天然凝血酶抑制劑的研究進(jìn)展

沈惠亮，吳　倩，王鏡淇，龔國清

(中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京　211198)

?

天然凝血酶抑制劑的研究進(jìn)展

沈惠亮，吳倩，王鏡淇，龔國清

(中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京211198)

摘要：凝血酶是絲氨酸蛋白酶的一種，同時具有于抗凝和促凝活性，在血栓形成和止血過程中發(fā)揮著重要的作用。而凝血酶之所以能發(fā)揮雙重作用，與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。因此根據(jù)凝血酶的結(jié)構(gòu)特點，設(shè)計特異性、高效的凝血酶抑制劑對于更好地了解止血過程和抑制血栓的形成具有重要意義，通過查閱國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn),現(xiàn)就天然抑制劑對于凝血酶作用機制及其研究意義進(jìn)行綜述。

關(guān)鍵詞:凝血酶；絲氨酸蛋白酶抑制劑；陰離子外部結(jié)合位點

凝血酶作為凝血瀑布中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1-2]，發(fā)揮著抗凝和促凝的作用。具體來說，在促凝方面，凝血酶可以激活血小板，將纖維蛋白原解離成纖維蛋白，進(jìn)而導(dǎo)致血凝塊的形成，同時可以通過反饋調(diào)節(jié)激活凝血因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅺ，進(jìn)一步促進(jìn)血液凝固。凝血酶的抗凝作用主要表現(xiàn)為，當(dāng)其和內(nèi)皮細(xì)胞表面的血栓調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合時會激活蛋白C，而激活后的蛋白C(APC)可以在磷脂和鈣離子存在時，滅活Ⅴa、Ⅷa,并削弱Ⅹa對凝血酶原的激活作用；同時，刺激纖溶酶原激活物的釋放，增強纖溶酶活性，促進(jìn)纖溶作用，綜合發(fā)揮抗血栓作用。

凝血酶之所以能發(fā)揮雙重作用主要是由其結(jié)構(gòu)決定的。研究已證實，凝血酶通過3個重要的結(jié)構(gòu)域發(fā)揮作用，即活性位點(active site)，陰離子結(jié)合位點1(anion binding exosite 1,ABE1)和陰離子結(jié)合位點2(anion binding exosite 2,ABE2)。因此，利用這些結(jié)構(gòu)上的特點，人們研制了高特異性的凝血酶抑制劑。通常，凝血酶抑制劑來源于某些吸血動物唾液中，隸屬于不同的蛋白家族，并且都是絲氨酸蛋白酶抑制劑。這一類抑制劑的晶體結(jié)構(gòu)顯示了抑制劑(多肽或蛋白)定點結(jié)合凝血酶的方式，這些抑制劑可以通過破壞凝血酶的結(jié)構(gòu)，使凝血酶被血液中存在的游離輔因子或底物清除。

1凝血酶的結(jié)構(gòu)和功能

1.1凝血酶的結(jié)構(gòu) 凝血酶由含有49個氨基酸殘基的輕鏈以及含有259個氨基酸的重鏈共價結(jié)合而成。三維結(jié)構(gòu)示意圖見圖1。當(dāng)發(fā)生自身分解反應(yīng)時，會從輕鏈上移除13個氨基酸殘基，形成α-凝血酶。凝血酶發(fā)揮作用的主要結(jié)構(gòu)域是活性位點和ABE1和ABE2。其中，活性位點含有大量的負(fù)電荷，易與S1口袋中的P1精氨酸殘基結(jié)合，同時，也可特異性的和“插入環(huán)”(60S和147S)結(jié)合。ABE1是位于活性位點一端的結(jié)構(gòu)域，它由30S和70S環(huán)組成，ABE1是纖維蛋白原和血栓調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合位點，可以和大多數(shù)凝血酶特異性底物結(jié)合，比如通過直接結(jié)合(如纖維蛋白原[3]血小板相關(guān)受體-1[4]、凝血因子Ⅴ[5]和凝血因子Ⅶ[6-7])和間接結(jié)合(如蛋白C[8]和凝血因子ⅩⅢ[9])的方式。ABE2作為肝素結(jié)合位點，從凝血酶分子的頂部一直環(huán)繞至凝血酶的背面，在血小板與GP(血小板膜糖蛋白)1Bα結(jié)合以及凝血酶對某些底物的識別上發(fā)揮著重要作用。

