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    小麥紋枯病菌拮抗菌株X2—3的鑒定及其抗菌特性分析

    2016-05-14 10:02湯谷月劉朝霞趙寶梅劉春菊韓超
    山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年5期
    關(guān)鍵詞:鑒定

    湯谷月 劉朝霞 趙寶梅 劉春菊 韓超

    摘 要:從小麥根際土中分離到一株對(duì)小麥紋枯病菌拮抗活性較高的菌株X2-3,為進(jìn)一步利用該菌株,對(duì)其進(jìn)行了鑒定,并對(duì)其抗菌特性進(jìn)行了分析。根據(jù)菌落形態(tài)和產(chǎn)酶特征及16S rDNA分析,將菌株X2-3鑒定為辣椒溶桿菌(Lysobacter capsici)。平板對(duì)峙法測(cè)定其抑菌譜發(fā)現(xiàn),X2-3對(duì)Rhizoctonia cerealis、Thielaviopsis basicola等多種植物病原真菌和Phytophthora parasitica等卵菌表現(xiàn)明顯的抑菌活性,但對(duì)Xanthomonas oryzae pv. oryzae和Ralstonia solanacearum等革蘭氏陰性細(xì)菌沒有拮抗活性??咕镔|(zhì)穩(wěn)定性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),粗提純的抗菌物對(duì)蛋白酶K和溫度不敏感,表明該物質(zhì)可能屬于非線性蛋白,且具有一定的耐熱性。

    關(guān)鍵詞:辣椒溶桿菌; 鑒定; 抗菌物質(zhì); 拮抗活性

    中圖分類號(hào):S482.2+92文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào):A文章編號(hào):1001-4942(2016)05-0093-05

    Abstract A strain X2-3 that showed higher antifungal activity to Rhizoctonia cerealis was isolated from wheat rhizosphere soil. Then it was identified and its antifungal characteristics were analyzed for further utilization. The strain X2-3 was identified as Lysobacter capsici based on the cultural properties and 16S rDNA sequence. Antimicrobial spectrum analysis indicated that X2-3 showed obvious antimicrobial activities to plant pathogenic fungi Rhizoctonia cerealis, Thielaviopsis basicola and oomycetes Phytophthora parasitica, but not to gram-negative bacteria such as Xanthomonas oryzae pv. oryzae and Ralstonia solanacearum. The stability analysis results showed that the antimicrobial substance crudely purified from strain X2-3 were not sensitive to protease K and high temperature, which indicated that it might be nonlinear protein and had certain heat resistance.

    Key words Lysobacter capsici;Identification; Antifungal substance; Antimicrobial activity

    溶桿菌屬(Lysobacter)在自然環(huán)境中多見于土壤和水體等,由于該類細(xì)菌生長較慢,與芽孢桿菌、假單孢桿菌等細(xì)菌相比,其分離純化較為困難,分離出現(xiàn)的比例相對(duì)較低[1]。溶桿菌為革蘭氏陰性菌,菌體桿狀,無鞭毛,可滑行,基因組G+C含量較高,在NA培養(yǎng)基菌落乳白色或淡黃色,圓形,表面光滑。目前已知的溶桿菌有20個(gè)種,包括產(chǎn)酶溶桿菌(Lysobacter enzymogenes)、抗生素溶桿菌(L. antibioticus)和膠狀溶桿菌(L. gummosus)等[2]。溶桿菌屬因具有如下特性而備受關(guān)注:(1)溶桿菌可產(chǎn)生蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和纖維素酶等多種胞外酶,這些酶類對(duì)多種病原真菌、細(xì)菌和線蟲具有溶菌活性;(2)可產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)肽類和縮肽類等多種抗生素,在抗生素的研制和開發(fā)中有重要價(jià)值[3]。溶桿菌在植物病害防治中已有一些研究和報(bào)道,其中研究較多的為L. enzymogenes,研究發(fā)現(xiàn),L. enzymogenes菌株C3對(duì)小麥赤霉病、高羊茅葉斑病和菜豆銹病等都有較好的防治效果[4,5]。

