mTOR/p70S6K信號通路在上皮性卵巢癌組織中的表達及其臨床意義

唐男　張虹

【摘要】 目的：探討mTOR/p70S6K信號通路在上皮性卵巢癌組織中的表達及其臨床意義。方法：采用天津市中心婦產醫(yī)院2011年1-6月手術標本120例，其中正常卵巢組（Ⅰ組）、上皮性良性卵巢腫瘤組（Ⅱ組）、上皮性卵巢癌組（Ⅲ組），每組各40例。免疫組化染色檢測mTOR、p70S6K在上皮性卵巢組織中的表達。反轉錄（RT）-PCR法測mTORmRNA、p70S6KmRNA的表達。采用Kaplan-Meier和log-rank檢驗進行單因素生存分析，比較mTOR、p70S6K蛋白表達水平（陰性、陽性組）的卵巢癌患者的生存率。結果：免疫組化染色顯示：mTOR、p70S6K在Ⅰ組卵巢組織中表達很低，Ⅱ組卵巢組織中表達次之，而在Ⅲ組卵巢組織中卻高表達。與Ⅰ組比較，Ⅱ組、Ⅲ組mTORmRNA、p70S6KmRNA的表達增加，與Ⅱ組比較，Ⅲ組mTORmRNA、p70S6KmRNA的表達增加。非參數(shù)分析顯示，上皮性卵巢癌組織中mTOR、p70S6K蛋白表達水平與手術病理分期（P=0.039、0.022）和病理分級（P=0.047、0.037）相關，與患者年齡、病理類型、腹膜轉移無關（P>0.05）。單因素生存分析顯示，mTOR、p70S6K蛋白的表達陰性與陽性的總生存時間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.021）。結論：mTOR/p70S6K信號通路在上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展、轉移和預后中可能起重要作用。

【關鍵詞】 mTOR； p70S6K； 上皮性卵巢癌

【Abstract】 Objective：To investigate the expression of mTOR/ p70S6K signaling pathways in epithelial ovarian cancer and their significance.Method：120 surgical specimens in Tianjin Center Maternity Hospital from January 2011 to June 2011 were selected，they included the normal ovarian group（group Ⅰ），the epithelial ovarian benign ovarian tumor group（group Ⅱ），epithelial ovarian cancer（group Ⅲ），40 casess in each group.The expression of mTOR，p70S6K in epithelial ovarian tissue was detected by immunohistochemical staining.The expression of mTORmRNA，p70S6KmRNA were detected by Reverse transcription（RT）-PCR method.Using Kaplan Meier and log-rank test of single factor analysis，the mTOR，p70S6K protein expression level（negative and positive group） of ovarian cancer patients survival rate were compared.Result：Immunohistochemical staining showed that mTOR，p70S6K expressed in ovarian tissue of group Ⅰ was very low，the expression of ovarian tissue in group Ⅱ followed by，and it was highly expressed in ovarian tissue of group Ⅲ.The expression of mTORmRNA and p70S6KmRNA in group Ⅱ，Ⅲ were significantly higher than those in the group Ⅰ，and the expression of mTORmRNA and p70S6KmRNA in group Ⅲ were significantly higher than those in the group Ⅱ.Nonparametric analysis showed that the expression level of mTOR，p70S6K in epithelial ovarian cancer were correlated with the surgical pathologic stage（P=0.039，0.022） and pathologic grade（P=0.047，0.037），had nothing to do with patients age，pathological type，peritoneal metastasis.Single factor survival analysis showed that mTOR，p70S6K protein expression of total survival time in negative and positive，the difference was statistically significant（P=0.021）.Conclusion：The higher expressions of mTOR/ p70S6K signaling pathways are related to occurrence，development，metastasis and prognosis of epithelial ovarian cancer.

