風處干燥。取樣品5.003 g進行超聲提取，提取條件：提取液60%的乙醇50 mL，溫度為45℃，超聲頻率為250 W，提取時間為50 min，過濾。精密量取濾液1 mL于5 mL的容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得[5-7]。

2.2對照品溶液的制備精密稱取原花青素對照品25.8 mg，置于10 mL的容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成濃度為2.58 g·L-1的溶液，精密量取2.5 mL基本溶液搖勻，置于5 mL的容量瓶中制成1.29 g·L-1的對照品溶液，搖勻，備用。

2.3色譜條件與系統(tǒng)適應性試驗色譜柱為Sum Fortis C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相為乙腈∶水(15∶85)；流速為0.6 mL·min-1；柱溫30℃；檢測波長為280 nm；進樣量為10 μL。在上述色譜條件下分別取“2.2”項下樣品溶液與“2.3”項下對照品溶液進樣，結果原花青素保留時間約為3.04 min；理論塔板數(shù)以原花青素峰計均不低于11 000，原花青素色譜峰的DAD值均不低于999.0，檢測原花青素色譜峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度均大于1.5，說明樣品的原花青素與相鄰的色譜峰分離。

2.4流動相的選擇經(jīng)查閱文獻[8-11]，調(diào)整流動相比例，結果在乙腈∶水(15∶85)時，所得色譜峰良好，分離效果明顯，見圖1，2。

圖1　原花青素對照品的HPLC圖

圖2　松針提取液的HPLC圖

2.5方法學考察

2.5.1標準曲線的制備及線性范圍考察分別精密量取“2.2”項下原花青素溶液(2.58 g·L-1)1、2、4、6、8、10 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇分別稀釋至刻度，搖勻，分別作為供試品溶液。分別取各溶液10 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積,分別為5.659、14.705、31.601、46.914、63.287、76.981，以對照品的峰面積(Y)對原花青素對照品的濃度(X)回歸，得回歸方程Y=30.8X-1.204，相關系數(shù)r=0.999 3，原花青素在0.258～2.58 g·L-1范圍內(nèi)，峰面積與所試濃度線性關系良好。

2.5.2精密度試驗取“2.2”項下濃度為1.29 g·L-1原花青素對照品溶液，按照含量測定項下的測定方法，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，分別為39.764、39.121、39.342、39.554、39.592、39.968，計算的RSD值為0.76%，表明儀器精密度良好。

2.5.3重復性試驗稱取松針粉6份，按照供試品溶液制備方法制備樣品溶液，按色譜條件測定，記錄峰面積，結果分別為28.246、27.179、27.157、26.992、26.641、27.267，原花青素的平均含量為0.882 g·L-1，RSD值為1.99%。

2.5.4穩(wěn)定性試驗取“2.1”項下松針提取液樣品及“2.2”項下原花青素對照品溶液(1.29 g·L-1)分別于0、2、4、6、8、10 h進樣，記錄原花青素的峰面積，測得對照品溶液中原花青素峰面積的平均值為39.142，RSD值為1.09%，松針提取液樣品中原花青素面積的平均值為27.135, RSD值為1.29%，表明對照品和樣品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性均良好。

2.5.5加樣回收率試驗取松針粉末1 g 共6份，分別按照供試品樣品制備方法制備溶液，得到10 mL濾液，取所得濾液0.6 mL于5 mL容量瓶中，加原花青素原液(2.58 g·L-1)1 mL，然后加甲醇稀釋至刻度線，搖勻即得。分別取供試品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，并計算回收率，得平均回收率為97.71%,RSD為2.06%,結果表明此測定方法回收率良好，見表1。

表1　加樣回收試驗結果

3松針中原花青素含量的測定

按上述的測定方法及測定條件，對松針樣品中原花青素的含量進行測定，平均含量為44.65 mg·g-1。

4討論

4.1波長的選擇在200～400 nm波長范圍內(nèi)，由UltiMate 3000二極管陣列檢測器得原花青素的最大吸收波長為(279.8±0.2) nm，最終將該研究原花青素的檢測波長定為280 nm。

4.2含量測定根據(jù)適宜色譜條件，流動相為乙腈∶水(15∶85)，流速為0.6 mL·min-1，柱溫30℃，波長為280 nm，對馬尾松松針樣品中原花青素的含量進行測定，平均含量為44.65 mg·g-1，含量較高，加之原花青素具有降血脂、降血糖、抗氧化及增強免疫力等活性，開發(fā)利用前景廣闊[12-13]。

此外，湖北省松林資源豐富，成本低，生物活性極強的黃酮類成分原花青素的優(yōu)勢資源尚未得到利用，本課題將對不同采收期松葉進行研究，分析采收期對其影響，為確定松針的適宜采收期，制定較完善的質(zhì)量評價系統(tǒng)等及其制劑的開發(fā)應用提供科學依據(jù)。

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The study on content determination of proanthocyanidins in pine needles in Wudang area

LI Cong,ZHENG Fang,ZHU Xue-song, et al

(DepartmentofPharmacy,DongfengHospitalAffiliatedtoHubeiUniversityofMedicine,HubeiKeyLaboratoryofWudangLocalChineseMedicineResearch,Shiyan,Hubei442008)

Abstract:Objective To discuss methods for the content determination of proanthocyandins in pine needles in Wudang area. Methods HPLC-DAD was used to determine proanthocyandin content of pine needles. The Column was Sum Fortis C(18 )(4.6 mm×150 mm, 5 μm) with the mobile phase of acetonitrile-water (15∶85). The flow rate was 0.6 mL·min(-1). The temperature was 30℃, and the detective wavelength was 280 nm.Results The proanthocyandin of pine needles was well separated with other substances. The proanthocyandin’s peak area had a good linear relationship within the concentration range from 0.258 to 2.58 g·L(-1). The results of methodological study demonstrated that the method met the requirements of the determination. The proanthocyandins contents of pine needles were 44.65 mg·g(-1). Conclusions The method was simple and effective contents of procyanidins were high, thus providing basis for its further study with promising prospects.

Key words:pine needles;proanthocyanidins;HPLC

(收稿日期：2015-11-26，修回日期：2016-02-15)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.04.014

通信作者：朱雪松，男，副教授，主任藥師，研究方向：醫(yī)院藥學與臨床藥學，E-mail：dfpharmacy@163.com

基金項目：湖北省十堰市科技局項目(No 14k73);湖北省2011協(xié)同創(chuàng)新中心基金(No 2011JH-2014CXTT15)