凝血酶GPIb-Ⅸ-Ⅴ受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究進(jìn)展

石 鑫 宋 麗 蘇 琦 劉雅文程 熠

(吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院心血管診治中心，吉林 長(zhǎng)春 130021)

凝血酶與血小板上凝血酶受體結(jié)合，是血小板激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要環(huán)節(jié)〔1，2〕。凝血酶受體包括:蛋白酶激活受體1(protease-activated receptor 1，PAR1)、PAR4〔3〕和血小板糖蛋白 IbⅨ-Ⅴ(GPIb-Ⅸ-Ⅴ)復(fù)合體。GPIb-Ⅸ-Ⅴ復(fù)合體是表達(dá)在血小板膜表面的膜受體，凝血酶高親和力結(jié)合位點(diǎn)位于GPIbα上，凝血酶與GPIbα結(jié)合可促進(jìn)血小板對(duì)低濃度凝血酶的反應(yīng)〔4〕。研究凝血酶與血小板上凝血酶受體的相互作用，以及凝血酶誘導(dǎo)的血小板激活過(guò)程對(duì)于深入了解止血及血栓形成和血栓疾病的發(fā)病機(jī)制有極其重要的意義。

1 GPIb-Ⅸ-Ⅴ受體與凝血酶結(jié)構(gòu)

1.1 GPIb-Ⅸ-Ⅴ受體的結(jié)構(gòu) 每個(gè)血小板上大約有25000個(gè)GPIb-Ⅸ-Ⅴ受體。血小板GPIb-Ⅸ-Ⅴ受體由四種不同的多肽鏈構(gòu)成，分別為GPIbα，GPIbβ(GPIbα與GPIbβ通過(guò)二硫鍵共價(jià)連接)，GPIX，GPV。GPIb，GPIX，GPV 的分子數(shù)之比為 2∶2∶1〔5〕。

1.2 凝血酶的結(jié)構(gòu) 凝血酶是在凝血瀑布級(jí)聯(lián)反應(yīng)中重要的蛋白酶，它既可將血液循環(huán)中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，又是血小板活化的強(qiáng)效激動(dòng)劑〔1，6〕。凝血酶由一個(gè)含36個(gè)殘基的A鏈和一個(gè)含259個(gè)殘基的B鏈組成。凝血酶包含一個(gè)催化活性位點(diǎn)及二個(gè)識(shí)別結(jié)構(gòu)域(exositeⅠ和exositeⅡ)〔7〕。凝血酶的exositeⅠ和exositeⅡ都是血小板 GPIb-Ⅸ-Ⅴ受體GPIbα亞基的作用位點(diǎn)。凝血酶exositeⅠ與GPIbα可能存在較弱的作用。水蛭素通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)凝血酶exositeⅠ，抑制凝血酶與GPIb的結(jié)合，化學(xué)修飾或用水蛭素封閉exositeⅠ可降低凝血酶誘導(dǎo)的血小板5-羥色胺釋放及聚集〔8〕。然而，由于對(duì)exositeⅠ定點(diǎn)突變研究較少，exositeⅠ與GPIbα的相互作用尚待進(jìn)一步研究。肝素和凝血酶原片段2可與exositeⅡ結(jié)合，它們干擾凝血酶與血小板GPIbα的結(jié)合〔9〕;加之，凝血酶exositeⅡ突變體降低凝血酶與GPIb結(jié)合，這些都表明exositeⅡ是凝血酶識(shí)別GPIb的重要結(jié)構(gòu)域。

1.3 GPIbα 與凝血酶復(fù)合體的結(jié)構(gòu) Celikel〔10〕和 Dumas等〔11〕研究了GPIbα片段和凝血酶復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)。GPIbα-凝血酶復(fù)合體主要以1∶1形式存在，但雙方在凝血酶exosites和GPIbα之間的相互作用的認(rèn)識(shí)存在差異。Dumas等人認(rèn)為凝血酶exositeⅠ的相互作用主要是極性的，而Celikel等則認(rèn)為是疏水作用。在Celikel等研究的結(jié)構(gòu)中，exositeⅠ的相互作用包括GPIbα的硫酸化酪氨酸，而在Dumas等研究的結(jié)構(gòu)中并不包括。此外，雙方關(guān)于主體GPIbα的陰離子區(qū)的位置卻是完全不同的。不過(guò)，雙方都認(rèn)為GPIbα陰離子區(qū)和凝血酶exositeⅡ之間存在較強(qiáng)的相互作用。GPIbα的Tyr276-Tyr279序列都與凝血酶exositeⅡ相互作用，Leu275在定位硫酸化Tyr276的側(cè)鏈起作用。定點(diǎn)突變研究發(fā)現(xiàn):GPIbα的Leu275-Tyr279序列與exositeⅡ中6個(gè)氨基酸殘基中的5個(gè)相互作用。

