宏基因組16Sr RNA基因靶向測序技術(shù)在手接觸印痕檢驗(yàn)中的應(yīng)用

姚　雪，　裴廣倩，　童貽剛，　羅亞平

(1.中國人民公安大學(xué)刑事科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 北京　100038；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所， 北京　100071)

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宏基因組16Sr RNA基因靶向測序技術(shù)在手接觸印痕檢驗(yàn)中的應(yīng)用

姚雪1，裴廣倩2，童貽剛2，羅亞平1

(1.中國人民公安大學(xué)刑事科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 北京100038；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所， 北京100071)

摘要隨著接觸DNA技術(shù)的迅猛發(fā)展，在刑事案件偵查過程中，從犯罪現(xiàn)場作案人接觸的客體上，能夠提取并檢測出DNA，但是成功率較低。原因是人手接觸物品而遺留在客體上的DNA含量多為痕量，使得該技術(shù)的應(yīng)用存在諸多方面的困難。高通量測序技術(shù)的興起，揭示了人類皮膚微生物組多樣性極其豐富，使得分析皮膚印痕中微生物群落的DNA成為可能。介紹人類皮膚微生物組的研究進(jìn)展，初步分析人類手掌面皮膚上、手印中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征的結(jié)果，提出將該技術(shù)應(yīng)用于偵查辦案的設(shè)想。

關(guān)鍵詞皮膚宏基因組； 16S rRNA基因； 群落結(jié)構(gòu)分析； 痕跡檢驗(yàn)

0引言

人類皮膚微生物組是指所有在人類皮膚上的微小生物，如細(xì)菌、真菌和病毒等。皮膚表面的細(xì)菌密度可達(dá)107個細(xì)胞/平方厘米[1]，且易于在觸摸物體的過程中轉(zhuǎn)移到物體表面[2]。新一代測序技術(shù)的發(fā)展揭示了人類皮膚微生物組的多樣性，使得分析其在個體間的差異成為可能，為法庭科學(xué)人身同一認(rèn)定提供了新的可能的發(fā)展方向[3]。由于針對細(xì)菌有許多系統(tǒng)進(jìn)化數(shù)據(jù)庫可供參考，研究方法也比較成熟[4]，本文介紹了人類皮膚微生物組的研究進(jìn)展，以及利用該技術(shù)分析人類手掌面皮膚上、手印中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征的方法與結(jié)果。

1人類皮膚微生物組

1.1人類皮膚微生物組定義及組成

人類皮膚微生物組是指所有存在于人類皮膚表面、角質(zhì)層內(nèi)、皮脂腺中、毛囊中微生物的總稱，包括細(xì)菌、真菌和病毒等。皮膚微生物組以三維形式分布于皮膚中，而不僅限于皮膚表面[5]。皮膚微生物組主要由4大門類(放線菌門、壁厚菌門、擬桿菌門和變形菌門)組成，在不同身體部位，各門類所占比例不同。在皮脂分泌較多的部位(如前額、耳后、背部、鼻孔壁等)，微生物種類相對較少，在相對干燥的部位(如前臂、手部、臀部)，微生物群落多樣性更豐富[6]。

1.2人類皮膚微生物組的特點(diǎn)

人類皮膚不僅是最大的器官，而且也是一個復(fù)雜的微生物生態(tài)系統(tǒng)。該系統(tǒng)中，不僅不同的微生物之間存在相互作用，微生物與宿主之間也存在相互作用[1]。皮膚微生物組與人之間的相互作用可分為3種類型：寄生、共棲及互利[7]。人類皮膚為特定的微生物種群提供脂類和蛋白質(zhì)作為營養(yǎng)，而各個種類的微生物為了繁衍必須同其他種微生物競爭，以獲得足夠的營養(yǎng)和生長空間。在穩(wěn)定的微生物生態(tài)系統(tǒng)中，各種不同的微生物傾向于形成一種平衡的態(tài)勢，盡量避免群落結(jié)構(gòu)的急劇變化[1]。微生物之間也存在相互作用，如Staphylococcusepidermidis和Propionibacteriumacnes不僅可以產(chǎn)生抗菌素，還可以產(chǎn)生酯酶和脂酶，破壞甘油三酯，釋放脂肪酸，使皮膚表面PH降低，形成不利于病原體生存的環(huán)境[8]。

