反復(fù)分批式反應(yīng)提高磷脂酰絲氨酸的生產(chǎn)能力

封娟娟，朱南南，鄧楊敏，韓曉玲，張小里，趙彬俠（西北大學(xué)化工學(xué)院，陜西 西安 70069；西安力邦制藥有限公司，陜西 西安 70075）

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反復(fù)分批式反應(yīng)提高磷脂酰絲氨酸的生產(chǎn)能力

封娟娟1，朱南南1，鄧楊敏1，韓曉玲2，張小里1，趙彬俠1
（1西北大學(xué)化工學(xué)院，陜西 西安 710069；2西安力邦制藥有限公司，陜西 西安 710075）

摘要：磷脂酶D（PLD）催化大豆磷脂合成磷脂酰絲氨酸（PS）反應(yīng)是在油-水兩相體系中進(jìn)行的，大豆磷脂（PC）溶于有機(jī)相中，L-絲氨酸溶于水相中，但反應(yīng)過程中產(chǎn)生副產(chǎn)物——膽堿，抑制酶的催化反應(yīng)速率，需及時(shí)移除膽堿。本文主要采用反復(fù)分批式反應(yīng)來解決這一問題。并考察了增大底物PC的濃度，PS的收率大大降低。低底物PC濃度下，添加不同濃度膽堿，轉(zhuǎn)酯速率及PS收率都降低；高底物PC濃度下，采用反復(fù)分批式反應(yīng)去除膽堿，轉(zhuǎn)酯反應(yīng)速率提高38％，PS收率達(dá)67％。研究表明反復(fù)分批式操作是一種生產(chǎn)磷脂的新型工藝，其中PS的生產(chǎn)能力明顯提高，而且重復(fù)10次反應(yīng)后，固定化酶活力仍保持58％，納米SiO2固定化磷脂酶D較好地適用于反復(fù)分批式反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：磷脂酰絲氨酸；固定化磷脂酶D ；反復(fù)分批式反應(yīng) ；膽堿

第一作者：封娟娟（1989—），女，碩士研究生。E-mail juan026juan@163. com。聯(lián)系人：張小里，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樯锎呋^程、催化反應(yīng)工程。E-mail xlzhang@nwu.edu.cn。

磷脂酰絲氨酸（phosphatidyiserine，簡稱PS)是一種稀有磷脂，雖然在人體內(nèi)數(shù)量極其稀少但功能顯著，具有提高大腦機(jī)能、集中注意力、改善記憶力、緩解壓力、促進(jìn)用腦疲勞的恢復(fù)、平衡情緒、修復(fù)大腦損傷等功效[1]。它可影響腦信息的傳遞，并幫助大腦記憶的儲存和讀取，被譽(yù)為繼膽堿和“腦黃金”DHA之后的一大新興的“智能營養(yǎng)素”。

磷脂酰絲氨酸的主要制備途徑有提取法[2]和酶轉(zhuǎn)化法，研究發(fā)現(xiàn)，PS與磷脂酰膽堿（PC）以及磷脂酰乙醇胺（PE）等甘油磷脂產(chǎn)品可互相轉(zhuǎn)化，使得提取工藝復(fù)雜、費(fèi)力。而且由于瘋牛病的原因，提取的PS產(chǎn)品安全性受到質(zhì)疑，因此提取法已處于淘汰邊緣。

與提取法相比，酶轉(zhuǎn)化法[3]工藝簡單、條件溫和、產(chǎn)物收率高、低碳環(huán)保、產(chǎn)品安全，利用磷脂酶D的轉(zhuǎn)磷脂?；匦?，催化PC合成PS，廣泛引起了人們的關(guān)注。然而在磷脂酶D催化大豆磷脂（PC）合成PS的過程中，體系釋放出另一種產(chǎn)物膽堿，其與磷脂酶D相互作用，降低酶的活性，致使反應(yīng)速率減慢，產(chǎn)品收率低。為了最大程度地提高反應(yīng)收率，需將從反應(yīng)混合物中移除膽堿。JUNEJA等[4]曾在該反應(yīng)中加入膽堿氧化酶和過氧化氫酶去除膽堿，但這兩種酶比較昂貴，難以在大規(guī)模的工業(yè)中使用。本文采用反復(fù)分批式反應(yīng)[5]實(shí)現(xiàn)了反應(yīng)混合物中膽堿的移除，進(jìn)而大大提高了反應(yīng)收率。

1　材料與方法

1.1儀器與設(shè)備

臺式恒溫生化搖床，ZHWY-211C，上海智成分析儀器制造有限公司；分析天平，T-114，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)用限公司；掃描儀，Pro800，佳能電器有限公司；薄層展開缸，PQ，上海信儀儀器有限公司；GF254薄層板，由實(shí)驗(yàn)室自制；玻璃毛細(xì)點(diǎn)樣管，0.5mm×100mm，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2試劑與材料

