利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片原位構(gòu)建“三明治”樣組織工程牙周膜的實(shí)驗(yàn)研究

徐海春，王 偉，徐曉東▲

（1.上海市黃浦區(qū)半淞園社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心口腔科, 上海 200011；2.上海市同仁醫(yī)院口腔科, 上海 200336）

基礎(chǔ)研究

利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片原位構(gòu)建“三明治”樣組織工程牙周膜
的實(shí)驗(yàn)研究

徐海春1，王 偉2，徐曉東2▲

（1.上海市黃浦區(qū)半淞園社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心口腔科, 上海 200011；2.上海市同仁醫(yī)院口腔科, 上海 200336）

目的 探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）膜片與膠原膜構(gòu)建的“三明治”樣結(jié)構(gòu)植入體內(nèi)后牙周膜的再生情況。方法 制備BMSCs細(xì)胞膜片，與膠原膜構(gòu)建夾層結(jié)構(gòu)復(fù)合于牙根表面，植入原位生長，分別于4w和12w取材，利用X片、HE和天狼星紅染色觀察牙周膜的再生情況。結(jié)果 相比單純膠原膜組和空白對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組在牙根與牙槽骨間形成了清晰的軟組織間隙，且有類Sharpey’s纖維存在，即形成了功能性牙周膜。結(jié)論 細(xì)胞膜片-膠原膜-細(xì)胞膜片的“三明治”樣夾層結(jié)構(gòu)可以較好地促進(jìn)牙周膜再生。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；細(xì)胞膜片；牙周膜再生

牙周病越來越成為嚴(yán)重威脅人類健康的常見口腔疾病。隨著干細(xì)胞和組織工程技術(shù)的日益成熟，如何利用牙周組織工程方法實(shí)現(xiàn)真正意義上的牙周組織修復(fù)，已成為近年來研究的熱點(diǎn)。牙周膜是圍繞牙根并連接牙根和牙槽骨的致密結(jié)締組織，脫離了牙周這種特殊環(huán)境，牙周膜既不能發(fā)揮正常的功能，也難以實(shí)現(xiàn)組織再生。本實(shí)驗(yàn)利用雙層干細(xì)胞膜片與膠原膜三層材料構(gòu)建組織工程牙周膜，結(jié)合牙根與牙槽骨之間的原位植入環(huán)境，嘗試原位牙周組織再生，為牙周膜的組織工程重建提供一個(gè)新的思路。

1 材 料 和 方 法

1.1 材 料

比格犬，雌雄不限（某醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）；可吸收醫(yī)用膠原膜（某生物醫(yī)學(xué)工程研究所）；α-MEM 培養(yǎng)基（Gibco）；PBS緩沖液；2.5g/ L胰酶（ Amresco） ；青鏈霉素（Gibco）；胎牛血清（Gemini）；抗壞血酸（Amresco）；DMSO、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、吲哚美辛、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、胰島素（Sigma）；L-谷氨酰胺、異丙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；堿性磷酸酶試劑盒（Sigma）；75%乙醇；酶聯(lián)儀（BDSL）；倒置顯微鏡（Nikon）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo）；切片機(jī)（Leica）；展片機(jī)、烤片機(jī)（AIHUA）。

1.2 方 法

1.2.1 細(xì)胞膜片的制備：無菌條件下抽取比格犬的骨髓約5ml，加入1:1的PBS緩沖液混勻，用比重為1.063的Percoll密度梯度離心法分離犬BMSCs，并在體外進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增。取第3代犬BMSCs胰酶消化制成細(xì)胞懸液，充分離散，調(diào)整其細(xì)胞密度為1×106，均勻接種于100 mm培養(yǎng)皿，加入10 ml成膜誘導(dǎo)培養(yǎng)液（含50 μg/ml抗壞血酸和10%FBS的α-MEM），每3天換液，孵育10-14天后可見培養(yǎng)皿底部出現(xiàn)白色膜樣物質(zhì)，邊緣卷曲，此即為成熟的犬BMSCs細(xì)胞膜片，備用。

1.2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：

1.2.2.1 實(shí)驗(yàn)分組：選用1歲的健康比格犬3只，體重約12 kg。將每只犬的上、下頜兩側(cè)的第一前臼齒，共計(jì)12顆牙隨機(jī)分為空白對(duì)照組、單純膠原膜組和實(shí)驗(yàn)組。