1.3影響人類皮膚微生物組結(jié)構(gòu)的因素

人類皮膚微生物群落組成的多樣性很高，不同部位對微生物的選擇由皮膚厚度、褶皺、毛囊和腺體密度等因素決定，主要受身體部位、宿主內(nèi)因(如年齡、性別等)、環(huán)境外因(如氣候條件、地理因素、職業(yè)、衣著、抗生素使用)的影響。實(shí)驗(yàn)證明，溫度、濕度、鹽度、PH和UV輻射均能影響皮膚微生物的群落組成[9]。微生物群落多樣性豐富部位(如前臂、腿彎部、肘彎部、足底、指間等)的穩(wěn)定性低于多樣性較低的部位(如腸道、口腔)。個體內(nèi)對稱身體部位的皮膚微生物群落組成差異小于個體間差異，引起個體間差異的因素可能有外部環(huán)境因素(如氣候條件、地理環(huán)境等)及內(nèi)部因素(如宿主免疫狀況、病理生理狀況、UV暴露狀況等)[6,10]。

2人類皮膚微生物群落組成及手印微生物群落組成特征分析

2.1實(shí)驗(yàn)方法

該部分實(shí)驗(yàn)采集的樣品來自一名29歲健康女性左右兩手手掌部及其捺印的掌紋，洗手3 h后采樣(洗手會引起皮膚表面細(xì)菌群落的改變)，采樣前帶塑料手套1 h，然后在潔凈的塑料紙上捺印掌紋(2 min)。 使用棉簽沾取0.1% Tween 20+0.15M NaCl采集樣品，超聲處理后使用Roche High Pure PCR Template Preparation Kit提取DNA。左右兩只手掌面、左右兩只手印共計(jì)提取4份DNA模板。使用Q5 High-Fidelity 2X Master Mix 50 μL體系擴(kuò)增16S rRNA基因v1～v2區(qū)，引物為F27和R338，每份DNA模板擴(kuò)增4份PCR產(chǎn)物。PCR條件為：預(yù)變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s(30個循環(huán))；延伸7 min。PCR產(chǎn)物定量后，根據(jù)濃度高低排序后建3個庫，每個庫內(nèi)均包含左右兩只手掌面、左右兩只手印4種PCR產(chǎn)物。使用Ion torrent PGM測序儀測序，控制數(shù)據(jù)產(chǎn)出量(fastq文件大小)分別為200 M、100 M、50 M。

2.2結(jié)果分析

2.2.1測序結(jié)果總體情況介紹

測序結(jié)果使用QIIME 1.8.0軟件進(jìn)行分析。去除低質(zhì)量序列后根據(jù)97%的序列相似性進(jìn)行OTU的劃分。結(jié)果顯示，在序列條數(shù)少于20 000條時，隨著測序深度增加，樣品中可檢測到的OTU種類呈迅速增加的趨勢，但當(dāng)測序序列的數(shù)目在20 000～40 000條之間時，檢測到OTU種類的增長較為緩慢。測序數(shù)據(jù)達(dá)到40 000條之后就趨于平臺期。因此，在分析此類樣品時，測序序列選擇在30 000～40 000條之間較為合適。

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，從手印樣品中采樣、分析得到的OTU的數(shù)目少于從手掌面上采樣得到的OTU。左手手掌面取樣的微生物群落里最多可檢測到2 005種，右手手掌面的微生物群落里最多可檢測到1 520種，而左手手印和右手手印里最多分別可檢測到1 400種和1 082種。