【Key words】 mTOR； p70S6K； Epithelial ovarian cancer

First-authors address：Tianjin Medical University，Tianjin 300000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.05.001

卵巢惡性腫瘤是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌而列居第三位[1]。但卵巢上皮癌死亡率卻占各類婦科腫瘤的首位，對婦女生命造成嚴重威脅[2]，明確其發(fā)病機制，可為有效治療卵巢上皮癌提供幫助。雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是近年來研究的一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，其可通過整合能量狀態(tài)，激素、細胞、氨基酸、細胞氧化應激等信號，通過影響蛋白質的合成，調節(jié)細胞生長、增殖、凋亡、自噬等多個生物學過程[3]。p70S6激酶（p70S6K）作為mTOR蛋白的下游底物，被磷酸化的mTOR激活后可以調控細胞內p70S6KmRNA的翻譯[4]。研究表明，mTOR/p70S6K信號通路的激活與乳腺癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[5]，但mTOR/p70S6K信號通路是否在上皮性卵巢癌組織中有表達，國內外尚無相關報道。本研究擬探討mTOR/p70S6K信號通路在上皮性卵巢癌組織中的表達及其臨床意義，為卵巢上皮癌的治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 采用天津市中心婦產醫(yī)院2011年1-6月手術標本共120例，其中包括正常卵巢組（Ⅰ組）、上皮性良性卵巢腫瘤組（Ⅱ組）、上皮性卵巢癌組（Ⅲ組），每組各40例。所有病例為初發(fā)，術前未行任何治療且肝腎功能正常，無合并妊娠或近期妊娠史。上皮性卵巢癌組患者年齡為35～70歲。按國際婦產科聯(lián)盟FIGO分期2009年標準：Ⅰ～Ⅱ期14例，Ⅲ～Ⅳ期26例。腹膜轉移27例，無腹膜轉移13例。組織學分級（世界衛(wèi)生組織WHO，2003）：G1級12例，G2級17例，G3級11例。病理類型：漿液性腺癌22例，黏液性腺癌18例。均取卵巢癌原發(fā)灶組織進行試驗。40例上皮性良性卵巢腫瘤標本均為同期在該院手術獲得。對照組為隨機選取的同期圍絕經期女性因子宮肌瘤接受手術要求切除雙附件治療獲得的正常卵巢組織標本，共40例。標本離體5min內經液氮速凍后置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫薪M織用10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋。術后進行隨訪至2015年6月1日。

1.2 試劑 BIOZOL總RNA提取試劑盒（杭州博日科技有限公司），BIORT逆轉錄擴增試劑盒（杭州博日科技有限公司），mTOR引物（上游引物批號02116，下游引物批號02117）、p70S6K弓I物（上游引物批號02118、下游引物批號02119）以及B.actin內參引物（上游引物批號37496、下游引物批號37495）均為上海生工生物工程技術服務有限公司產品，焦碳酸二乙脂（DEPC，BBI公司，批號DB0154）溴化乙錠（EB，TaKaRa公司）瓊脂糖，無水乙醇，DNAMark（DL2000，TaKaRa公司），GeneAmp 5700型PCR儀（美國應用生物系統(tǒng)公司），凝膠電泳成像系統(tǒng)（Transilluminator公司），紫外分光光度計（Cary-50）（澳大利亞Varian公司）。

1.3 免疫組化染色檢測mTOR、p70S6K在上皮性卵巢組織中的表達 參照文獻[6]采用SP法進行免疫組化染：每批染色均設陰性對照。陰性對照采用磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗。以細胞質出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒者為陽性細胞，根據陽性細胞所占百分比及陽性細胞染色強度進行評分，具體如下，（1）陽性細胞所占百分比評分：無陽性細胞者記0分，≤5%者記1分，>5%～25%者記2分，>25%～50%者記3分，>50%者記4分；（2）染色強度評分：未著色記0分，淡黃色記1分，黃色記2分，棕黃色記3分；兩種評分相加為總分：總分0～1分為陰性（-），2～3分為弱陽性（+），4～5分