1.2.2.2 動(dòng)物手術(shù)過程：

1.2.2.2.1 實(shí)驗(yàn)牙拔除：3%戊巴比妥鈉30 mg/kg后肢股靜脈注射麻醉動(dòng)物，將其仰臥固定于手術(shù)臺(tái)，常規(guī)消毒鋪巾，分離牙齦，使用牙挺、牙鉗，按照常規(guī)拔牙方法，拔除實(shí)驗(yàn)牙。

1.2.2.2.2 牙根預(yù)處理：磨除牙冠，拔髓針拔除牙髓，根管銼預(yù)備根管，生理鹽水沖洗根管，移入預(yù)冷PBS中，快速轉(zhuǎn)入超凈臺(tái)，無菌PBS反復(fù)沖洗，75%酒精棉球消毒牙根面，尖刀片刮除牙周膜，24% EDTA處理根面2 min，PBS沖洗3遍后自然干燥。

1.2.2.2.3 制備復(fù)合體：細(xì)胞刮刀沿培養(yǎng)皿邊緣小心分離膜片，用無菌鑷進(jìn)行提拉、卷曲，剪取適當(dāng)大小的膠原膜，復(fù)合于兩層細(xì)胞膜片之間，構(gòu)成“三明治”結(jié)構(gòu)，包裹于牙根表面。

1.2.2.2.4 牙再植手術(shù)：無菌條件下，用渦輪機(jī)擴(kuò)大拔牙窩，大小適當(dāng)，使復(fù)合體順利進(jìn)入，且不脫落、移位。牙根就位得當(dāng)，嚴(yán)密縫合牙齦，使牙根不暴露。

術(shù)后動(dòng)物給予青霉素肌肉注射3 d，流質(zhì)喂飼。

1.2.2.3 動(dòng)物處死取材及組織學(xué)檢測：

1.2.2.3.1 取材：術(shù)后4 w 和12 w分別處死動(dòng)物，取犬的上下頜骨，分段切取4 w和12 w的含實(shí)驗(yàn)牙段頜骨，固定于4%多聚甲醛中。

1.2.2.3.2 組織學(xué)檢測：

1.2.2.3.2.1 HE染色：10%乙二胺四乙酸（EDTA）脫鈣，常規(guī)脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，制備石蠟切片，常規(guī)HE染色

1.2.2.3.2.2 天狼星紅染色：二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化至水后，天青石藍(lán)液染色5-10min，蒸餾水洗，天狼星紅飽和苦味酸濃染15-30min，無水乙醇直接分化與脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，在偏振光下觀察新生牙周膜中的膠原纖維。

Ⅰ型膠原纖維：緊密排列，顯示很強(qiáng)的雙折光性，呈黃色或紅色的纖維；

Ⅱ型膠原纖維：顯示弱的雙折光，呈多種色彩的疏松網(wǎng)狀分布；

Ⅲ型膠原纖維：顯示弱的雙折光，呈綠色的細(xì)纖維；Ⅳ型膠原纖維：顯示弱的雙折光的基膜，呈淡黃色。

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)大體過程

實(shí)驗(yàn)中制備的細(xì)胞膜片具有較好的韌性，可以進(jìn)行提拉、卷曲等（圖1A），利于后面實(shí)驗(yàn)應(yīng)用。細(xì)胞膜片成熟后與膠原膜復(fù)合構(gòu)建細(xì)胞膜片-膠原膜-細(xì)胞膜片的“三明治”樣結(jié)構(gòu)，細(xì)胞膜片可以緊密貼合于牙根表面（圖1B）。如圖1C可以看到利用常規(guī)拔牙技術(shù)順利拔除第一前臼齒，拔出后注意保持牙根的無菌狀態(tài)。在牙根原位植入的手術(shù)中，拔牙窩的預(yù)備大小直接影響復(fù)合體進(jìn)入的順利程度，如圖1D就顯示了拔牙窩預(yù)備過小導(dǎo)致復(fù)合體散落的情況，所以這是需要不斷提高的操作步驟，也是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵所在。

圖1 . 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程

2.2 放射學(xué)觀察

比格犬于術(shù)后12w進(jìn)行放射學(xué)觀察，三組X片差異并不明顯：空白對(duì)照組根周影像模糊、稀疏（圖2A）；膠原膜組未見清晰的類似牙周膜影像（圖2B）；實(shí)驗(yàn)組見愈合較好，類似牙周膜影像基本清晰（圖2C）。

