根皮素的微生物轉(zhuǎn)化篩選及消耗率的測定

崔雨，趙艷敏，魏小聰，劉岱琳（1．天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193；．中國人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院，天津30016）

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根皮素的微生物轉(zhuǎn)化篩選及消耗率的測定

崔雨1，2，趙艷敏2，魏小聰2，劉岱琳1，*
（1．天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193；2．中國人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院，天津300162）

摘要：利用反相高效液相色譜法從24種真菌中篩選出對根皮素具有轉(zhuǎn)化作用的菌種并進(jìn)行底物消耗率的測定。色譜條件：Welchrom C(18)色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A相：冰醋酸∶水=2∶98（體積比），B相∶乙腈∶水∶冰醋酸= 80∶19.6∶0.4（體積比），梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；檢測波長：280 nm。根皮素質(zhì)量濃度在0.067 1 mg/mL～1.073 6 mg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y= 3.5×107X + 1.5×106（R2= 0.999 9）。經(jīng)HPLC檢測4種真菌對根皮素有轉(zhuǎn)化作用，當(dāng)液體培養(yǎng)基中根皮素質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL時(shí)，測得培養(yǎng)后底物消耗率分別為60.46 %、43.67 %、91.63 %、40.32 %。該法簡便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可適用于根皮素微生物轉(zhuǎn)化研究中非單一轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的定性和定量分析。

關(guān)鍵詞：根皮素；反相-高效液相色譜；微生物轉(zhuǎn)化；底物消耗率

根皮素（Phloretin）化學(xué)名為3-（4-羥基苯基）-1-（2，4，6-三羥基苯基）-1-丙酮，主要分布于蘋果、梨等水果的果皮及根皮中?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，根皮素具有抗腫瘤[1]、抗炎及免疫抑制[2]、降血糖[3]、心血管保護(hù)[4]、抗氧化、美白[5]等多種生物活性，廣泛應(yīng)用于保健品、藥品、化妝品等行業(yè)，受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[6-8]。

近年來多采用化學(xué)合成的方法[9]對根皮素結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，以期獲得結(jié)構(gòu)新穎活性更好的根皮素衍生物，但截至目前未達(dá)到理想效果。微生物轉(zhuǎn)化是利用微生物細(xì)胞或其所含酶系為反應(yīng)催化劑的生物轉(zhuǎn)化或生物催化技術(shù)，現(xiàn)已作為一種最常見的、有效的生物轉(zhuǎn)化體系廣泛應(yīng)用于天然化合物的生物合成；前體化合物的生物轉(zhuǎn)化；藥用成分篩選及新藥開發(fā)、藥物代謝研究等諸多領(lǐng)域。

文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)目前利用微生物系統(tǒng)對根皮素進(jìn)行轉(zhuǎn)化的研究鮮見報(bào)道。因此本文首次利用反相高效液相色譜法從24種真菌中篩選出對根皮素具有轉(zhuǎn)化作用的菌種并進(jìn)行底物消耗率的測定。本研究將為后續(xù)利用微生物轉(zhuǎn)化方法對根皮素進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾提供試驗(yàn)參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

根皮素標(biāo)準(zhǔn)品（純度為98 %）：天津市科曼思特醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；根皮素試藥（純度為90 %）：天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司；甲醇（分析純）、乙腈（色譜純）：天津市康科德科技有限公司；純凈水：中國人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院自制超純水；24種菌種：中科院微生物菌種庫。

1.2儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；HZQ-QX全溫振蕩器：哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；SB-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士BUCHI公司；SHB-ⅢS循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；FA1204B電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；高效液相色譜儀：日本島津公司；色譜柱Welchrom C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

1.3方法

1.3.1色譜條件

流動相：A相：冰醋酸∶水=2∶98（體積比），B相：乙腈∶水∶冰醋酸=80∶19.6∶0.4（體積比），梯度洗脫程序見表1。進(jìn)樣體積：10 μL；流速：1.0 mL/min；檢測波長：280 nm，柱溫箱溫度：30℃。

表1　HPLC的梯度洗脫程序Table 1 The gradient program of HPLC

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

精密稱取根皮素對照品，加色譜甲醇溶解并定容于25mL容量瓶中，搖勻，制成質(zhì)量濃度為1.342mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3根皮素的微生物轉(zhuǎn)化與分析樣品的制備[10]

將保存于固體斜面培養(yǎng)基的24種真菌分別制成104CFU/mL孢子懸液，接種到100 mL液體土豆培養(yǎng)基中，每種真菌設(shè)置空白組和給藥組，于全溫振蕩器中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：轉(zhuǎn)速160 r/min，培養(yǎng)溫度28℃。培養(yǎng)48 h后，給藥組加入2 mL的根皮素甲醇溶液（質(zhì)量濃度為15 mg/mL），空白組加入2 mL的甲醇試劑。繼續(xù)培養(yǎng)72 h，將轉(zhuǎn)化液分別超聲20 min，減壓抽濾，濾液用等體積的正丁醇萃取3次，萃取液濃縮至干，甲醇溶解并定容于25 mL容量瓶中，搖勻，即得到該菌的給藥樣品溶液和空白樣品溶液，待測。