圖1　凝血酶三維結(jié)構(gòu)示意圖

1.2凝血酶的功能凝血酶作為體內(nèi)凝血過程中的重要環(huán)節(jié)，由凝血酶原和一系列級聯(lián)放大的水解反應(yīng)生成，這一系列反應(yīng)通常被稱為凝血瀑布[10-12]。凝血瀑布由一些刺激因子誘發(fā)，如血管壁損傷后的內(nèi)皮細(xì)胞，血液的高切應(yīng)變力等，凝血的結(jié)果在生理條件下體現(xiàn)為止血，病理條件下，就會形成血栓。在初級栓子形成后，通過復(fù)雜的機制使GP1Bα與vWF(假血管性血友病因子)結(jié)合，GPVI與膠原結(jié)合，使血小板進(jìn)一步黏附于損傷部位，形成牢固的止血栓子[13]。在外源凝血途徑方面，凝血因子Ⅶa和細(xì)胞外的組織因子結(jié)合，啟動蛋白水解瀑布；同時，結(jié)合后形成的Ⅶa-組織因子復(fù)合物可以激活因子Ⅶ和Ⅸ，可使凝血因子Ⅹ轉(zhuǎn)化為Ⅹa，凝血因子Ⅹa是將凝血酶原轉(zhuǎn)化成凝血酶的蛋白酶，最后再通過募集游離的輔因子和底物形成穩(wěn)定的止血栓子[14]。

2天然凝血酶抑制劑

2.1天然凝血酶抑制劑概述所有的天然凝血酶抑制劑都是絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族的成員[15-16]。絲氨酸蛋白酶抑制劑有大約400個殘基，包含一個混合型α/β折疊。構(gòu)象穩(wěn)定的絲氨酸蛋白酶抑制劑的主要由一個大的五鏈β片層(A片層)以及一個含有20個氨基酸殘基的RCL(活性中心環(huán))組成。凝血酶和其他蛋白酶可以與絲氨酸蛋白酶抑制劑的活性中心環(huán)結(jié)合，形成非共價復(fù)合物。這種非共價復(fù)合物的持續(xù)作用時間未知，但它可以很快轉(zhuǎn)變?yōu)轷；钢虚g產(chǎn)物。整個過程伴隨著酯鍵和S195(第195位絲氨酸)和P1殘基的?；嫉慕Y(jié)合。最終，絲氨酸蛋白酶抑制劑上的蛋白酶從“頂部”到“底部”遷移，形成高度穩(wěn)定的六鏈絲氨酸蛋白酶抑制劑并導(dǎo)致蛋白酶空間結(jié)構(gòu)的破壞[17]。同時，催化環(huán)的膨脹增大了氧離子洞并且將移除催化口袋的羰基氧。這種變化又會誘導(dǎo)酶原到酶的構(gòu)象轉(zhuǎn)換，并且使絲氨酸蛋白酶抑制劑重新恢復(fù)對其特異性酶的抑制活性。

2.2天然凝血酶抑制劑的分類和作用機制常見的四種天然絲氨酸蛋白酶抑制劑分別是：抗凝血酶(AT，或稱為ATⅢ)[18]，肝素輔因子Ⅱ(HCⅡ)[19]，蛋白C抑制劑(PCI)[20]和蛋白酶連接蛋白1(PN1)[21]。這四種絲氨酸蛋白酶抑制劑，在GAGs(黏多糖類物質(zhì))存在時，抑制活性有明顯增強。比如肝素，就可以在GAGs存在的條件下，同時和絲氨酸蛋白酶抑制劑以及凝血酶的外部位點2(ABE2)結(jié)合。這一機制可以使凝血酶在完整內(nèi)皮周圍時活性得以抑制，因為此范圍充斥著許多肝素樣黏多糖，從而血管壁完整時抑制血液凝固。與ABE2不同，ABE1在HCⅡ和PCI的作用下參與凝血酶的抑制。HCⅡ可以通過ABE1和P1口袋處亮氨酸殘基缺口的結(jié)合而募集凝血酶，而PCI可以通過直接結(jié)合于TM的第四結(jié)構(gòu)域EGF來抑制凝血酶與血栓素調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合過程，而非直接與凝血酶的ABE1發(fā)生作用。

