凝血酶在腦出血中的作用研究現(xiàn)狀

王 亮，張建富，劉海珠

(威海市立醫(yī)院，山東威海264200)

凝血酶是一種血清絲氨酸蛋白酶，主要產(chǎn)生于高血壓腦出血、顱內(nèi)動(dòng)脈瘤、動(dòng)靜脈畸形(AVM)破裂出血、顱腦外傷等患者的腦組織中。腦出血為神經(jīng)外科常見(jiàn)病，但目前尚無(wú)有效治療方法。多項(xiàng)研究已證實(shí)，凝血酶在腦出血后神經(jīng)損害和腦水腫的發(fā)生機(jī)制中扮演重要角色。現(xiàn)將凝血酶在腦出血中的作用研究現(xiàn)狀綜述如下。

1 凝血酶的結(jié)構(gòu)、生物學(xué)特性及來(lái)源

1.1 凝血酶的組成及結(jié)構(gòu) 人體凝血酶由259個(gè)氨基酸殘基的重鏈B和49個(gè)氨基酸殘基的輕鏈A構(gòu)成，其中重鏈B具有三個(gè)功能結(jié)構(gòu)區(qū)和酶活性位點(diǎn)，構(gòu)成凝血酶的三個(gè)功能結(jié)構(gòu)區(qū):一是精氨酸側(cè)鏈口袋，其催化位點(diǎn)由Asp-102、His-47和Set-195構(gòu)成;二是非極性結(jié)合位點(diǎn)，可與底物發(fā)生疏水作用;三是陰離子結(jié)合位點(diǎn)，可能由重鏈B的6個(gè)賴氨酸組成，主要與凝血酶調(diào)解蛋白、血小板受體等相互作用、相互識(shí)別［1］。

1.2 凝血酶的生物學(xué)特性 凝血酶多產(chǎn)生于局部受損的血管，能將無(wú)活性的纖維蛋白原變?yōu)橛谢钚缘睦w維蛋白，并引發(fā)諸多受體介導(dǎo)的過(guò)程，如平滑肌收縮、血栓素形成及血小板聚集分泌［2］;還能與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，促進(jìn)內(nèi)皮源性松弛因子、前列腺素、內(nèi)皮素等物質(zhì)釋放。凝血酶的凝血原理為首先通過(guò)始動(dòng)因子(血級(jí)聯(lián)反應(yīng))激活Ⅹa因子，將無(wú)活性的凝血酶原激活成具有活性的凝血酶，其后介導(dǎo)Ⅷa因子轉(zhuǎn)化成Ⅺ、Ⅶ、Ⅴ、Ⅷ的負(fù)反饋激活及纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白的過(guò)程，進(jìn)而激活血小板。

1.3 凝血酶的產(chǎn)生途徑 凝血酶原是一種主要由人體肝臟合成、以微分子水平存在于血漿中的物質(zhì)。Ⅴa凝血因子可以借助外源性或者內(nèi)源性凝血途徑產(chǎn)生，并將凝血酶原轉(zhuǎn)化成凝血酶。由于1 mL全血能形成1.5 nmol凝血酶，發(fā)生腦損傷或腦出血的患者會(huì)出現(xiàn)實(shí)質(zhì)性腦損害，繼而導(dǎo)致凝血酶原發(fā)生裂解產(chǎn)生大量的凝血酶。因此，凝血酶既可來(lái)自腦組織自身，也可以產(chǎn)生于局部損傷部位。體外相關(guān)研究［3］證實(shí)，凝血酶原mRNA可在腦膠質(zhì)源性和組織神經(jīng)元的細(xì)胞系中表達(dá)，腦部有缺血損害者腦凝血酶原mRNA表達(dá)也會(huì)有所上調(diào)，提示在腦中存在ⅩamRNA的情況下，即使血腦屏障(BBB)未遭到破壞，凝血酶依然能形成和導(dǎo)致腦損害。但以上作用反應(yīng)的機(jī)制尚不清楚。

1.4 凝血酶與凝血酶受體(TR) 凝血酶主要通過(guò)與TR結(jié)合發(fā)揮作用。TR是蛋白酶激活受體，由包括胞內(nèi)環(huán)狀結(jié)構(gòu)(3個(gè))和胞外環(huán)狀結(jié)構(gòu)(3個(gè))等在內(nèi)的7個(gè)疏水跨膜區(qū)域構(gòu)成，其末端氨基延伸到了細(xì)胞外，其中有與凝血酶陰離子結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合的序列LDPR/SFLL和識(shí)別凝血酶的序列KYEPFWEDEE。以上兩個(gè)結(jié)構(gòu)相互作用可使TR的第41位和42位氨基酸發(fā)生裂解，形成新的氨基末端(起始序列為SFLLRN)。在神經(jīng)系統(tǒng)中，凝血酶可與暴露受體外功能區(qū)的配基序列及自身的配基袋相互作用，促進(jìn)細(xì)胞活化、引起其他相關(guān)變化［4，5］。

