纈沙坦氨氯地平片有關(guān)物質(zhì)研究

周志勇，黃鶴飛，張　燁

(1.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系;2.三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院藥劑科，湖北 宜昌　443003)

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◇藥物分析◇

纈沙坦氨氯地平片有關(guān)物質(zhì)研究

周志勇1，黃鶴飛2，張燁2

(1.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系;2.三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院藥劑科，湖北 宜昌443003)

摘要：目的建立纈沙坦氨氯地平片有關(guān)物質(zhì)含量的測(cè)定方法。方法采用高效液相色譜法，Agilent1220高效液相，(Eclipse plus，250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以磷酸鹽緩沖液(取三乙胺10 mL加水至1 000 mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.8)為流動(dòng)相A，以甲醇—乙腈(70∶30)為流動(dòng)相B，進(jìn)行線性梯度洗脫，流速為1.0 mL·min(-1)，檢測(cè)波長(zhǎng)為237 nm。結(jié)果氨氯地平與雜質(zhì)D分離度為14.44，纈沙坦與雜質(zhì)B的分離度為9.46，且各物質(zhì)之間有較好的分離；空白輔料對(duì)有關(guān)物質(zhì)測(cè)定無(wú)干擾，專屬性良好；強(qiáng)制降解試驗(yàn)中，雜質(zhì)可與主峰完全分離。結(jié)論該方法結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可靠性強(qiáng)，可用于測(cè)定纈沙坦氨氯地平片中的有關(guān)物質(zhì)。

關(guān)鍵詞：纈沙坦氨氯地平；有關(guān)物質(zhì)；高效液相色譜

纈沙坦氨氯地平片是由諾華公司研發(fā)，并于2006年12月獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療原發(fā)性高血壓，用于單藥治療不能充分控制血壓的患者。由于該藥療效確切，國(guó)內(nèi)開展了大量的該復(fù)方制劑仿制藥的研發(fā)工作[1-3]，而有關(guān)物質(zhì)的完整研究資料是申報(bào)該復(fù)方制劑的重要組成部分，建立有關(guān)物質(zhì)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以控制有關(guān)物質(zhì)含量。參照纈沙坦氨氯地平片進(jìn)口標(biāo)準(zhǔn)“有關(guān)物質(zhì)”項(xiàng)下檢測(cè)的雜質(zhì)及購(gòu)得的雜質(zhì)對(duì)照品，將纈沙坦雜質(zhì)B(結(jié)構(gòu)式見圖1)和氨氯地平雜質(zhì)D(結(jié)構(gòu)式見圖2)列入標(biāo)準(zhǔn)考察。本試驗(yàn)采用高效液相色譜法梯度洗脫方式，建立了快速、準(zhǔn)確、分離度高的含量測(cè)定方法，從而為完善纈沙坦氨氯地平片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了依據(jù)。

圖1　纈沙坦雜質(zhì)B結(jié)構(gòu)示意圖

圖2　氨氯地平雜質(zhì)D結(jié)構(gòu)示意圖

1儀器與試藥

Agilent1220液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；FA2004N電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；KQ-500DE超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)；苯磺酸氨氯地平(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100374-200903)；纈沙坦(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100651-200902)；氨氯地平雜質(zhì)D(Kony Pharma，批號(hào)：20090901)；纈沙坦異構(gòu)體(Kony Pharma，批號(hào)：20080801)；乙腈為色譜純; 水為二次去離子水；其余試劑為分析純。

2方法與結(jié)果[4-10]

2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)采用Agilent,Eclipse plus色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以磷酸鹽緩沖液(取三乙胺10 mL加水至1 000 mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.8)為流動(dòng)相A，以甲醇—乙腈(70∶30)為流動(dòng)相B；檢測(cè)波長(zhǎng)為237 nm；柱溫為30℃；進(jìn)樣量10 μL；流速為1.0 mL·min-1，按表1進(jìn)行線性梯度洗脫。

表1　線性梯度洗脫

精密量取氨氯地平雜質(zhì)D對(duì)照品溶液和纈沙坦雜質(zhì)B對(duì)照品溶液各1 mL置10 mL量瓶中，加纈沙坦氨氯地平對(duì)照品溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液。精密量取系統(tǒng)適應(yīng)性溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，氨氯地平及雜質(zhì)D和纈沙坦及雜質(zhì)B的理論塔板數(shù)均大于10 000，氨氯地平與雜質(zhì)D的分離度及纈沙坦與雜質(zhì)B的分離度均>1.5。