當(dāng)幾個(gè)凝血酶分子結(jié)合到多聚纖維蛋白表面，凝血酶exositeⅠ和exositeⅡ交替與GPIbα相互作用促使GPIbα發(fā)生交聯(lián)。對(duì)應(yīng)GPIbα Tyr276-Tyr279區(qū)外的多肽能夠阻止GPIbα受體交聯(lián)，但不能通過(guò)凝血酶exositeⅡ抑制GPIbα與凝血酶的相互作用，這正是這些多肽不能抑制凝血酶的結(jié)合但能抑制血小板聚集的原因，敲除GPV可促進(jìn)GPIbα二聚體化〔12〕。由此可見(jiàn)，GPIbα的交聯(lián)是由凝血酶和GPIbα相互作用引起信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需。

2 凝血酶與GPIb-Ⅸ-Ⅴ受體的相互作用

2.1 凝血酶與GPV的相互作用 GPV是血小板表面的凝血酶底物〔13〕，是凝血酶誘導(dǎo)的血小板激活的重要調(diào)控因子〔14〕，在凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集的早期，凝血酶切割GPV鏈Arg460和Gly461〔15〕，凝血酶誘導(dǎo)的血小板最大激活常伴隨＞1%的GPV水解〔16〕。

2.2 凝血酶與GPIbα的相互作用 GPIb-Ⅸ-Ⅴ復(fù)合體的配體結(jié)合區(qū)主要位于GPIbα鏈的N-末端的球狀區(qū)，這是通過(guò)GPIbα合成肽、蛋白水解片段及定點(diǎn)突變體證實(shí)的。對(duì)應(yīng)GPIbα負(fù)電荷區(qū)域的多肽不但會(huì)抑制凝血酶結(jié)合，也會(huì)抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集。對(duì)應(yīng)GPIbα負(fù)電荷區(qū)域的上游區(qū)域(Phe247-Thr265)的多肽也會(huì)抑制GPIbα與凝血酶結(jié)合，盡管程度會(huì)低一些;然而，這種多肽對(duì)凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集無(wú)影響。GPIbα的Phe216-Thr240殘基組成的多肽可抑制凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集，但不會(huì)抑制凝血酶與GPIbα結(jié)合。因此，GPIbα的負(fù)電荷區(qū)域是凝血酶的結(jié)合位點(diǎn)〔17〕。

GPIbα的負(fù)電荷區(qū)域包含三個(gè)硫酸化的酪氨酸殘基(Tyr276，Tyr278，Tyr279)，酪氨酸殘基的硫酸化是 GPIbα 與凝血酶相互作用的基礎(chǔ)。加之，水蛭素、凝血因子V及纖維蛋白的酪氨酸硫酸化也有利于它們與凝血酶結(jié)合。這提示，凝血酶傾向與酪氨酸殘基硫酸化的蛋白相互作用。

2.3 少于5%的GPIbα受體結(jié)合凝血酶 凝血酶與GPIbα結(jié)合是凝血酶GPIb-Ⅸ-Ⅴ受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的前提，然而只有少于5%的GPIbα受體結(jié)合凝血酶。研究發(fā)現(xiàn):部分GPIb-Ⅸ-Ⅴ復(fù)合體位于脂筏上，脂筏的破壞導(dǎo)致無(wú)催化活性的凝血酶誘導(dǎo)的GPIb介導(dǎo)的血小板的黏附急劇減少〔18〕。膽固醇的存在和受體簇集是脂筏的兩大特征。通過(guò)增加膽固醇的富集及減少膽固醇消耗，血小板上凝血酶的高親和位點(diǎn)數(shù)增加;GPIbα受體交聯(lián)體現(xiàn)脂筏信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體簇集特性，GPIb-Ⅸ-Ⅴ復(fù)合體是否定位于脂筏是GPIbα受體交聯(lián)和凝血酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的必要條件。這可能是只有少于5%的GPIbα受體在血小板膜上是凝血酶高親和力受體的原因〔19〕。

此外，GPIbα胞質(zhì)尾部通過(guò)細(xì)絲蛋白與血小板膜骨架連結(jié)，對(duì)GPIb-VWF相互作用有很強(qiáng)的負(fù)調(diào)節(jié)作用〔20〕。因此，游離的GPIbα和與血小板膜骨架連結(jié)的GPIbα的比例，也為為什么只有少于5%的GPIbα受體在血小板膜上是凝血酶高親和力受體，提供了另一種解釋。但目前尚缺文獻(xiàn)的進(jìn)一步證實(shí)。