2.2.2樣品的α多樣性分析

分析結(jié)果顯示，采集自手掌面的樣品，其α多樣性較采集自手印中的樣品更為豐富。從所有樣品獲得的OTU中統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，含量最高的4個屬分別是Ochrobactrum，Propionibaccterium，Staphylococcus及Corynebacterium(見圖1，其中I1，I3，I4號采集于左手手掌，I5，I6，I8是采集于右手手掌，I9，I10，I12采集于左手手印，I13，I15，I16采集于右手手印)。

2.2.3樣品的β多樣性分析

樣品間的群落組成特征分析結(jié)果顯示，左手手掌與左手手印間，加權(quán)unifrac距離最小為0.24，而右手手掌與右手手印間，加權(quán)unifrac距離最小為0.47(見表1)。

表1　樣品間的加權(quán)unifrac距離

圖1　樣品中含量最高的前80種OTU的熱圖

3討論

Fierer等人的研究顯示，人手掌表面微生物的群落組成受性別、左右手習(xí)慣、洗手后時長的影響。參與實(shí)驗(yàn)的51名志愿者雙手上共檢測到4 742種系統(tǒng)發(fā)育型(phylotyes)，平均每人每只手上有156種系統(tǒng)發(fā)育型，同一個體左右手的細(xì)菌群落組成種類中只有17%的系統(tǒng)發(fā)育型相同，而個體間只有13%的系統(tǒng)發(fā)育型相同[11]。在本文的實(shí)驗(yàn)中，隨著測序深度的增加，手掌面皮膚上細(xì)菌的OTU種類可達(dá)2000種以上，說明在做相關(guān)研究的時候，測序深度還是應(yīng)達(dá)到一定的水平才能對皮膚表面微生物群落的組成情況進(jìn)行更加詳盡、真實(shí)的分析。Fierer等通過分析個人電腦鍵盤、鼠標(biāo)上微生物群落的組成特征，將其與使用者相對應(yīng)地聯(lián)系起來[11]。而本文的實(shí)驗(yàn)證明，通過使用恰當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)方法，即使手印中微生物DNA含量較低的情況下，分析其與手掌面皮膚的微生物群落組成的相似性也是可行的。

本文分析結(jié)果顯示，左手手掌與左手手印間的加權(quán)unifrac距離小于右手手掌與右手手印間的加權(quán)unifrac距離?？赡艿脑蛴袃蓚€方面。第一，由于右手是志愿者的優(yōu)勢手，所以與左手相比較，其活動更加頻繁，可能造成手掌面皮膚分泌的汗液、油脂更多，形成更適宜于微生物生存的環(huán)境；第二，右手與左手相比，接觸的外界環(huán)境種類更多，面積更大，因此從其他環(huán)境表面轉(zhuǎn)移至手掌面的微生物種類更多，所以造成右手手印與右手手掌的微生物群落組成的相似性低于左手手印與左手手掌之間的相似性。

4結(jié)論與展望

本文的分析結(jié)果顯示，同一人形成的手印與其手掌面的微生物群落組成在結(jié)構(gòu)特征上有較高的相似性。如果要將該項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于痕跡檢驗(yàn)的實(shí)踐工作中去，還應(yīng)當(dāng)在后期的研究中分析不同人之間的差異性程度，以及同一人隨時間變化是否存在穩(wěn)定性。

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(責(zé)任編輯陳小明)

中圖分類號D918.91

作者簡介姚雪(1986—)，女，山東淄博人，公安大學(xué)公安技術(shù)專業(yè)在讀博士。研究方向?yàn)樾淌驴茖W(xué)技術(shù)。

基金項(xiàng)目北京市科技新星計(jì)劃交叉學(xué)科合作項(xiàng)目(XXHZ201510)；上海市刑事科學(xué)技術(shù)研究院現(xiàn)場物證重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放項(xiàng)目(2014XCWZK14)。