    紋枯病是小麥的重要病害之一,由于該病的病原菌主要存在于病田土壤,藥劑防治較為困難,利用土壤有益微生物防治該類病害是有效的措施之一。本研究從小麥根際土壤中分離到一株對(duì)紋枯病菌表現(xiàn)較強(qiáng)抑菌活性的菌株,經(jīng)16S rDNA序列比對(duì),結(jié)合培養(yǎng)特征等,對(duì)菌株X2-3進(jìn)行了鑒定,并對(duì)其產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)的穩(wěn)定性進(jìn)行了分析,為進(jìn)一步利用該菌株提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料

    菌株材料:菌株X2-3參照韓超等[6]的方法從小麥根際土壤中篩選獲得。用于抗菌作用測(cè)定的病原菌包括小麥根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)、小麥紋枯病菌 (Rhizoctonia cerealis)、煙草黑脛病菌(Phytophthora parasitica)和群結(jié)腐霉(Pythium myriotylum)等,所用菌株詳細(xì)見表1。所用供試病原菌均由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)分子植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

    培養(yǎng)基: 細(xì)菌篩選、培養(yǎng)用NA培養(yǎng)基;細(xì)菌抗菌物質(zhì)產(chǎn)生及分析用LB培養(yǎng)基;真菌培養(yǎng)及抗菌作用分析用PDA培養(yǎng)基。

    1.2 方法

    1.2.1 菌株鑒定 菌落形態(tài)觀察:將篩選出的菌株X2-3劃線于NA培養(yǎng)基,28℃培養(yǎng)48 h,觀察菌落特征,包括菌落形態(tài)、大小、顏色等。

    產(chǎn)酶特性分析:以NA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,以0.1%(W/V)昆布多糖替代葡萄糖為唯一碳源,分析該菌株是否具有產(chǎn)葡聚糖酶的能力;蛋白酶分析以終濃度為1%(W/V)的脫脂奶粉代替蛋白胨,分析該菌株是否具有產(chǎn)蛋白酶的能力。將在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)好的X2-3菌體稀釋至OD600為0.5,取10 μL滴于測(cè)試用培養(yǎng)基平板,28℃培養(yǎng)3 d,觀察透明圈有無及大小,分析是否具有產(chǎn)酶能力。

    分子鑒定:菌株X2-3在LB培養(yǎng)基28℃下振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期,8 000 r/min離心收集菌體。參照Rainey等(1996)[7]的方法提取基因組DNA。用16S rDNA通用引物(27F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG;1492R: GGTTACCTTGTTACGACTT)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[8]。PCR反應(yīng)體系(25 μL):Taq酶( 5 U/μL) 0.5 μL,dNTPs (2.5 mmol/L) 2.0 μL,10 ×Buffer (Mg2+) 2.5 μL,上下游引物各1.0 μL,模板DNA 1.0 μL,最后補(bǔ)足17.0 μL雙蒸水。PCR反應(yīng)條件參照韓超等[6]的方法。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,用膠回收試劑盒回收目的片段,送上海生工測(cè)序。將所測(cè)16S rDNA序列用BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相似性比對(duì),用分析軟件DNAMAN v5.2.2進(jìn)行序列同源性分析。

    1.2.2 X2-3的抑菌活性測(cè)定 以表1病原菌作為供試菌進(jìn)行抑菌活性測(cè)定。菌株X2-3在NA培養(yǎng)基培養(yǎng) 2 d,用無菌水稀釋至OD600為0.5,取15 μL菌液滴于PDA或NA平板的中心位置(抗真菌或卵菌分析用PDA培養(yǎng)基,抗細(xì)菌分析用NA培養(yǎng)基),于28℃培養(yǎng)2 d,備用。

    用直徑5 mm打孔器從培養(yǎng)的真菌和卵菌的菌落邊緣打取菌落圓片,移至PDA培養(yǎng)基,距X2-3菌落約3 cm。28℃繼續(xù)培養(yǎng)2~5 d,觀察記錄抑菌圈大小,根據(jù)抑菌圈大小判斷該菌株的拮抗效果。