2 凝血酶在腦出血后病變發(fā)生中的作用

2.1 腦組織毒性 Lee等［6］運(yùn)用立體定向注入的方法，分別向大鼠右側(cè)基底節(jié)注入濃縮血細(xì)胞、血清、血漿、全血，24 h后處死動(dòng)物并測(cè)量其腦內(nèi)離子含量及水腫程度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)全血組的離子含量未改變、腦水腫量與腦含水量增加值一致。提示腦水腫的發(fā)生和血漿、血清及濃縮血細(xì)胞無(wú)必然關(guān)系，血漿中加入一定量的凝血酶原也可引發(fā)腦水腫。另有研究［7］顯示，將凝血酶抑制劑alpha-NAPAP注入到凝固血塊中能明顯減輕腦內(nèi)血腫腫塊邊緣水腫，但無(wú)法改變血腫的原有容積。表明凝血酶的化學(xué)刺激作用大于血凝塊的機(jī)械壓迫作用。Xi等［8］發(fā)現(xiàn)，大鼠腦出血后腦水腫未達(dá)高峰前，右側(cè)基底節(jié)注入凝血酶后24～48 h腦水腫達(dá)到高峰;而注入濃縮紅細(xì)胞后2 d內(nèi)亦無(wú)明顯腦水腫跡象，但3 d后腦組織含水量明顯增加。提示凝血酶在早期腦水腫發(fā)生中起作用，而紅細(xì)胞則在晚期腦水腫發(fā)生中起作用，二者起效時(shí)間不同。凝血酶的神經(jīng)毒性作用主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面:①注入基底節(jié)區(qū)后可引起腦水腫;②血凝塊中凝血酶原轉(zhuǎn)化成凝血酶的數(shù)量隨腦水腫程度加強(qiáng)而逐漸增加;③特異性凝血酶抑制劑對(duì)腦出血后腦水腫形成有抑制和減弱作用。實(shí)驗(yàn)表明，凝血酶濃度為l U/mL時(shí)可增加腦組織水含量，10 U/mL時(shí)會(huì)明顯增加患者病死率。另有研究［9］表明，脊髓和腦組織中存在很多凝血酶結(jié)合位點(diǎn)，凝血酶濃度在50 pmol/L～50 nmol/L時(shí)可有效保護(hù)腦細(xì)胞，＞50 nmol/L時(shí)則會(huì)損傷腦細(xì)胞;對(duì)于腦內(nèi)血腫，用小劑量凝血酶進(jìn)行預(yù)處理可縮小缺血范圍［10］，保護(hù)腦細(xì)胞、減小腦血腫體積［11］。同時(shí)，小劑量凝血酶還能激活神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞上的TR、阻止細(xì)胞凋亡。

2.2 引發(fā)腦水腫 凝血酶引發(fā)腦水腫的途徑包括血管源性和細(xì)胞毒性兩種，前者主要發(fā)生在腦出血24 h后，因正常生理狀態(tài)下BBB阻止了部分大分子物質(zhì)通過(guò)血管壁進(jìn)入腦組織，一旦血管的通透性增強(qiáng)，血漿成分會(huì)經(jīng)由血管壁滲出，進(jìn)入到腦組織間隙后引發(fā)血管源性腦水腫［12］;后者主要發(fā)生于腦出血后24 h內(nèi)，由凝血酶破壞BBB所致。凝血酶特異性抑制劑水蛭素能明顯減輕腦水腫程度。研究表明，通過(guò)肝素化保持自體血液不凝固引發(fā)的腦水腫與其他性質(zhì)腦水腫不同，表現(xiàn)為24 h內(nèi)血腫周圍未出現(xiàn)水腫。血細(xì)胞膜上磷脂的實(shí)際釋放速度可能會(huì)控制凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶的進(jìn)程，并控制凝血酶的實(shí)際釋放速度，整個(gè)控制過(guò)程達(dá)數(shù)小時(shí)，即血細(xì)胞破壞的速度會(huì)直接影響凝血酶產(chǎn)生速度。因此，腦部受損后的第一個(gè)24 h內(nèi)，腦細(xì)胞破壞率增加促進(jìn)產(chǎn)生更多的凝血酶、引起磷脂聚集增加，從而加重腦水腫;而腦水腫和腦細(xì)胞死亡是因?yàn)榇髣┝磕?＞5 U)破壞BBB引起，提示凝血酶是一種神經(jīng)毒性介質(zhì)［13］。水通道蛋白4(AQP-4)是腦組織中分布最廣、含量最多的水通道蛋白。凝血酶可上調(diào)AQP-4表達(dá)，進(jìn)而增加水分子快速跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，從而加重腦水腫;向腦內(nèi)注射一定量凝血酶可增加注射點(diǎn)周圍組織AQP-4表達(dá)，且其表達(dá)變化與腦組織含水率變化一致［14］。