2.2溶液的制備

2.2.1供試品溶液取本品10片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量(約相當(dāng)于纈沙坦80 mg，氨氯地平5 mg)，置50 mL量瓶中，加流動(dòng)相A—流動(dòng)相B(1∶1)適量，超聲使溶解，放冷，加流動(dòng)相A—流動(dòng)相B(1∶1)稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

表2　有關(guān)物質(zhì)系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果

注：分離度1為氨氯地平與雜質(zhì)D的分離度，分離度2為纈沙坦與雜質(zhì)B的分離度。

2.2.2對(duì)照溶液精密量取供試品溶液1 mL置100 mL量瓶中，加流動(dòng)相A-流動(dòng)相B(1∶1)稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液。

2.2.3氨氯地平雜質(zhì)D對(duì)照品溶液取氨氯地平雜質(zhì)D對(duì)照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相A-流動(dòng)相B(1∶1)溶解并稀釋制成每1 mL中含有氨氯地平雜質(zhì)D 0.8 mg的對(duì)照品溶液。

2.2.4纈沙坦雜質(zhì)B對(duì)照品溶液取纈沙坦雜質(zhì)B對(duì)照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相A-流動(dòng)相B(1∶1)溶解并稀釋制成每1 mL中含有纈沙坦雜質(zhì)B 0.8 mg的對(duì)照品溶液。

2.3雜質(zhì)歸屬

2.3.1氨氯地平雜質(zhì)D對(duì)照品溶液取氨氯地平雜質(zhì)D對(duì)照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相A—流動(dòng)相B(1∶1)溶解并稀釋制成每1 mL中含有氨氯地平雜質(zhì)D 0.8 mg的對(duì)照品溶液。

2.3.2纈沙坦雜質(zhì)B對(duì)照品溶液取纈沙坦雜質(zhì)B對(duì)照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相A—流動(dòng)相B(1∶1)溶解并稀釋制成每1 mL中含有纈沙坦雜質(zhì)B 0.8 mg的對(duì)照品溶液。

2.3.3苯磺酸溶液精密量取液體苯磺酸1 mL，加流動(dòng)相A—流動(dòng)相B(1∶1)溶解并稀釋至100 mL。

2.3.4氨氯地平原料溶液精密稱取苯磺酸氨氯地平原料14 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇5 mL使溶解，加流動(dòng)相A—流動(dòng)相B(1∶1)稀釋至刻度，搖勻，作為氨氯地平原料溶液。

2.3.5纈沙坦原料溶液精密稱取纈沙坦原料16 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇5 mL使溶解，加流動(dòng)相A—流動(dòng)相B(1∶1)稀釋至刻度，搖勻，作為纈沙坦原料溶液。分別精密量取上述溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見表3。苯磺酸的保留時(shí)間為2.092 min，氨氯地平雜質(zhì)D保留時(shí)間為7.231 min，纈沙坦雜質(zhì)B保留時(shí)間為13.937 min，未知雜質(zhì)分別為8.876、9.097、14.817 min。

表3　雜質(zhì)歸屬結(jié)果

注：“—”為未檢出。

2.4系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

2.4.1纈沙坦氨氯地平對(duì)照品溶液精密稱取苯磺酸氨氯地平對(duì)照品14 mg和纈沙坦對(duì)照品16 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇5 mL使溶解，加流動(dòng)相A—流動(dòng)相B(1∶1)稀釋至刻度，搖勻，作為纈沙坦氨氯地平對(duì)照品溶液。

2.4.2系統(tǒng)適用性溶液精密量取氨氯地平雜質(zhì)D對(duì)照品溶液和纈沙坦雜質(zhì)B對(duì)照品溶液各1 mL置10 mL量瓶中，加纈沙坦氨氯地平對(duì)照品溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液。精密量取系統(tǒng)適應(yīng)性溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見表4。

2.5雜質(zhì)相對(duì)保留時(shí)間及校正因子因有關(guān)物質(zhì)測(cè)定為梯度洗脫，流動(dòng)相相對(duì)固定，未考察不同流動(dòng)相比例下各雜質(zhì)的對(duì)保留時(shí)間，重點(diǎn)考察兩個(gè)廠家的色譜柱測(cè)定雜質(zhì)的保留時(shí)間，并計(jì)算校正因子。

色譜柱1：Lichrospher C18(150 mm×64.6 mm,5 μm)；色譜柱2：Agilent C18(150 mm×64.6 mm, 5 μm)。