1.3.4對根皮素具有轉(zhuǎn)化作用的菌種篩選[11-12]

按照“1.3.1”項(xiàng)，每種真菌的給藥樣品溶液和空白樣品溶液分別進(jìn)樣10 μL，對比分析每種菌種的給藥組、空白組及根皮素標(biāo)準(zhǔn)品圖譜，從24種真菌中篩選出對根皮素有轉(zhuǎn)化作用的真菌。

1.3.5對有轉(zhuǎn)化作用的4種真菌進(jìn)行消耗率的測定

將已保存的斜面菌種，在無菌條件下注入無菌水10 mL，刮菌苔，用無菌4層紗布過濾，用力振蕩濾液，制成孢子懸液。經(jīng)血球計(jì)數(shù)板對孢子懸液計(jì)數(shù)，孢子數(shù)數(shù)量級應(yīng)控制在104CFU/mL。因此，4種真菌的孢子懸液濃度近似一致，其具有可比性。分別將此濃度的四種真菌孢子懸液1 mL接入到液體土豆培養(yǎng)基中，其后處理同“1.3.3”。

2　結(jié)果與分析

2.1根皮素含量測定[13-15]結(jié)果

2.1.1系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“1.3.2”中的對照品溶液進(jìn)樣10 μL，注入液相色譜儀中，按“1.3.1”下色譜條件進(jìn)行測定，色譜圖見圖1。

圖1　根皮素的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of phloretin

根皮素的保留時(shí)間為81.451 min，理論塔板數(shù)按根皮素峰面積計(jì)算為370 032，拖尾因子1.237。

2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.5、1.0、4.0、5.0、8.0 mL，置于10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。按“1.3.1”色譜條件分別進(jìn)樣10 μL進(jìn)行測定。以對照品峰面積Y/mAU為縱坐標(biāo)，對照品質(zhì)量濃度X/（mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得根皮素回歸方程為：Y=3.5×107X+ 1.5×106（R2=0.999 9）。結(jié)果表明在0.067 1 mg/mL～1.073 6 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3精密度試驗(yàn)

取“1.3.2”項(xiàng)中的根皮素對照品溶液按照“1.3.1”連續(xù)進(jìn)樣6次，測得根皮素對照品峰面積及RSD值。RSD值為0.88 %，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.1.4穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批樣品，按“1.3.3”中樣品溶液測定方法操作，分別在0、2、4、6、8、10h進(jìn)行測定，其RSD為1.12%，結(jié)果表明樣品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2根皮素微生物轉(zhuǎn)化結(jié)果

2.2.1對根皮素具有轉(zhuǎn)化作用的菌種篩選結(jié)果

按照“1.3.1”色譜條件，將各真菌的給藥樣品溶液與空白樣品溶液分別進(jìn)樣10 μL，把每種真菌的給藥組、空白組及根皮素標(biāo)準(zhǔn)品圖譜進(jìn)行比對，分析給藥組除根皮素峰是否比空白組多出明顯的峰。經(jīng)對比分析，從24種真菌中篩選出4種對根皮素有轉(zhuǎn)化作用的真菌，菌種編號分別為AS 3.2450、AS 3.1858、AS 3.2882、AS 3.510，4種真菌除根皮素峰外比空白都多出了明顯的峰。這4種真菌對根皮素的轉(zhuǎn)化測定的HPLC圖譜見圖2。

圖2　4種真菌對根皮素轉(zhuǎn)化的液相圖Fig.2 HPLC of biotransformation of phloretin by four kinds of fungi

2.2.2加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的轉(zhuǎn)化后供試品，分別精密加入相當(dāng)于原供試品質(zhì)量的80 %、100 %、120 %根皮素對照溶液，按“1.3.3”方法制備供試溶液，按“1.3.1”色譜條件分別進(jìn)樣測量峰面積，計(jì)算測得量及其回收率，結(jié)果見表2。

表2　根皮素的加樣回收率Table 1 Results of phloretin recovery

由表2可知，加樣回收率分別為101.2 %、103.7 %、103.2 %，平均回收率102.7 %，RSD值為1.30。試驗(yàn)結(jié)果表明，加樣回收率良好。

2.2.3重現(xiàn)性試驗(yàn)

按照“1.3.1”的色譜條件，分別對有轉(zhuǎn)化作用的菌種AS 3.2450、AS 3.1858、AS 3.2882、AS 3.510的加藥樣品進(jìn)行液相分析，每種真菌平行操作6份，測得這4種真菌的剩余根皮素峰面積的RSD值分別為0.72 %、0.86 %、1.29 %、1.68 %，結(jié)果表明重現(xiàn)性良好。