    對(duì)細(xì)菌的抑菌能力采用平板噴霧法測(cè)定,把培養(yǎng)好的Xanthomonas oryzae pv. oryzae和Ralstonia solanacearum分別制成1×108 cfu/g左右的孢子懸浮液,用無菌微量噴霧器均勻噴在X2-3菌落周圍,28℃繼續(xù)培養(yǎng)2 d,觀察記錄抑菌圈有無及大小。

    1.2.3 抗菌物質(zhì)穩(wěn)定性測(cè)定 菌株X2-3在LB培養(yǎng)液經(jīng)28℃、180 r/min培養(yǎng)72 h,于10 000 r/min、4℃離心20 min,重復(fù)2次,得到無菌濾液。參照任嘉紅等[9]的方法,將1 L無菌濾液經(jīng)硫酸銨沉淀、甲醇萃取、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)等處理后,共得到0.3 g 粗提物,用無菌水將粗提物配置成濃度約250 mg/mL,備用。

    以立枯絲核菌為指示菌,采用瓊脂孔擴(kuò)散對(duì)峙法,測(cè)定X2-3粗提物對(duì)溫度和蛋白酶K的穩(wěn)定性。

    熱穩(wěn)定性測(cè)定:將粗提液用1.5 mL離心管分裝,分別在40、50、60、70、80、90℃和100℃等溫度下處理30 min,備用。將直徑 5 mm的立枯絲核菌菌絲塊移至PDA平板中央,并在距菌絲塊約2 cm處分別打孔,每孔加入30 μL上述粗提液,以室溫(25℃)保存的未經(jīng)加熱處理的粗提液為對(duì)照,每處理重復(fù)3次。28℃培養(yǎng)2 d,測(cè)量記錄抑菌圈大小,分析抑菌效果。

    蛋白酶K穩(wěn)定性測(cè)定:取0.5 mL粗提液,加入蛋白酶K溶液使其終濃度為0.1 mg/mL,充分混勻后,置37℃水浴鍋中溫育2 h使其充分反應(yīng),以未加蛋白酶K處理為對(duì)照。參照上述方法測(cè)定抑菌活性,每處理重復(fù)3次。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 菌株X2-3的培養(yǎng)特征

    菌落形態(tài)特征:菌株X2-3在NA培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h形成圓形菌落,乳白色至淡黃色、不透明、有光澤、不產(chǎn)生熒光,表面光滑、無褶皺、邊緣整齊,菌落粘稠,流動(dòng)性強(qiáng)(圖1a)。

    產(chǎn)酶特性:圖1b和1c分別是X2-3在以昆布多糖為唯一碳源和脫脂奶粉為氮源的培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征。可見,X2-3在昆布多糖和脫脂奶粉培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)3 d,在菌落周圍都可產(chǎn)生明顯的透明圈,表明該菌株具有β-1,3-葡聚糖酶和蛋白酶產(chǎn)生能力,顯示菌株X2-3具有溶桿菌的培養(yǎng)特征。

    2.2 菌株X2-3的分子鑒定

    對(duì)菌株X2-3的DNA進(jìn)一步用細(xì)菌16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,在1 400 bp左右擴(kuò)增出一條單一條帶。對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行了序列測(cè)定,對(duì)所測(cè)序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中與已報(bào)道的細(xì)菌16S rDNA進(jìn)行BLAST比較,并用MEGA 5.0軟件分析系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系(圖2)。結(jié)果顯示,菌株X2-3與已報(bào)道的辣椒溶桿菌(Lysobacter capsici)菌株AZ78(基因登錄號(hào)KF196834)和YC5194(基因登錄號(hào)NR044250)親緣關(guān)系最近,相似性在99.8%,分在同一分支,進(jìn)一步確定該菌株為Lysobacter capsici(X2-3基因登錄號(hào)為KP978015)。