磷脂酶D，由本實(shí)驗(yàn)室保存的鏈霉菌株發(fā)酵制備；大豆磷脂，90％，北京美亞斯磷脂技術(shù)有限公司；氯化膽堿，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；SiO2，30nm，阿拉丁試劑；L-絲氨酸，無錫市必勝化工產(chǎn)品有限公司；其他試劑均為分析純。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1磷脂酶D的固定化

由一株鏈霉菌發(fā)酵制備得的游離磷脂酶D一般為粗酶液?？刹捎靡掖挤旨壋恋矸ㄟM(jìn)行純化[6]：0℃，攪拌條件下，向粗酶液中快速滴加等量冷凍無水乙醇，冷凍離心去沉淀并收集上清液。以相同方式于0℃向清液中補(bǔ)加3倍量的冷凍乙醇，冷凍離心去清液并收集沉淀，反復(fù)多次后，獲得比活力為8.88 U/mg的純化磷脂酶D，達(dá)粗酶液比活力的12倍。

分離純化后的游離磷脂酶D與納米SiO2充分混合，置于搖床內(nèi)吸附反應(yīng)若干小時(shí)。校調(diào)體系pH值至一定值，在0℃、攪拌條件下快速滴加冷凍乙醇進(jìn)行沉淀聚集，聚集后的沉淀與25％戊二醛交聯(lián)劑進(jìn)行反應(yīng)，洗滌后獲得固定化磷脂酶D。

1.3.2磷脂酶D催化合成磷脂酰絲氨酸

固定化磷脂酶D催化大豆磷脂合成磷脂酰絲氨酸的反應(yīng)是在兩相體系中進(jìn)行的，即大豆磷脂溶于有機(jī)溶劑乙醚，L-絲氨酸（PC濃度的100倍，大大過量）溶于0.2mol/L pH值為5.5的乙酸緩沖液。二者混合后加入固定化磷脂酶D，28℃、搖床轉(zhuǎn)速200r/min下在兩相界面上發(fā)生反應(yīng)，對有機(jī)相進(jìn)行間歇取樣，并用薄層色譜（TLC）進(jìn)行分析。

磷脂酶D的轉(zhuǎn)酯活力被定義為：28℃下，單位時(shí)間內(nèi)合成1μmol PS所需的固定化酶量，即為一個(gè)酶活力單位（1U）。

1.3.3抑制劑氯化膽堿的添加

在上述轉(zhuǎn)酯反應(yīng)條件下，設(shè)置幾組平行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究，分別添加不同濃度的氯化膽堿于水相體系中進(jìn)行反應(yīng)，間歇取樣分析，觀測膽堿的抑制作用。

1.3.4反復(fù)分批式反應(yīng)

在上述轉(zhuǎn)酯反應(yīng)條件下，每隔1h將水相從反應(yīng)混合物中分離出來，緩沖液中的固定化磷脂酶D經(jīng)濾紙過濾，并用乙酸緩沖液反復(fù)沖洗3次，回收進(jìn)行二次利用。在反應(yīng)體系中，添加新鮮的L-絲氨酸乙酸緩沖液為新的水相，進(jìn)行第二批次的反應(yīng)。反復(fù)進(jìn)行多次，間歇取樣，進(jìn)行磷脂的測定。

1.4磷脂分析方法

磷脂樣品用TLC檢測分析，GF254硅膠制成薄層板，取樣，點(diǎn)樣，走板，采用氯仿∶甲醇∶水∶乙酸=13∶5∶0.8∶0.8（體積比）的展開劑展開，碘蒸氣染色。染色后用薄層掃描儀掃描，利用Photoshop和Gel-Pro分析儀計(jì)算斑點(diǎn)灰度值，計(jì)算出各種磷脂濃度。

2　結(jié)果與討論

2.1不同底物PC濃度對PS合成的影響

考察不同底物PC濃度對PS合成的影響，由圖1可知，反應(yīng)90min后，當(dāng)?shù)孜颬C濃度為2mmol/L、6mmol/L、10mmol/L時(shí)，PS收率分別為57.34％、43.6％、38％。反應(yīng)3.5h后，3種PC濃度所對應(yīng)最大PS收率分別達(dá)57.34％、48.8％、48.2％。由圖1可知，隨著底物PC濃度的增大，PS的收率由57.34％降低到38％ 。

圖1　不同底物PC濃度對PS合成的影響

2.2不同膽堿濃度對PS合成的影響

在轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的水相中分別添加0、1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L、6mmol/L的氯化膽堿，其中PC濃度為2mmol/L，考察膽堿濃度對PS合成的影響。由圖2可知，初始轉(zhuǎn)酯速率隨著膽堿濃度的增加而呈現(xiàn)減小的趨勢。由于單位質(zhì)量的酶催化磷脂量是一定的，而膽堿的加入會占用酶的立體空間，使底物與酶結(jié)合的概率變小，酶與中間產(chǎn)物不能及時(shí)結(jié)合進(jìn)行下一步反應(yīng)，致使催化反應(yīng)速率會降低。膽堿含量較小時(shí)，抑制作用不明顯，膽堿含量越多，其抑制作用突出，膽堿濃度為6mmol/L時(shí)，速率由100％降至49.4％。

