依諾肝素鈉注射液分子量與分子量分布比較研究

由鵬飛，薛維麗，杭寶健，李春煥，王玉團(tuán)，陳曉，咸瑞卿

(山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 濟(jì)南 250101)

依諾肝素鈉(enoxaparin sodium)屬于低分子肝素類(lèi)(low molecular weight heparin，LMWH)藥物，具有抗血栓作用強(qiáng)、出血風(fēng)險(xiǎn)小的特點(diǎn)[1-2]，主要用于預(yù)防靜脈血栓形成；治療已形成的深靜脈血栓及肺栓塞；預(yù)防血液透析體外循環(huán)時(shí)血栓的形成；與阿司匹林聯(lián)用治療不穩(wěn)定性心絞痛和非Q波心梗等[3]。依諾肝素鈉注射液最早由法國(guó)Aventis公司研制，是目前LMWH藥物中最為暢銷(xiāo)的品種[4-5]。依諾肝素鈉注射液及原料在《英國(guó)藥典》(BP2019)、《美國(guó)藥典》(USP42)均有收錄，《歐洲藥典》(EP10.0)收錄了依諾肝素鈉原料，此外2017年國(guó)家藥典委還公布了依諾肝素鈉注射液及原料的征求意見(jiàn)稿。

分子量與分子量分布與抗凝活性關(guān)系密切[6]，是依諾肝素鈉的重要的質(zhì)控指標(biāo)[7]，目前各生產(chǎn)企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)均采用分子排阻色譜法測(cè)定，但所用對(duì)照品、色譜柱、流動(dòng)相、檢測(cè)器類(lèi)型、限度要求均有所不同，不能有效評(píng)價(jià)樣品的質(zhì)量差異，因此我們以2019年依諾肝素鈉注射液國(guó)家評(píng)價(jià)抽驗(yàn)為依據(jù)，在法定檢驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用原研制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的方法對(duì)國(guó)內(nèi)各生產(chǎn)企業(yè)的樣品進(jìn)行了分子量與分子量分布的測(cè)定，考察國(guó)內(nèi)仿制制劑與原研制劑的差異，并將該結(jié)果與各企業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了比較，為進(jìn)一步統(tǒng)一質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，提高仿制藥與原研制劑的一致性，加強(qiáng)產(chǎn)品質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試劑

Waters高效液相色譜儀(2487紫外檢測(cè)器，2414示差檢測(cè)器，Empower工作站)；Mettler Toledo XSE205DU電子天平；Millipore超純水機(jī)。

水為Millipore Q-POD制備的純化水；其他試劑均為分析純。

依諾肝素鈉注射液來(lái)自2019年國(guó)家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)，包括6家國(guó)產(chǎn)企業(yè)及1家原研企業(yè)(賽諾菲)的各3批樣品。WHO低分子量肝素分子量測(cè)定對(duì)照品(批號(hào)：05/112)；EP低分子量肝素分子量測(cè)定對(duì)照品(批號(hào)：3.0 Mn3800)；USP低分子肝素鈉分子量測(cè)定對(duì)照品A(貨號(hào)：1235853，分子量為1 400、2 250、4 550、9 250 Da)、USP低分子肝素鈉分子量測(cè)定對(duì)照品B(貨號(hào)：1235864，分子量為1 800、3 350、6 650 Da)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 法定檢驗(yàn)方法 按各企業(yè)執(zhí)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)，共7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，分別為原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)YBH04982006、YBH00362015、YBH00692013、YBH00062014、YBH01132015、YBH02232016、JX20140211，其中原研制劑進(jìn)口注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)為JX20140211。各企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中分子量與分子量分布項(xiàng)下方法均有所不同，通過(guò)調(diào)研確定了各企業(yè)所用的對(duì)照品來(lái)源，方法匯總見(jiàn)表1。

表1 各企業(yè)分子量與分子量分布方法

2.2 原研制劑方法

2.2.1 溶液配制 對(duì)照品溶液的制備：取WHO低分子量肝素分子量測(cè)定對(duì)照品適量，加流動(dòng)相溶解，制成每1 mL約含10 mg的溶液，搖勻。

供試品溶液的制備：取本品適量加流動(dòng)相制成每1 mL約含1 500 IU的溶液。

2.2.2 色譜條件 色譜柱TSK G2000SWXL(7.8 mm×300 mm)；柱溫35 ℃；流動(dòng)相 0.1 mol·L-1醋酸銨溶液；流速：0.5 mL·min-1；進(jìn)樣體積25 μL；示差折光檢測(cè)器。

2.2.3 測(cè)定方法 取對(duì)照品溶液25 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。準(zhǔn)確計(jì)算對(duì)照品溶液色譜圖中依諾肝素的總面積(不包括鹽峰)及每個(gè)點(diǎn)的累積峰面積百分比，確定與依諾肝素鈉分子量對(duì)照品附帶的寬分布標(biāo)樣表中累積峰面積百分比最接近點(diǎn)的保留時(shí)間及對(duì)應(yīng)的分子量，以保留時(shí)間為橫坐標(biāo)，分子量的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，使用GPC軟件，擬合三次方程，建立校正曲線，相關(guān)系數(shù)應(yīng)不小于0.990。

取供試品溶液25 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，數(shù)據(jù)采用GPC軟件處理。