    2.3 菌株X2-3抗菌活性分析

    利用平板對(duì)峙法,分析了菌株X2-3對(duì)10種病原菌的抑制作用,結(jié)果見表1。從表1可見,X2-3對(duì)R. cerealis、Thielaviopsis basicola、B. sorokiniana等植物病原真菌和P. parasitica、P. myriotylum等植物病原卵菌均表現(xiàn)較強(qiáng)的抑菌效果,其中,以對(duì)R. cerealis、T. basicola和B. sorokiniana抑菌效果最好,抑菌圈半徑均在10 mm以上,對(duì)R. solani和P. myriotylum效果較差,抑菌圈直徑大約在7~8 mm之間;對(duì)X. oryzae pv. oryzae和R. solanacearum等革蘭氏陰性細(xì)菌沒有抑菌作用。部分抑菌效果見圖3。

    2.4 菌株X2-3抗菌物質(zhì)穩(wěn)定性分析

    以立枯絲核菌為指示菌,分析了X2-3粗提物對(duì)蛋白酶K和溫度的敏感性。圖4A是不同溫度處理后粗提物的抗菌活性,可見,粗提物在不同溫度下處理30 min,其抗菌活性差異明顯。隨處理溫度的升高,抑菌圈直徑越來越小,即抗菌活性越來越小,其中40℃處理后其抗菌活性與對(duì)照幾乎沒有差異,50~80℃處理,粗提物仍有較好的抑菌作用,相互間差異不顯著, 90~100℃時(shí)活性雖顯著降低,但仍有部分抑菌活性,表明該物質(zhì)對(duì)溫度有一定忍耐力。

    蛋白酶K 是一種作用廣譜的蛋白酶,能夠以線性蛋白為底物降解多種蛋白質(zhì)。X2-3粗提物經(jīng)蛋白酶K處理2 h,其抗菌活性與對(duì)照幾乎沒有差異(圖4B),說明該物質(zhì)對(duì)蛋白酶K不敏感,可能不屬于線性蛋白。

    3 結(jié)論與討論

    植物根際微生物群體存在多樣性,它們?cè)谥参锊『Ψ乐?、促進(jìn)植物生長等方面發(fā)揮了重要作用。溶桿菌作為其中的重要類群之一,也顯示多種生物功能。據(jù)Christensen和Cook報(bào)道,溶桿菌對(duì)真菌、革蘭氏陰性和陽性細(xì)菌及病原線蟲都有一定的拮抗作用[10]。目前關(guān)于溶桿菌的研究多集中于產(chǎn)酶溶桿菌[3,11],對(duì)其它種類溶桿菌的研究相對(duì)較少。本研究通過培養(yǎng)特征及分子生物學(xué)分析,將分離自小麥根際土的菌株X2-3鑒定為辣椒溶桿菌(Lysobacter capsici)。通過抗菌作用分析,發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)多種真菌、卵菌有較強(qiáng)的抑菌活性,但對(duì)革蘭氏陰性植物病原細(xì)菌沒有拮抗活性。

    許多研究表明,溶桿菌可通過分泌胞外酶、產(chǎn)生表面活性物質(zhì)和抗生素等多種機(jī)制,破壞病原物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)或抑制病原物生長[2]。研究發(fā)現(xiàn),L. enzymogenes可產(chǎn)生不止一種抗菌物質(zhì),據(jù)Lou等報(bào)道,L. enzymogenes菌株OH11和C3都可產(chǎn)生大環(huán)內(nèi)酰胺類抗真菌成分,該成分具有抗菌譜廣和熱穩(wěn)定等特征[12]。本研究初步分析發(fā)現(xiàn),辣椒溶桿菌X2-3產(chǎn)生的抗真菌物質(zhì)也具有耐熱性,并且對(duì)蛋白酶K不敏感,表明該抗菌物質(zhì)可能是一種環(huán)形肽,但與L. enzymogenes產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)在結(jié)構(gòu)上是否有相同之處,有待進(jìn)一步研究。

    參 考 文 獻(xiàn):

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