為中等陽性（++），≥6分為強陽性（+++）。以+～+++為陽性標本，計算陽性表達率。

1.4 反轉錄（RT）-PCR法測mTOR、p70S6KmRNA的表達 按BIOZOL總RNA提取試劑盒說明進行提取組織總RNA，逆轉錄合成cDNA按BIORT逆轉錄擴增（RT-PCR）試劑盒說明進行，引物設計參考文獻[7]，mTOR上游引物為5-CTGGGACTCAAATGTGTGCAGTTC-3，下游引物為5-GAACAATAGGGTGAATGATCCGGG-3，共537 bp，p70S6K上游引物為5-TACTTCGGGTACTTGGTAA-3，下游引物為5-GATGAAGGGATGCTTTACT-3，共188 bp，內參選用β-actin：上游引物為5-TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA-3，下游引物為5-TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3，共302 bp，反應總體積25 μL.10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPMixture（10 mmol/L）0.5 μL，每管加入mTOR上下游引物或者p70S6K上下游引物各0.5 μL，上下游內參各

0.5 μL，Taq mixDNA polymerase0.5 μL，RT產物2.5 μL，

ddH2O 17 μL。PCR反應條件：94 ℃3 rain預變性：94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s和72 ℃ 90 s，共經過35個循環(huán)反應。所得PCR產物在含溴化乙錠的1.5 g/L的瓊脂糖凝膠中電泳分離，然后用凝膠成像系統(tǒng)分析結果。

1.5 隨訪 以電話或來院復查形式對40例卵巢癌患者進行隨訪，隨訪始于卵巢癌確診后，隨訪截止時間為2015年6月，隨訪時間為1～50個月（中位隨訪時間25個月）。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料用（x±s）表示，隨機區(qū)組設計的計量資料采用單因素方差分析，重復測量設計的計量資料采用重復測量設計的方差分析，計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗或Fisher確切概率法、最小顯著差數(shù)法（LSD）檢驗。用Kaplan-Meier法計算生存率，對生存率曲線比較采用log-rank法進行顯著性檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化染色檢測mTOR、p70S6K在上皮性卵巢組織中的表達 從免疫組化染色檢測結果可以看出，mTOR蛋白定位于胞漿，p70S6K蛋白定位于細胞核，在Ⅰ組卵巢組織中表達很低，Ⅱ組卵巢組織中表達次之，而在Ⅲ組卵巢組織中卻高表達。Ⅰ組患者卵巢組織中mTOR、p70S6K蛋白的陽性率表達分別為2.5%、2.5%，Ⅱ組患者卵巢組織中mTOR、p70S6K蛋白的陽性率表達分別為12.5%、20.0%，Ⅲ組患者卵巢漿液性腺癌組織中mTOR、p70S6K蛋白的陽性率表達分別為45.5%、59.1%，黏液性腺癌組織中mTOR、p70S6K蛋白的陽性率表達分別為66.7%、61.1%，詳見圖1～2、表1。

2.2 反轉錄（RT）-PCR法測mTORmRNA、p70S6KmRNA的表達 與Ⅰ組比較，Ⅱ組、Ⅲ組的mTORmRNA、p70S6KmRNA的表達增加，與Ⅱ組比較，Ⅲ組mTORmRNA、p70S6KmRNA的表達增加，見表2。

2.3 mTOR、p70S6K 蛋白表達與上皮性卵巢癌臨床病理參數(shù)的關系 非參數(shù)分析顯示，上皮性卵巢癌組織中mTOR、p70S6K蛋白表達水平與手術病理分期（P=0.039、0.022）和病理分級（P=0.047、0.037）相關，與患者年齡、病理類型、腹膜轉移均無關（P>0.05），見表3。

2.4 mTOR、p70S6K蛋白的表達水平與上皮性卵巢癌患者預后比較 單因素生存分析顯示，mTOR、p70S6K蛋白的表達陰性與陽性的總生存時間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.021），見圖3。