圖2 . 術(shù)后12w X線片

2.3 組織學(xué)觀察

實(shí)驗(yàn)組4w時(shí)牙周膜間隙內(nèi)有大量平行纖維穿行，并見新生毛細(xì)血管（圖3C），12w時(shí)見有斜行的纖維插入牙骨質(zhì)，似Sharpey’s纖維穿行（圖3F）；膠原膜組4w時(shí)似有牙周膜間隙形成，不規(guī)則纖維結(jié)締組織充填其中（圖3B），12w時(shí)不規(guī)則纖維結(jié)締組織增多，似有少量類牙骨質(zhì)形成（圖3E）；空白對(duì)照組4w時(shí)不規(guī)則纖維結(jié)締組織剝離于牙根表面，只有少量附著（圖3A），12w時(shí)只有少量不規(guī)則纖維結(jié)締組織與牙根存在連結(jié)，并未附著于牙根表面，未見牙骨質(zhì)（圖3D）。

圖3 . 組織學(xué)觀察（HE×200）

2.4 天狼星紅染色觀察

為進(jìn)一步評(píng)價(jià)新生組織，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了天狼星紅染色，在偏振光顯微鏡下觀察牙周膜纖維排列。實(shí)驗(yàn)組4w時(shí)新生牙周膜中有Ⅰ型膠原（紅色）和較多Ⅲ型膠原（綠色，圖4C），12w時(shí)新生牙周膜主要為Ⅰ型膠原（紅色），斜行纖維插入牙骨質(zhì)內(nèi)，具有Sharpey’s纖維的特征（圖4F，圖5G）；膠原膜組通過偏振光顯微鏡觀察顯示類牙周膜纖維平行排列，不具有Sharpey’s纖維的特征（圖4B），12w時(shí)同時(shí)存在Ⅰ型膠原（紅色）和Ⅲ型膠原（綠色，圖4E）；空白對(duì)照組4w時(shí)見剝離狀態(tài)的纖維存在于牙根與牙槽骨間（圖4A），12w時(shí)少量纖維平行排列，主要是Ⅰ型膠原（紅色，圖4D）。

3 討 論

路[2-4]。

牙周疾病是引起牙周組織缺損，最終導(dǎo)致臨床牙齒缺失的常見原因。多年來，人們一直在尋求能有效增加牙周附著、重建牙周組織的治療方法。牙周骨移植、引導(dǎo)組織再生(guided tissue regeneration,GTR)技術(shù)為牙周病治療和牙周缺損修復(fù)帶來了希望，但在恢復(fù)牙周組織的生理結(jié)構(gòu)和功能上還遠(yuǎn)未達(dá)到所期望的目標(biāo)[1]。而牙周組織工程技術(shù)的引入，為牙周組織再生研究提供了新的思

圖4 . 天狼星紅染色觀察（×200）

圖5 . 12w實(shí)驗(yàn)組再生牙周膜的高倍鏡觀察（G×400）

BMSCs在合適的牙周微環(huán)境和適當(dāng)?shù)纳锎碳ひ蜃拥淖饔孟驴煞只癁檠拦琴|(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞，被認(rèn)為是牙周組織工程中一種較為理想的種子細(xì)胞[5], 且相比牙周膜細(xì)胞群具有來源豐富、取材簡單等優(yōu)勢(shì)[6]，因此本實(shí)驗(yàn)選用BMSCs作為種子細(xì)胞。傳統(tǒng)的將細(xì)胞懸液接種于支架材料植入牙周缺損處的方法細(xì)胞利用率較低，且會(huì)破壞形成的細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞連接蛋白等[7]，而細(xì)胞膜片技術(shù)的出現(xiàn)解決了這些問題。但細(xì)胞膜片易收縮、卷曲，本實(shí)驗(yàn)將支架材料與其復(fù)合使用，不僅對(duì)細(xì)胞膜片起著支持和保護(hù)作用，還可為牙周膜的重建提供一定的空間。