精密量取系統(tǒng)適用性溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見表5。

表4　有關(guān)物質(zhì)系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果

注：分離度1為氨氯地平與雜質(zhì)D的分離度，分離度2為纈沙坦與雜質(zhì)B的分離度。

表5　雜質(zhì)保留時(shí)間考察試驗(yàn)結(jié)果

注：RRT(雜質(zhì)相對(duì)保留時(shí)間)均為相對(duì)于氨氯地平峰的保留時(shí)間。

由上述試驗(yàn)結(jié)果可知，雜質(zhì)D相對(duì)于氨氯地平的保留時(shí)間為0.570～0.647 min，平均值為0.61 min，雜質(zhì)B相對(duì)于氨氯地平的保留時(shí)間為1.233～1.325 min，平均值為1.28 min，因此擬定雜質(zhì)D相對(duì)于氨氯地平的保留時(shí)間為0.61 min，雜質(zhì)B相對(duì)于氨氯地平的保留時(shí)間為1.28 min。

試驗(yàn)測(cè)得雜質(zhì)D的校正因子為2.03，雜質(zhì)B的校正因子為1.01～1.02，參考纈沙坦氨氯地平片進(jìn)口標(biāo)準(zhǔn)，確定雜質(zhì)D的校正因子為2.0，雜質(zhì)B及其他雜質(zhì)的校正因子為1.0。

2.6空白輔料干擾試驗(yàn)取空白輔料樣品0.083 0 g，置50 mL量瓶中，加流動(dòng)相A—流動(dòng)相B(1∶1)溶解并稀釋至刻度，作為空白輔料溶液，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果可知，空白輔料溶液不出峰，不干擾本品有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定。

2.7耐用性試驗(yàn)為了考察色譜條件微小的變動(dòng)能否通過設(shè)計(jì)的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，確保方法的有效性，故采用改變下列條件考察本方法的耐用性。結(jié)果見表6，7。

原色譜條件：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，Licrospher C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：以磷酸鹽緩沖液(取三乙胺10 mL加水至1 000 mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.8)為流動(dòng)相A，以甲醇—乙腈(70∶30)為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)：237 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

表6　氨氯地平耐用性試驗(yàn)結(jié)果

表7　纈沙坦耐用性試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)論：流動(dòng)相pH、流速及柱溫的變化對(duì)氨氯地平和纈沙坦的有關(guān)物質(zhì)檢查無(wú)影響，雜質(zhì)峰的數(shù)量沒有增加。表明本方法系統(tǒng)耐用性良好，故確定色譜條件為：流動(dòng)相A∶磷酸鹽緩沖液(取三乙胺10 mL加水至1 000 mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.8)，流動(dòng)相B：甲醇—乙腈(70∶30)，梯度洗脫，流速為1.0 mL·min-1；柱溫30℃。

2.8檢測(cè)限取本品供試品溶液，稀釋進(jìn)樣至信噪比為3∶1，作為檢測(cè)限，氨氯地平檢測(cè)限為0.695ng，纈沙坦檢測(cè)限為0.775 ng，能滿足有關(guān)物質(zhì)檢查的要求。

2.9溶液放置穩(wěn)定性試驗(yàn)取供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12 h，精密量取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖,結(jié)果顯示供試品溶液中氨氯地平和纈沙坦在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定，RSD=1.36%。

2.10強(qiáng)制降解試驗(yàn)

2.10.1未破壞取本品細(xì)粉適量(約相當(dāng)于纈沙坦80 mg，氨氯地平5 mg)，置50 mL帶刻度的具塞試管中，加入流動(dòng)相A—流動(dòng)相B(1∶1)適量，超聲15 min，放冷，加流動(dòng)相A—流動(dòng)相B(1∶1)稀釋至50 mL，濾過，取續(xù)濾液作為破壞前溶液。

2.10.2酸破壞試驗(yàn)取本品細(xì)粉適量(約相當(dāng)于纈沙坦80 mg，氨氯地平5 mg)，置50 mL帶刻度的具塞試管中，加1 mol·L-1鹽酸溶液3 mL，置80℃水浴中加熱約30 min，放冷至室溫，用1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)至中性，加流動(dòng)相A—流動(dòng)相B(1∶1)稀釋至50 mL，濾過，取續(xù)濾液作為酸破壞溶液。

2.10.3堿破壞試驗(yàn)操作步驟同酸破壞試驗(yàn)，僅將鹽酸換位氫氧化鈉，得堿破壞溶液。

2.10.4氧化破壞試驗(yàn)取本品細(xì)粉適量(約相當(dāng)于纈沙坦80 mg，氨氯地平5 mg)，置50 mL帶刻度的具塞試管中，加30%的雙氧水溶液5 mL，靜置2 h，加流動(dòng)相A—流動(dòng)相B(1∶1)稀釋至50 mL，濾過，取續(xù)濾液作為氧化破壞溶液。