3 結(jié)果與討論

3.1 重均分子量結(jié)果 將各企業(yè)樣品采用各自質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方法與原研制劑方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)原研制劑方法測(cè)得的重均分子量普遍高于法定檢驗(yàn)結(jié)果，但大部分企業(yè)差異不大，偏差在2%以?xún)?nèi)，其中企業(yè)D二者結(jié)果差異顯著，偏差為8%。企業(yè)D采用的是EP對(duì)照品，其數(shù)據(jù)處理方法較其他采用EP對(duì)照品的廠家不同，其他企業(yè)采用紫外檢測(cè)器和示差檢測(cè)器聯(lián)用，用GPC軟件統(tǒng)計(jì)保留時(shí)間與分子量的三階曲線方程計(jì)算供試品的分子量與分子量分布，而該企業(yè)僅使用示差檢測(cè)器，是以低分子量端的第一個(gè)峰分子量為600計(jì)，每增加一個(gè)峰分子量遞增600，由Origin軟件統(tǒng)計(jì)對(duì)照品分子量與保留時(shí)間的二次曲線方程，由GPC軟件計(jì)算供試品的分子量與分子量分布，該方法可能帶來(lái)較大的誤差；將各企業(yè)樣品均采用原研制劑方法進(jìn)行檢測(cè)，可看出不同企業(yè)樣品的重均分子量有所差別，其中企業(yè)A的重均分子量最低，企業(yè)E和企業(yè)F的重均分子量較高，與原研制劑差異較大，其余廠家與原研制劑相差不大，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 重均分子量測(cè)定結(jié)果

3.2 分子量分布結(jié)果 采用各企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)得的部分樣品分子量與分子量分布與原研制劑方法測(cè)定結(jié)果有一定差異，原研方法與各企業(yè)方法相比，小于2 000的級(jí)分均有所降低，而大于8 000的級(jí)分略有升高，2 000～8 000的級(jí)分變化不明顯；各企業(yè)樣品均采用原研制劑的方法進(jìn)行檢測(cè)，可看出不同企業(yè)的分子量分布也有所不同，重均分子量越高，大于8 000的級(jí)分比例越大，小于2 000的級(jí)分比例越小，企業(yè)B、C、D與原研制劑較一致，其余3家企業(yè)分子量分布與原研制劑有一定差異，這與重均分子量的檢測(cè)結(jié)果相一致，結(jié)果見(jiàn)圖2～4。

圖2 小于2 000的級(jí)分測(cè)定結(jié)果

圖3 2 000～8 000的級(jí)分測(cè)定結(jié)果

圖4 大于8 000的級(jí)分測(cè)定結(jié)果

4 討論

目前依諾肝素鈉注射液的7家生產(chǎn)企業(yè)均采用不同的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)照品來(lái)源也各有不同，分別為EP、USP、WHO，目前中檢院也標(biāo)定了低分子肝素鈉對(duì)照品用于分子量與分子量分布檢查，國(guó)內(nèi)各企業(yè)均采用的是EP和USP的對(duì)照品，其中EP為寬分布對(duì)照品，利用紫外和示差檢測(cè)器，根據(jù)紫外圖譜和示差圖譜的峰面積及時(shí)間差計(jì)算每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的分子量，與保留時(shí)間擬合三階校準(zhǔn)曲線[8]，該方法需要人工選點(diǎn)，選點(diǎn)不同對(duì)結(jié)果有一定影響，計(jì)算較復(fù)雜，小分子量片段結(jié)果不夠精確[9]；USP采用兩套窄分布校正對(duì)照品，使用示差檢測(cè)器，以各峰的保留時(shí)間與Mr擬合三階校準(zhǔn)曲線，該方法較為準(zhǔn)確，但其對(duì)照品制備困難，價(jià)格昂貴[7]；而依諾肝素鈉注射液中國(guó)藥典征求意見(jiàn)稿(2017年)方法與原研制劑的方法一致，采用的是中檢院對(duì)照品和WHO對(duì)照品，這兩種對(duì)照品均給出了寬分布標(biāo)樣表，根據(jù)表中給出的相對(duì)分子質(zhì)量與累積峰面積百分比擬合三階校準(zhǔn)曲線，二者所提供的分子量分布一致，我們進(jìn)行了2個(gè)對(duì)照品的比較，發(fā)現(xiàn)二者無(wú)顯著性差異，該方法采用示差檢測(cè)器，操作簡(jiǎn)單，測(cè)定數(shù)據(jù)穩(wěn)定。不同分子量與分子量分布方法及不同來(lái)源對(duì)照品的測(cè)定結(jié)果存在差異，采用各企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的方法無(wú)法有效評(píng)價(jià)不同產(chǎn)品的質(zhì)量。我們同時(shí)采用原研制劑的方法測(cè)定了中國(guó)市場(chǎng)、美國(guó)市場(chǎng)、歐洲市場(chǎng)原研制劑的分子量與分子量分布，發(fā)現(xiàn)不同來(lái)源的原研制劑分子量與分子量分布差異不大，但國(guó)內(nèi)部分企業(yè)與原研制劑相比差異較大。因此我們建議參照中國(guó)藥典征求意見(jiàn)稿盡快統(tǒng)一質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為提高仿制藥與原研制劑的一致性，更好的控制產(chǎn)品質(zhì)量提供依據(jù)。