圖2　膽堿濃度對轉(zhuǎn)酯反應(yīng)速率的影響

2.3反復(fù)分批式反應(yīng)合成PS

反復(fù)分批式反應(yīng)指不斷更換水相，即在高PC濃度（10mmol/L）下，移除水相中的膽堿，從而提高催化反應(yīng)速率。由圖3所示，發(fā)現(xiàn)運(yùn)用不同的操作方法，磷脂酶D催化的轉(zhuǎn)酯速率隨著反應(yīng)時(shí)間的推移呈現(xiàn)持續(xù)減小的趨勢，分別在1h和2h換料并添加新的水相的情況下，換料后的催化反應(yīng)速率明顯高于不換料的情況下，即1h時(shí)，反應(yīng)速率增大8.9％，2h時(shí)速率增大38％，兩次換料后PS收率達(dá)67％。

圖3　反復(fù)分批式操作對轉(zhuǎn)酯反應(yīng)速率的影響

2.4固定化PLD在合成PS中的操作穩(wěn)定性

由圖4可知，固定化磷脂酶D在反復(fù)10批次反應(yīng)后，仍保持較高的催化活性，其活力為58％。說明納米SiO2的球狀顆粒能緊鎖住固定在其上的酶分子，使酶的催化性能穩(wěn)定，更好地適用于反復(fù)分批式反應(yīng)。

圖4　固定化PLD重復(fù)使用次數(shù)與酶活力的關(guān)系

3　結(jié)論

增大底物（PC）的濃度，轉(zhuǎn)酯反應(yīng)速率及PS的收率都降低，這可能是發(fā)生了可逆反應(yīng)，或者反應(yīng)過程中生成副產(chǎn)物膽堿，抑制酶的催化活性。本文在低底物PC濃度（2mmol/L）下，添加不同濃度的氯化膽堿，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)速率及PS收率大大降低；在高底物PC（10mmol/L）下，采用反復(fù)分批式反應(yīng)，不斷更換水相，即移除水相中的膽堿，發(fā)現(xiàn)第二次換料后，轉(zhuǎn)酯速率增大38％。這證明在轉(zhuǎn)酯反應(yīng)中副產(chǎn)物膽堿的存在，大大抑制反應(yīng)的進(jìn)行，采用反復(fù)分批式反應(yīng)，去除膽堿，能有效提高PS的生產(chǎn)能力。反復(fù)10批次生產(chǎn)PS后，納米SiO2固定化PLD仍保留58％的相對活力，催化性能穩(wěn)定。反復(fù)分批式反應(yīng)工藝簡單，條件溫和，也可以應(yīng)用于其他稀有磷脂的生產(chǎn)。

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Increasing productivity of phosphatidyserine by repeated batch reaction

FENG Juanjuan1，ZHU Nannan1，DENG Yangmin1，HAN Xiaoling2，ZHANG Xiaoli1，ZHAO Binxia1
（1College of Chemical Engineering，Northwest University，Xi’an 710069，Shaanxi，China;2Xi’an LIBANG Pharmaceutical Company Limited，Xi’an 710075，Shaanxi，China）

Abstract：The synthetic reaction of phosphatidyserine from soybean lecithin catalyzed by immobilized phospholipase D was carried out in oil-water two phase system，with PC and L-serine rich in oil and water phase，respectively. However，the by-product choline restrains the enzyme-catalyzed reaction rate and should be removed in time. In order to solve this problem，we adopted the repeated batch reaction. Increasing the substrate (PC) concentration decreased the yield of PS greatly. When various concentrations of choline chloride were added into the reaction mixture at low PC concentrations，there was a significant decrease in transphosphatidylation rate and the yield of PS. The using of repeated batch reaction was examined at high PC concentration to remove choline，the transphosphatidylation rate increased by 38％，and PS yield was 67％. The paper reported that the repeated batch operation is a novel technology for the synthesis of phosphlipid and increased the productivity of PS significantly. And the immobilized enzyme activity remained 58％ after ten batches and nano-SiO2-immobilized-PLD was suitable for repeated batch reaction.

Key words：phosphatidyserine; immobilized phospholipase D; repeated batch reaction; choline

中圖分類號：TQ 463

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1000–6613（2016）04–1180–04

DOI：10.16085/j.issn.1000-6613.2016.04.034

收稿日期：2015-08-24；修改稿日期：2015-10-21。

基金項(xiàng)目：陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（2014JM2057）。