3 討論

目前，卵巢惡性腫瘤死亡率居婦科惡性腫瘤的首位，上皮性卵巢癌約占90%，所以上皮性卵巢癌成為最受關注的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展非常隱匿，通常患者沒有特異性癥狀，僅到病情發(fā)展到一定程度才呈現(xiàn)出腹脹、腹部包塊等癥狀和體征。因此多數(shù)患者確診時已屬晚期，手術和輔助治療的效果不理想，預后差，5年生存率低[8]。所以有必要了解卵巢癌發(fā)生發(fā)展的機制，為尋找遏制腫瘤細胞的致瘤能力的方法奠定基礎。目前，信號傳導系統(tǒng)的缺陷和異?；罨c腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預后的關系已成為腫瘤分子生物學的研究熱點，同時通過干預信號傳導途徑治療腫瘤也成為生物治療的新興領域。

mTOR是一種編碼2549個氨基酸的絲/蘇氨酸蛋白激酶，分子量約289 kDa，其C末端與PI3K的催化結構域具有高度同源性，故而屬于PI3K蛋白家族成員。由于mTOR信號轉導通路在細胞周期進程中發(fā)揮了重要作用，而細胞周期進程的異常調節(jié)與癌癥有關，因此mTOR信號通路在癌癥的發(fā)生、發(fā)展中處于核心地位[9]。Murayama等[10]發(fā)現(xiàn)細胞質中mTOR的表達與胃腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移及腫瘤分期明顯正相關。另有研究報道，在手術切除的胰腺導管癌標本中，胰腺癌細胞中mToR被激活，而且，mToR抑制劑對胰腺癌具有潛在的抗癌活性[11]。綜上可見，mTOR在許多惡性腫瘤組織中高表達，提示mTOR可能參與了惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。

p70S6K作為mTOR下游的主要靶蛋白之一，是mTOR下游底物中目前研究較為廣泛的關鍵調節(jié)因子，具有核糖體蛋白激酶的活性，活化后能夠磷酸化激活核糖體40S小亞基S6蛋白，而S6蛋白可提高含5-TOP的mRNA的翻譯效率[12]，當其第389位蘇氨酸殘基（Thr389）被磷酸化后，活性上升，促進核糖體及其他調節(jié)蛋白的合成，介導細胞生長和增殖[13]，同時，mTOR的主要生物學功能也是通過p70S6K來實現(xiàn)的。因此本研究觀察mTOR和p70S6K蛋白表達。

本研究通過免疫組化染色檢測發(fā)現(xiàn)mTOR、p70S6K在正常上皮性卵巢組織中表達很低，而在上皮性卵巢癌組織中卻高表達；mTOR、p70S6KmRNA的表達增加并且與病理分級相關，其機制可能是上皮性卵巢癌中LKB1激活[14]，使其下游mTOR激活，mTOR是大多數(shù)細胞分裂增殖信號傳導的中樞可以抑制多種刺激誘發(fā)的細胞凋亡，促進細胞周期進展，促進細胞的生存和增殖。mToR信號通路不僅對正常細胞生長增殖起著重要作用，而且與正常細胞向癌細胞轉化以及癌細胞的生長、增殖密切相關，同時參與血管形成，在腫瘤的形成中扮演重要角色，并參與腫瘤的侵襲和轉移[15]。mTOR激活后，使其下游p70S6K激活，促進p70S6KmRNA翻譯活性增強，協(xié)同刺激癌細胞蛋白質及核糖體合成，從而控制細胞從G1期到S期，促進癌細胞生長及增殖[16]。

綜上所述，mTOR/p70S6K信號通路在上皮性卵巢癌組織中的高表達，提示mTOR和p70S6K蛋白可能是一種新的癌基因，其對卵巢癌患者的預后可能有預測價值。該信號通路將可能成為認知和探索上皮性卵巢癌形成機制新的研究方向，以此為靶向的早期干預治療有待進一步的深入研究。

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（收稿日期：2015-07-27） （本文編輯：歐麗）