2.2.4培養(yǎng)基中根皮素回收率的測定

分別向4組液體土豆培養(yǎng)基中加入2 mL根皮素甲醇溶液（質(zhì)量濃度為15 mg/mL），按照“1.3.3”樣品的制備方法培養(yǎng)，萃取，減壓濃縮至干，用色譜甲醇溶解并定容于25 mL容量瓶中。分別取適量用0.45 μm濾膜過濾，進(jìn)樣10 μL，測得根皮素的峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算出根皮素的含量。根皮素的回收率/%=根皮素質(zhì)量/加藥量×100，結(jié)果見表3。

表3　培養(yǎng)基中根皮素的回收率Table 3 The loss of phloretin in medium（n=3）

由表3可知，培養(yǎng)基中根皮素的平均回收率為69.68%。該法能夠準(zhǔn)確測定培養(yǎng)基中根皮素的回收率。

2.2.5根皮素消耗率的測定

分別取4種真菌的給藥組供試液適量，在“1.3.1”色譜條件下進(jìn)樣分析，測得根皮素平均峰面積（n=3），根據(jù)回歸方程求得剩余的根皮素的質(zhì)量，算出消耗率。消耗率/%＝（加藥量－剩余量/回收率）/加藥量×100，結(jié)果見表4。

表4　根皮素消耗率結(jié)果Table 4 The results of consumption rate

由表4試驗(yàn)結(jié)果顯示，本試驗(yàn)所篩選出的4種真菌對根皮素有一定的消耗作用，但若要獲得該些菌種生物轉(zhuǎn)化根皮素的最優(yōu)條件，有待于更進(jìn)一步研究。

3　討論

1）通過試驗(yàn)確定4種真菌（菌種編號分別為：AS 3.2450、AS 3.1858、AS 3.2882、AS 3.510）對根皮素具有轉(zhuǎn)化作用，并利用HPLC法測定其消耗率，為深入研究其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)。當(dāng)液體培養(yǎng)基中底物濃度為0.3 mg/mL時(shí)，利用RP-HPLC法測定了4種真菌對根皮素的消耗率分別為60.46 %，43.67 %，91.63 %，40.32 %。試驗(yàn)結(jié)果顯示不同菌種對根皮素的消耗率存在差異性，其原因可能是菌種自身代謝酶的差異。

2）在微生物轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中，菌種的篩選一般選用TLC法，該方法簡便但靈敏度低。作者通過HPLC法對根皮素微生物轉(zhuǎn)化進(jìn)行檢測，簡便快速、靈敏、準(zhǔn)確。

3）對比加藥組和空白組的液相圖譜，理論上兩組圖譜除根皮素及轉(zhuǎn)化峰外應(yīng)該和空白組圖譜一致，但是在菌種篩選過程中，有的空白組圖譜中的色譜峰比給藥組圖譜的峰多，其原因可能是加入根皮素對真菌的生長有所影響，所以和空白組有一定的差別。同時(shí)，培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)條件（溫度、搖床轉(zhuǎn)速）、轉(zhuǎn)化時(shí)間、底物加入量等對微生物轉(zhuǎn)化的影響也是很大的，這些因素不僅影響消耗率，還可能對轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的種類有所影響。在后續(xù)研究過程中，本課題組將深入研究根皮素的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物及轉(zhuǎn)化條件，以期獲得該菌株生物轉(zhuǎn)化根皮素的最優(yōu)條件。

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Biotransformation Screen of Phloretin and Determination of Consumption Rate

CUI Yu1，2，ZHAO Yan-min2，WEI Xiao-cong2，LIU Dai-lin1，*
（1. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2. Logistics College of Chinese People's Armed Police Forces，Tianjin 300162，China）

Abstract：To study 24 species of fungi on the transformation of phloretin and determine the consumption rate of activated fungi by RP-HPLC. The biotransformation reactions of phloretin were identified by RP-HPLC. The optimum HPLC conditions were as follows：column was Welchrom C(18)（4.6 mm×250 mm，5 μm）. Gradient elution with mobile phase A：HAC∶H2O =2∶98（volume ratio）and mobile phase B：MeCN∶H2O∶HAC=80∶19.6∶0.4 （volume ratio）in the gradient program at a flow rate of 1.0 mL/min was utilized after optimization. The detection wavelength was set at 280 nm. The calibration curve was Y= 3.5×107X + 1.5×106（R2= 0.999 9）with the linear in the range of 0.067 1 mg/mL～1.073 6 mg/mL for phloretin. The results showed that phloretin was biotransformed by four kinds of fungi and the consumption rate were 60.46 %，43.67 %，91.63 %，40.32 % when the concentration of phloretin in medium was 0.3 mg/mL. The results indicated that this detective method was stable and accurate for qualitation and quantitation of the microbial conversation products of phloretin.

Key words：phloretin；RP-HPLC；biotransformation；consumption rate

收稿日期：2015-02-18

*通信作者：劉岱琳（1973—），女（漢），教授，研究方向：天然產(chǎn)物活性成分研究。

作者簡介：崔雨（1990—），女（漢），碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物活性成分研究。

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31201345）；中國博士后基金項(xiàng)目（2014M562674）；天津市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（13JCYBJC24400）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.08.040