絲氨酸蛋白酶抑制劑之所以能夠特異性地抑制凝血酶活性的原因是它能使生成的凝血酶復(fù)合物失活。事實上，所有的絲氨酸蛋白酶抑制劑會對絲氨酸蛋白酶造成一定程度上的解折疊，從而使其喪失原有功能。而絲氨酸蛋白酶抑制劑的抑制能力在微觀上取決于施加的破碎力，這種破碎力由RCL的長度(更短則力更大，更長則力更小)和活性位點的深度決定。在結(jié)構(gòu)上，凝血酶的插入環(huán)能明顯提高破碎力，導(dǎo)致更大程度解折疊的發(fā)生。在絲氨酸蛋白酶—絲氨酸蛋白酶抑制劑復(fù)合物中，兩個凝血酶外部位點均呈現(xiàn)無規(guī)則和無功能狀態(tài)[22]。這一特性確保了凝血酶—絲氨酸蛋白酶抑制劑復(fù)合物會與所有輔因子或底物(例如TM，GAGs，纖維蛋白)分離，且可以自由分布在血液中。而這種自由的分布與絲氨酸蛋白酶抑制劑—凝血酶復(fù)合物在肝臟受體的清除率有一定聯(lián)系。

3天然凝血酶抑制劑研究現(xiàn)狀

3.1抗凝血酶抗凝血酶是體內(nèi)主要的凝血酶抑制劑，其在血液中的濃度可達(dá)2.5 μmol·L-1。一方面，ATⅢ中的精氨酸可以和凝血因子Ⅱ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ中的絲氨酸1∶1結(jié)合，使其失活，另一方面，其含有的帶正電荷的賴氨酸可以和帶負(fù)電荷的肝素結(jié)合，暴露精氨酸，使ATⅢ對凝血因子的抑制速率增大1 000倍。但由于它也可以同時抑制多種凝血因子,所以并不是凝血酶特異性抑制劑。近期研究還發(fā)現(xiàn)[23]，ATⅢ和蛋白多糖-4的結(jié)合可以增加PG(前列腺素)I2的含量，進(jìn)而下調(diào)促炎因子的生成，在炎癥反應(yīng)中也發(fā)揮一定作用。

3.2 肝素輔因子Ⅱ肝素輔因子Ⅱ是凝血酶眾多底物或抑制劑中唯一的不含精氨酸和P1口袋的凝血酶抑制劑。HCⅡ在血液中濃度約為1.2 μmol·L-1，其抑制凝血酶的速率較慢。肝素，硫酸乙酰肝素都可以通過暴露天然絲氨酸蛋白酶抑制劑末端的部分使HCⅡ的活性增大1 000倍。HCⅡ在凝血過程中沒有ATⅢ重要，但它可能作為一種重要的后備力量，當(dāng)其含量升高時，可以緩解埋置冠脈支架后的血管再狹窄現(xiàn)象[24]。

3.3蛋白C抑制劑PCI可以由許多類型的細(xì)胞表達(dá)并存在于多數(shù)組織中。同ATⅢ一樣，PCI除了對凝血酶有抑制作用外，還可以抑制Xa, VⅡa-組織因子復(fù)合物，活化蛋白C等，這一特點也使它成為同時具有抗凝和促凝作用的絲氨酸蛋白酶抑制劑。有趣的是，在對PCI的研究過程中發(fā)現(xiàn)，由于并不能在小鼠的肝中檢測到PCI的存在，說明小鼠血液循環(huán)中不含有PCI，因此在前期動物試驗中不能借助小鼠來模擬PCI在人類止血過程中發(fā)揮的作用。和ATⅢ和HCⅡ不同，PCI對凝血酶的抑制效應(yīng)并不因肝素的存在而顯著增加，而血栓素調(diào)節(jié)蛋白(TM)的含量也會影響到PCI的抑制作用，因此PCI還可以通過抑制凝血酶和TM的結(jié)合而發(fā)揮作用。近期還有研究表明，PCI和以和肝細(xì)胞生長因子激活物(HGFA)結(jié)合，對組織產(chǎn)生一定的修復(fù)和調(diào)控作用[25]。

3.4蛋白酶連接蛋白1PN1是所有絲氨酸蛋白酶抑制劑中效能最高的抑制劑，在肝素存在時，其二級動力學(xué)常數(shù)高達(dá)1.5×106mol ·L-1·s-1。與其他可與肝素結(jié)合的絲氨酸蛋白酶抑制劑不同，PN1并不由肝產(chǎn)生，而是通過巨噬細(xì)胞，血小板和平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生，它和GAG的親和力較弱，而且對最后形成的PN1-凝血酶復(fù)合物毫不敏感，因此，最終生成的復(fù)合物并不由肝清除，而是由所附著的細(xì)胞清除。