2.3 破壞BBB Lee等［6］發(fā)現(xiàn)，在大鼠基底節(jié)區(qū)注射凝血酶后3H標(biāo)記的α-氨基異丁酸表達(dá)升高，認(rèn)為凝血酶可破壞BBB、引發(fā)腦細(xì)胞死亡，但通常不影響腦血流。因此，腦水腫形成的誘因?yàn)锽BB破壞和凝血酶的神經(jīng)毒性作用;凝血酶還可劑量依賴性增加血管內(nèi)皮細(xì)胞層通透性。Nagy等發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)液中加入凝血酶后人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞立即收縮、細(xì)胞間隙擴(kuò)大，去除凝血酶后半小時(shí)細(xì)胞恢復(fù)正常形態(tài)，認(rèn)為上述變化是凝血酶改變了BBB的通透性所致;早期腦水腫可由細(xì)胞毒性引發(fā)，后期則是由BBB遭到破壞所致?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)能分解細(xì)胞外基質(zhì)、破壞腦細(xì)胞的基底膜，從而破壞BBB的完整性;對(duì)于高血壓腦出血患者，凝血酶可能通過(guò)激活血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，使MMP-9、MMP-2表達(dá)增加，進(jìn)而損壞BBB的完整性［15］。

2.4 腦血管毒性 腦血管容易受到凝血酶的雙重作用。低濃度凝血酶的內(nèi)皮依賴性和快速減敏作用可引起血管擴(kuò)張，可能機(jī)制為內(nèi)皮細(xì)胞受刺激后產(chǎn)生內(nèi)皮源性舒張因子［16］，激活血管平滑肌細(xì)胞中鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶，使cGMP濃度升高、平滑肌松弛;高濃度凝血酶則可使血管發(fā)生持久而緩慢的收縮，細(xì)胞外鈣離子濃度變化可能與此有關(guān)。高血壓患者發(fā)生腦出血后，血腫周圍腦組織的血流短暫下降，且血流速度與腫塊大小有關(guān);腦缺血的程度與時(shí)間決定高血壓腦出血后腦梗塞程度;猴類腦組織血流下降至10～12 mL/(100 g·min)數(shù)小時(shí)后才會(huì)慢慢出現(xiàn)腦梗塞，血流長(zhǎng)時(shí)間維持在25 mL/(100 g·min)時(shí)則不會(huì)出現(xiàn)腦梗塞。因此，人腦出血后局部腦血流下降可能與凝血酶無(wú)明顯相關(guān)。

3 抗凝血酶治療在腦出血中的應(yīng)用

3.1 內(nèi)源性凝血酶抑制劑 抗凝血酶治療對(duì)腦出血預(yù)后有積極意義，內(nèi)源性凝血酶抑制劑主要包括纖溶酶原激活物抑制劑1和蛋白酶連接素1等。其中蛋白酶連接素1為腦內(nèi)所特有的高效凝血酶抑制劑，主要由腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞分泌，可與凝血酶形成復(fù)合物后結(jié)合于膠質(zhì)細(xì)胞表面。纖溶酶原激活物抑制劑1主要由內(nèi)皮細(xì)胞分泌，在腦組織內(nèi)廣泛表達(dá)，能快速、高效抑制纖溶酶原激活物及尿激酶，其在高血壓腦出血后患者體內(nèi)的水平變化與凝血酶有關(guān)［17］，且可通過(guò)拮抗凝血酶的毒性作用保護(hù)腦組織。研究［18］發(fā)現(xiàn)，大腦中動(dòng)脈阻塞患者纖溶酶原激活物抑制劑1水平顯著降低，可用于指導(dǎo)溶栓藥物的安全應(yīng)用。