生理情況下，牙周再生的過程是成纖維細(xì)胞通過合成與降解膠原對(duì)牙周膜中的膠原纖維不斷改建，成骨細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞積聚形成牙骨質(zhì)和牙槽骨，新形成的牙周膜纖維被埋在其中，進(jìn)而完成對(duì)牙周組織的功能性重建[8]。此實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的膠原膜具有良好的力學(xué)強(qiáng)度和韌性，生物相容性好，作為組織再生的天然基質(zhì)可直接參與愈合過程，對(duì)創(chuàng)面和血凝塊具有良好的保護(hù)作用，為其提供一個(gè)很好的再生環(huán)境。然后將細(xì)胞膜片與膠原膜聯(lián)合應(yīng)用，互相彌補(bǔ)了不足，可以更好地促進(jìn)牙周組織重建。另外Flores等[9]曾用不同層次的牙周膜細(xì)胞膜片修復(fù)裸鼠牙周缺損，發(fā)現(xiàn)三層細(xì)胞膜片修復(fù)效果更為理想。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)成細(xì)胞膜片-膠原膜-細(xì)胞膜片的“三明治”樣夾層結(jié)構(gòu)，間接增加了細(xì)胞膜片厚度，使其與牙根表面貼附更為緊密，更利于牙周膜的形成，進(jìn)一步證明了該方法的先進(jìn)性和有效性。本實(shí)驗(yàn)中使用膠原膜單獨(dú)植回原位，只是阻擋了上皮細(xì)胞下行生長，對(duì)牙周組織再生僅僅提供生物誘導(dǎo)作用[10]，通過HE染色可以發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組在牙周膜間隙內(nèi)有大量斜行纖維，膠原膜組僅見不規(guī)則排列的纖維結(jié)締組織，空白對(duì)照組中幾乎沒有或僅觀察到少量纖維結(jié)締組織。從放射學(xué)觀察也發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組愈合得最好，有較清晰的牙周膜影像。證明BMSCs細(xì)胞膜片夾層結(jié)構(gòu)具有更好的促進(jìn)牙周膜再生的效果。

實(shí)現(xiàn)牙周組織再生的關(guān)鍵是功能性的牙周纖維（Sharpey’s纖維）斜行插入新生的牙骨質(zhì)。為了更好地觀察牙周纖維的走向，本實(shí)驗(yàn)利用偏振光顯微鏡觀察天狼星紅染色標(biāo)本，實(shí)驗(yàn)組可看到多數(shù)膠原纖維斜行插入新生牙骨質(zhì)，膠原膜組牙周纖維束多平行于牙根表面，空白對(duì)照組再生纖維量少且平行于牙根表面。這提示BMSCs細(xì)胞膜片夾層結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)了真正的再生，可以正常行使咀嚼功能。

總之，本實(shí)驗(yàn)所使用的細(xì)胞膜片技術(shù)保持了細(xì)胞最佳的生物學(xué)活性，與支架聯(lián)合應(yīng)用，互相揚(yáng)長避短，使其具備更好的機(jī)械性能，利于移植細(xì)胞較好地貼附于牙根表面，能夠較好的誘導(dǎo)牙周膜再生。

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Periodontal Regeneration on the Surface of Tooth Root Using BMSCs Sheet Combined with a Sandwich Structure：a Canine Model in Situ

XU Haichun1，WANG Wei2，XU Xiaodong2
(1. Department of Stomatolugy,Bansong Community Health Centre of Huangpu District, Shanghai City, 200011,China; 2. Department of Stomatolugy,Shanghai Tongren Hospital, Shanghai City, 200336,China)

Objective To probe the periodontal ligament regeneration effect of implantation of bone marrow mesenchymal cells（BMSCs）sheet -collagen membrane-BMSCs sheet sandwich complex. Methods BMSCs cell sheet-collagen membrane-BMSCs sheet complexes were compounded on the root surface. All dogs were killed on 4 weeks and 12 weeks after implantation. The periodontal ligament regeneration were observed in radiological means ,HE staining and Sirus-red staining. Results Compared with collagen membrane group and blank control group,there was a clearly periodontal ligament like tissue and Sharpey’s like fibres formation only in test group. Conclustion Cell sheet-collagen membrane-cell sheet sandwich complex can preferably improve the periodontal ligament regeneration.

bone marrow mesenchymal stem cell；cell sheet；extracellular matrix；tissue engineering

徐海春（1978-），女，江蘇南京人，本科，主治醫(yī)師。

徐曉東（1974-），男，浙江鄞縣人，本科，副主任醫(yī)師。