3 GPIbα介導(dǎo)的血小板凝血酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

3.1 凝血酶GPIb-Ⅸ-Ⅴ受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的證實(shí) 在低濃度凝血酶的條件下，凝血酶誘導(dǎo)的血小板活化依賴(lài)GPIbα。Ramakrishnan等〔16〕使用敲除GPV的鼠血小板和用蛋白酶酶解消除GPV的人血小板，發(fā)現(xiàn):即使GPIb-Ⅸ-Ⅴ復(fù)合體中沒(méi)有GPV的存在，無(wú)催化活性的凝血酶仍能誘導(dǎo)血小板的信號(hào)，導(dǎo)致血小板的聚集。Soslau等〔21〕研究發(fā)現(xiàn)在PAR1失敏的情況下，凝血酶依賴(lài)于GPIbα并利用纖維蛋白發(fā)揮作用，誘導(dǎo)血小板激活。上述研究結(jié)果進(jìn)一步印證了GPIbα與凝血酶相互作用引發(fā)的血小板激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的存在。

3.2 GPIbα介導(dǎo)的血小板凝血酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 使用無(wú)催化活性的凝血酶可以研究依賴(lài)GPIb而獨(dú)立于PAR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在這種情況下，血小板黏附，致密顆粒分泌，整合素αIIbβ3依賴(lài)血小板相互作用伴隨ADP分泌而同時(shí)發(fā)生。分泌的ADP在GPIb介導(dǎo)的血小板活化的過(guò)程中起著主要的作用，而環(huán)腺苷酸(cyclic AMP，cAMP)的濃度又可調(diào)節(jié)GPIb介導(dǎo)的血小板活化。參與這一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的激酶包括:磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)、Src 家族激酶(Src family kinases，SFKs)和蛋白激酶 C(protein kinase C，PKC)〔22〕。使用 PI3K和PKC抑制劑抑制血小板相互作用和蛋白酪氨酸磷酸化的結(jié)果表明:PKC的激活是GPIb介導(dǎo)的血小板凝血酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要環(huán)節(jié)。Dubois等〔23〕研究表明在PAR1和PAR4失敏的情況下，凝血酶和GPIbα結(jié)合也可引起纖維蛋白依賴(lài)的血小板聚集，這一過(guò)程涉及Rho激酶(Rho kinase)和p160 Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶(p160 Rho associated coiledcoil forming protein kinase，p160ROCK)的激活，絲裂原活化蛋白激酶激酶-1(mitogen-activated protein kinase kinase1，MEK-1)磷酸化和踝蛋白(talin)切割。

4 GPIbα與其它受體的相互作用

GPIbα與其它受體的相互作用也是凝血酶GPIb-Ⅸ-Ⅴ受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要組成。由于蛋白酶酶解消化的血小板或巨大血小板綜合征〔24〕患者的血小板，缺少GPIb-Ⅸ-Ⅴ受體或具有喪失功能的GPIb-Ⅸ-Ⅴ受體，這些血小板都不能與低濃度凝血酶反應(yīng)。加之，GPIbα與凝血酶的結(jié)合先于凝血酶對(duì)PAR1的水解〔25〕。Furman等〔26〕研究還發(fā)現(xiàn) PAR1的41個(gè)氨基酸裂解肽(TR1-41)可引起從血小板表面到表面連接的小管系統(tǒng)GPIb、GPIX、GPV的重分配，從而負(fù)調(diào)節(jié)血管性血友病因子(VWF)和凝血酶與GPIbα結(jié)合位點(diǎn)。Lova等〔27〕研究表明凝血酶或選擇性激活肽激活PAR1和PAR4，刺激磷脂酶C、酪氨酸激酶和小GTP酶Rap1b，可促進(jìn)肌動(dòng)蛋白聚合和細(xì)胞骨架重組。但是當(dāng)血小板PAR1和PAR4失敏時(shí)，高濃度的凝血酶不能激活Rap1b，但可激活磷脂酶C。一旦金屬蛋白酶mocarhagin水解GPIbα，這些事件將被中止。這提示，GPIbα對(duì)凝血酶激活PAR具有輔助作用。

此外，Sun等〔28〕通過(guò)使用酵母雙雜交系統(tǒng)和誘變因素發(fā)現(xiàn)GPIbα和FcγⅡA受體可相互作用，GPIbα殘基 Arg542Gly543Arg544與FcγⅡA受體Asp298Asp299Asp300是主要的相互作用位點(diǎn)，并證實(shí)GPIb-Ⅸ-Ⅴ引起血小板活化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路部分是通過(guò)FcγⅡA受體介導(dǎo)。

5 結(jié)語(yǔ)

越來(lái)越多的證據(jù)表明GPIb-Ⅸ-Ⅴ復(fù)合體是凝血酶受體，凝血酶與GPIbα相互作用、GPIbα受體交聯(lián)等凝血酶GPIb-Ⅸ-Ⅴ受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究已取得長(zhǎng)足的進(jìn)展。此外，GPIbα與其它受體相互作用提示GPIb-Ⅸ-Ⅴ引起血小板活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的復(fù)雜性。清楚闡釋凝血酶GPIb-Ⅸ-Ⅴ受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和血小板活化，將為預(yù)防和深入認(rèn)識(shí)老年血栓疾病奠定基礎(chǔ)，因此凝血酶GPIb-Ⅸ-Ⅴ受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有待于進(jìn)一步研究。

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