3.2 外源性凝血酶抑制劑 主要包括alpha-NAPAP(人工合成)、水蛭中提取的水蛭素和肝素等。肝素抑制凝血酶的機(jī)制有三種:一是與凝血因子Ⅲ結(jié)合形成復(fù)合物，抑制凝血酶及其他凝血因子;二是與陰離子結(jié)合位點(diǎn)和凝血酶的催化位點(diǎn)結(jié)合;三是可能增強(qiáng)腦內(nèi)纖溶酶原激活物抑制劑1和蛋白酶連接素1的作用。水蛭素是從天然水蛭中提取的、目前作用最強(qiáng)的凝血酶特異性抑制劑，可通過(guò)非共價(jià)鍵與凝血酶的催化位點(diǎn)及陰離子外位點(diǎn)結(jié)合。目前，人們已經(jīng)合成了多種凝血酶的抑制劑。

綜上所述，凝血酶在腦出血后腦水腫等病變發(fā)生中具有一定作用，但其毒性作用的分子機(jī)制尚不明確;抗凝血酶治療可能是防治腦出血后繼發(fā)性腦損傷的有效措施之一。

［1］Di Cera E，Cantwell AM.Determinants of thrombin specificity［J］.Ann N Y Acad Sci，2001，936(1):133-146.

［2］Silva Y，Leira R，Tejada J，et al.Molecular signatures of vascular injury are assaciated with early growth of intracerebral hemorrhage molecular signatures of vascular injury are associated with early growth of intracerebral hemorrhage［J］.Stroke，2005，36(1):86.

［3］Reymann KG.Increase of prothrombin-mRNA after global ischemia in rats，with constant expression of protease nexin-1 and proteaseactivated reception［J］.Neurosci Lett，2002，329(2):181-184.

［4］Gabazza EC，TaguchiO，Kamada H，etal.Progress in the understanding of protease-activated receptors［J］.Int JHematol，2004，79(2):117.

［5］Kawabata A.Gastrointestinal functions of protease-activated receptors［J］.Life Sci，2003，74(2-3):247.

［6］Lee KR，Betz AL，Kim S，et al.The role of the coagulation cascade in brain edema formation after intracerebral hemorrhage［J］.Acta Neurochir(Wien)，1996，138(4):396-400.

［7］XiG，Keep RF，Hoff JT.Erythrocytes and delayed edema formation following intracerebral hemorrhage in rates［J］.Neurosurg，1998，89(6):991-996.

［8］李現(xiàn)亮，崔才三.自發(fā)性腦出血后腦水腫形成機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.山東醫(yī)藥，2006，46(10):74-75.

［9］XiG，Keep RF，Hoff JT.Mechanismsof brain injury after intracerebral hemorrhage［J］.Lencet Neurol，2006，5(1):53-63.

［10］Matsuoka H，Hamada R.Role of thrombin in CNSdamage associated with intracerebral haemorrhage opportunity for pharmacological intervention［J］.CNSDrugs，2002，16(8):509-516.

［11］Masada T，Hua Y，XiG，etal.Overexpression of interleukin-1 receptor antagonist reduces brain edema induced by intracerebral hemorraghe and thrombin［J］.Acta Neurochir Suppl，2003，86 (Suppl):463-467.

［12］李鑫，季楠，趙元立，等.自發(fā)性腦出血后繼發(fā)腦水腫嚴(yán)重程度的影響因素［J］.山東醫(yī)藥，2008，48(28):13-15.

［13］Guo H，Liu D，Gelbard H，etal.Activated protein C preventsneuronal apoptosis via protease activated receptors land 3［J］.Neuron，2004，41(4):563.

［14］代大偉，王德生，蔡軍，等.鼠腦內(nèi)注射凝血酶后水通道蛋白4的表達(dá)變化［J］.中國(guó)臨床康復(fù)，2006，10(30):87.

［15］江漢秋，劉群，劉瑾，等.凝血酶對(duì)大鼠腦內(nèi)MMP-9、MMP-2表達(dá)的影響［J］.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2006，23(1):76.

［16］Jerius H，Beall A，Woodrum D，et al.Thrombin-induced vasospasm:cellular signaling mecchanisms［J］.Surgery，1998，123 (1):46-50.

［17］Hua Y，Xi G，Keep RF，et al.Plasminogen activator inhibitor-1 induction after experimental intracerebral hemorrhage［J］.Cereb Blood Flow Metab，2002，22(1):55-61.

［18］Ribo M，Montaner J，Molina CA，al.Admission fibrinolytic profile isassociated with symptomatic hemorrhagic transformation in stroke patients treated with tissue plasminogen activator［J］.Stroke，2004，35(9):2123-2127.