4凝血酶抑制劑的研究意義

血栓性疾病是困擾人類健康的一大類疾病，對于該疾病的治療主要從抗血小板[26]和抗凝血兩個方面進(jìn)行。在抗血小板方面，主要通過抑制環(huán)氧化酶-1(COX-1)和血小板ADP受體來發(fā)揮作用[27]，代表藥物分別是阿司匹林和氯吡格雷，而最新研究發(fā)現(xiàn)兩者都會有一定的抵抗作用[28]。在抗凝血方面，主要是通過抑制凝血瀑布的級聯(lián)放大作用，尤其對關(guān)鍵凝血因子的抑制(如凝血因子X，凝血酶)而產(chǎn)生治療作用，對應(yīng)的藥物有利伐沙班，達(dá)比加群酯等[29]。與此同時，一些新的檢測手段，如血管彈力圖，在評價凝血和纖溶能力時也起了重要的作用。

在血栓性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，凝血酶可以催化纖維蛋白原生成纖維蛋白，并通過正反饋機制進(jìn)一步促進(jìn)自身的生成，最終形成穩(wěn)定的栓子。相對于間接凝血酶抑制劑，直接凝血酶抑制劑不依賴于抗凝血酶，可以和任何形式的凝血酶結(jié)合[30]，包括已形成的凝血酶—底物/輔因子復(fù)合物，從而使處于不同凝血階段的凝血酶失活。同時，相對于維生素K拮抗劑華法林來說，因為直接凝血酶抑制劑對凝血瀑布的其他維生素K依賴性凝血因子無抑制作用，從而降低了出血風(fēng)險[31]。

5結(jié)論與展望

通過對現(xiàn)有的天然凝血酶抑制劑及其作用機制的深入研究，闡明抑制劑如何通過利用凝血酶獨特的結(jié)構(gòu)特性實現(xiàn)高效能和高選擇性。我們可以得出結(jié)論：凝血酶抑制劑的作用總是需要ABE1或ABE2的參與，這兩個結(jié)構(gòu)域?qū)δ傅幕钚跃哂姓{(diào)控作用，可以通過大面積的“靜電操控”引導(dǎo)抑制劑的以特定方式插入活性位點。因此，在今后對凝血酶抑制劑的開發(fā)過程中，可以在設(shè)計層面更多地考慮其對ABE1和ABE2的作用，從而間接影響凝血酶的生理活性。

參考文獻(xiàn)：

[1] Lunko OO,Isaev DS,Krishtal OO,et al.Thrombin modulates persistent sodium current in CA1 pyramidal neurons of young and adult rat hippocampus[J].Kiev Ukraine,2015,61(4):5-10.

[2]Kerimoglu S,Onay A,Guvercin Y,et al.The effects of dabigatran etexilate on fracture healing in rats An experimental study[J].Indian J Orthop,2015,49(3): 357-360.

[3]Handley LD,Treuheit NA,Venkatesh VJ,et al.Thrombomodulin Binding Selects the Catalytically Active Form of Thrombin[J].Biochemistry,2015,54(43):6650-6658.

[4]Gandhi PS,Chen Z,Di Cera E.Crystal structure of thrombin bound to the uncleaved extracellular fragment of PAR1[J].J Biol Chem,2010,285(20):15393-15398.

[5]何衛(wèi)東,文丹,陳騰飛,等.蛇傷膠囊對竹葉青蛇傷凝血因子FVa、FⅧa、FIXa、FXa的影響[J].蛇志,2015,27(3):245-247.

[6]竇姿,何彥林.人凝血因子Ⅷ工藝研究進(jìn)展[J].微生物免疫學(xué)進(jìn)展,2015,43(6):65-69.

[7]歐陽淑娟,崔明.血漿凝血因子Ⅷ活性測定評估胃癌患者靜脈血栓栓塞風(fēng)險[J].實用預(yù)防醫(yī)學(xué),2015,22(8):1001-1003.

[8]Aisiku O,Peters CG,De Ceunynck K,et al.Parmodulins inhibit thrombus formation without inducing endothelial injury caused by vorapaxar[J].Blood,2015,125(12):1976-1985.

[9]Walton BL,Byrnes JR,Wolberg AS.Fibrinogen,red blood cells,and factor XIII in venous thrombosis[J].J Thromb Haemost,2015,13(Suppl 1):S208-S215.

[10] Hemker HC.Thrombin generation:biochemical possibilities and clinical reality[J].Blood,2015,126(3):288-289.

[11] Ogawa A,Firth AL,Ariyasu S,et al.Thrombin-mediated activation of Akt signaling contributes to pulmonary vascular remodeling in pulmonary hypertension[J].Physiol Rep,2013,1(7):1-12.

[12] Shi ZH,Li NG,Tang YP,et al.Prolinamide derivatives as thrombin inhibitors for the treatment of thrombin-mediated diseases: a patent evaluation of US2013296245[J].Expert Opin Ther Pat,2014,24(10):1139-1148.