2.10.5高溫破壞試驗(yàn)取本品細(xì)粉適量(約相當(dāng)于纈沙坦80 mg，氨氯地平5 mg)，置50 mL帶刻度的具塞試管中，加流動(dòng)相A—流動(dòng)相B(1∶1)5 mL，置100℃水浴中加熱約2 h，放冷至室溫，加流動(dòng)相A—流動(dòng)相B(1∶1)稀釋至50 mL，濾過，取續(xù)濾液作為高溫破壞溶液。

2.10.6光照破壞試驗(yàn)取本品細(xì)粉適量(約相當(dāng)于纈沙坦80 mg，氨氯地平5 mg)，置50 mL帶刻度的具塞試管中，置照度為(4 500±500)Lx的光照箱中48 h，加入流動(dòng)相A—流動(dòng)相B(1∶1)適量，超聲15 min，放冷，加流動(dòng)相A—流動(dòng)相B(1∶1)稀釋至50 mL，濾過，取續(xù)濾液作為光照破壞溶液。

另取空白輔料、纈沙坦和氨氯地平的混合原料(按處方比例混合)、被仿制品細(xì)粉，同法操作。分別精密量取上述溶液各10 μL，注入液相色譜儀。

圖3　強(qiáng)制降解試驗(yàn)色譜圖

圖3可見本品在酸、堿、高溫、氧化、光照條件下均不穩(wěn)定，原料帶入雜質(zhì)B，酸破壞降解產(chǎn)物主要有雜質(zhì)D和相對(duì)氨氯地平峰保留時(shí)間約為0.24的未知雜質(zhì)，堿破壞降解產(chǎn)物主要有雜質(zhì)B、D和相對(duì)氨氯地平峰保留時(shí)間在0.35～0.42 min之間的未知雜質(zhì)，氧化破壞降解產(chǎn)物主要有雜質(zhì)D，高溫破壞降解產(chǎn)物主要有雜質(zhì)B、D和相對(duì)氨氯地平峰保留時(shí)間約為0.24 min的未知雜質(zhì)，光照破壞降解產(chǎn)物主要有雜質(zhì)B、D和一些未知雜質(zhì)。自制樣品降解產(chǎn)物個(gè)數(shù)和變化趨勢(shì)與上市樣品基本一致。

3討論

《英國(guó)藥典》(2009年版)中纈沙坦氨氯地平片有關(guān)物質(zhì)中，纈沙坦與氨氯地平分別記錄了4種有關(guān)物質(zhì)，查閱相關(guān)文獻(xiàn)[11-13]，均將氨氯地平雜質(zhì)D和纈沙坦雜質(zhì)B列入考察標(biāo)準(zhǔn)中。

本試驗(yàn)分別從系統(tǒng)適應(yīng)性、專屬性以及強(qiáng)制降解試驗(yàn)方面分別考察了HPLC測(cè)定纈沙坦氨氯地平片有關(guān)物質(zhì)的方法，結(jié)果顯示的目標(biāo)色譜峰與有關(guān)物質(zhì)分離效果良好，本HPLC法測(cè)定有關(guān)物質(zhì)方法簡(jiǎn)便、快捷、可靠，可用于纈沙坦氨氯地平復(fù)方片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)。

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Research on related substance of valsartan Amlodipine

ZHOU Zhi-yong1，HUANG He-fei2，ZHANG Ye2

(1.CollegeofMedicalScience,ChinaThreeGorgesUniversity; 2.DepartmentofPharmacy,SecondCollegeofClinicalMedicalScience,ChinaThreeGorgesUniversity,Yichang,Hubei443003,China)

Abstract:Objective Aimed to establish an analytical method for related substances of valsartan Amlodipine tablets. Methods The sample was determined by HPLC (Agilent1220). The analysis was performed on Eclipse plus C(18 )column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) with the detection wavelength at 237 nm. Using phosphate buffer (10 ml triethylamine volumetric to 1 000 mL,adjusted to pH 2.8 with phosphoric acid) as mobile phase A, methanol - acetonitrile (70∶30) as mobile phase B, and linear gradient, mobile phase was initiated at a flow rate of 1.0 mL·min(-1).Results The resolution of amlodipine and impuritie D was 14.44;the resolution of amlodipine and impuritie B was 9.46, and there was good resolution between each substance. Conclusions This method is accurate, reproducible and reliable, which can be used to determine the related substances of valsartan Amlodipine tablets.

Key words:valsartan amlodipine;related substance;HPLC

(收稿日期：2015-10-20，修回日期：2016-02-26)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.04.010