[13] 徐秋霞,王松,趙永志,等.血栓栓塞性疾病[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2004：18-22.

[15] Ortiz G,Salica JP,Chuluyan EH,et al.Diabetic retinopathy: could the alpha-1 antitrypsin be a therapeutic option?[J].Biol Res,2014,47(1):58.

[16] Azhar A,Singh P,Rashid Q,et al.Antiangiogenic function of antithrombin is dependent on its conformational variation: implication for other serpins[J].Protein Pept Lett,2013,20(4):403-411.

[17] Tsutsui Y,Dela Cruz R,Wintrode PL.Folding mechanism of the metastable serpin α1-antitrypsin[J].Proc Natl Acad Sci USA,2012,109(12):4467-4472.

[18] Gagaoua M,Hafid K,Boudida Y,et al.Caspases and Thrombin Activity Regulation by Specific Serpin Inhibitors in Bovine Skeletal Muscle[J].Appl Biochem Biotechnol,2015,177(2):279-303.

[19] Boyle AJ,Roddick LA,Bhakta V,et al.The complete N-terminal extension of heparin cofactor II is required for maximal effectiveness as a thrombin exosite 1 ligand[J].BMC Biochem,2013,14:6.

[20] Yang H,Wahlmüller FC,Sarg B,et al.A+-helix of protein C inhibitor (PCI) is a cell-penetrating peptide that mediates cell membrane permeation of PCI[J].J Biol Chem ,2015,290(5):3081-3091.

[21] Kousted TM,Skjoedt K,Petersen SV,et al.Three monoclonal antibodies against the serpin protease nexin-1 prevent protease translocation[J].Thromb Haemost,2014,111(1):29-40.

[22] Li W,Johnson DJ,Adams TE,et al.Thrombin inhibition by serpins disrupts exosite II [J].J Biol Chem,2010,285(49):38621-38629.

[23] Iba T,Saitoh D.Efficacy of antithrombin in preclinical and clinical applications for sepsis-associated disseminated intravascular coagulation[J].J Intensive Care,2014,2(1):66.

[24] Schillinger M,Exner M,Sabeti S,et al.Highplasma heparin cofactor II activity protects from restenosis after femoropopliteal stenting[J].Thromb Haemost,2004,92(5):1108-1113.

[25] Suzuki K.Hepatocyte growth factor activator (HGFA): its regulation by protein C inhibitor[J].FEBS J,2010,277(10):2223-2229.

[26] 趙艷芳,劉琳,鄔云紅.血小板相關(guān)因子在血栓性疾病中的作用[J].中國生物制品學(xué)雜志,2014,27(4):578-581.

[27] 劉蒞欣,胡桃紅.血栓性疾病抗栓治療的研究進(jìn)展[J].中國臨床醫(yī)生,2013,41(5):15-17.

[28] 亓民成,韓薇.阿司匹林和氯吡格雷抵抗機制及應(yīng)對方略[J].安徽醫(yī)藥,2015,19(3):413-416.

[29] Wong PC,White A,Luettgen J.Inhibitory effect of apixaban compared with rivaroxaban and dabigatran on thrombin generation assay [J].Hosp Pract,1995,41(1):19-25.

[30] 趙冰,于敏,莫煒.小分子直接凝血酶抑制劑研究進(jìn)展[J].藥物生物技術(shù),2015,22(1):64-68.

[31] 張石革.直接凝血酶抑制劑的研究進(jìn)展與臨床應(yīng)用評價[J].中國醫(yī)院用藥評價與分析,2013,13(7):586-590.

Research advances of natural thrombin inhibitors

SHEN Hui-liang ,WU Qian ,WANG Jing-qi, et al

(DepartmentofPharmacy,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing,Jiangsu211198，China)

Abstract:Thrombin is one of serine proteases which exerts vital function in both thrombosis and hemostasis owing to its antithrombotic and procoagulant activities.The dual effects of thrombin have close relationship with its structure.It is of great significanceto design specific and efficient thrombin inhibitors to better understand the process of hemostasis as well as inhibition of blood clots formation.By reviewing the relevant literatures, the mechanism of natural thrombin inhibitors were thus reviewed.

Key words：thrombin;serpin;anion binding exosite

(收稿日期：2015-11-13，修回日期：2015-12-20)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.04.002

作者簡介：沈惠亮，男，碩士研究生通信作者：龔國清，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：創(chuàng)新化合物的抗血栓作用及其機制研究，E-mail:gonggq@hotmail.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金(No 59637050)