庫爾勒香梨組織培養(yǎng)的研究

劉小芳 馮建榮 梁曉桐 呂文娟 李文慧 樊新民

摘 要：香梨果實(shí)肉質(zhì)細(xì)膩，酸甜可口，是我國重要的出口創(chuàng)匯農(nóng)產(chǎn)品之一。目前，香梨普遍存在坐果率低、產(chǎn)量不穩(wěn)定的問題，通過組織培養(yǎng)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化改良性狀是當(dāng)前果樹高效育種的重要策略。本試驗(yàn)以庫爾勒香梨莖段萌發(fā)的嫩芽為材料，通過離體組織培養(yǎng)，研究0.1%HgCl₂溶液消毒時(shí)間對外植體滅菌效果和褐化的影響，并探討了適宜的增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基配方。結(jié)果表明，庫爾勒香梨組織培養(yǎng)過程中，0.1%HgCl₂消毒的適宜時(shí)間為5 min；適宜的增殖培養(yǎng)基為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA+1.5 mg/L GA₃；適宜的生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.05 g/L AC+1.0 mg/L IBA。

關(guān)鍵詞：庫爾勒香梨；芽；組織培養(yǎng)；消毒時(shí)間；增殖；生根

中圖分類號：S661.204+.3文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2016）05-0009-05

Abstract Korla fragrant pear has soft flesh and delicious flavor， which is one of the important agricultural exports of China. While， there are problems of low fruit setting rate and unstable yield of Korla fragrant pear. Improving the productivity traits of fruit tree by genetic transformation based on tissue culture is a significant method for high efficiency breeding. In this paper， the in vitro tissue culture method of Korla fragrant pear was established using tender buds as explants. The effects of disinfection time of 0.1% HgCl₂solution on sterilizing effect and browning of explants were studied and the optimum multiplication medium and rooting medium were explored. The results showed that during the tissue culture process of Korla fragrant pear， the optimum disinfection time of 0.1% HgCl₂was 5 minutes； the optimum multiplication medium was MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA+1.5 mg/L GA₃； and the optimum rooting medium was 1/2MS+0.05 g/L AC+1.0 mg/L IBA.

Key words Korla fragrant pear； Bud； Tissue culture； Disinfection time； Multiplication； Rooting

庫爾勒香梨屬薔薇科梨屬中的白梨系統(tǒng)，是新疆名優(yōu)特果樹之一[1]，其果實(shí)肉質(zhì)細(xì)膩，酸甜可口，已成為我國重要的出口創(chuàng)匯農(nóng)產(chǎn)品之一[2]。庫爾勒香梨主要分布于巴州地區(qū)的庫爾勒市及輪臺(tái)縣、尉犁縣等地，截至2010年，僅庫爾勒市香梨種植面積就已達(dá)4.7萬公頃[3]。目前，香梨普遍存在坐果率低、產(chǎn)量不穩(wěn)定的問題，因此選育穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的優(yōu)良品種成為亟待解決的問題。但常規(guī)育種預(yù)見性差、周期長、效率較低[4]，利用遺傳轉(zhuǎn)化改良性狀是當(dāng)前果樹高效育種的重要策略，而組織培養(yǎng)再生體系的建立為有效遺傳轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)。有關(guān)梨組織培養(yǎng)方面的研究較多。李曉剛等[5]以豆梨莖段為外植體，探討了4種基本培養(yǎng)基及6-BA、NAA不同配比對豆梨組織培養(yǎng)增殖率的影響，發(fā)現(xiàn)其適宜的增殖培養(yǎng)基為MS+0.6 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，適宜的生根培養(yǎng)基為1/2MS+1.5 mg/L IBA。韓文璞等[6]以黃金梨二年生植株春梢為試材，得到適宜的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為AS+1.5～2.0 mg/L 6-BA，適宜的增殖培養(yǎng)基為ASH+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA （或IAA）+500 mg/L AC。趙雪慧等[7]則以無子刺梨枝條為外植體，探索出其組織培養(yǎng)及快速繁殖各步的最佳配方。劉杰等[8]以鴨梨、黃金梨、阿巴特梨和杜梨莖段為試材，對影響外植體褐化的因素及防止褐化的措施進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加100 mg/L抗壞血酸或0.2 g/L聚乙烯吡咯烷酮，或?qū)⑼庵搀w在200 mg/L抗壞血酸溶液中浸泡30 min后接入添加2 g/L活性炭的培養(yǎng)基，均能明顯抑制褐化現(xiàn)象。此外，楊芳、王均華、宋梅、梁日高等[9～12]分別以秋子梨葉片、西洋梨莖尖、碭山梨及香梨莖尖、油梨莖段為材料，對梨組培快繁技術(shù)進(jìn)行了研究。目前有關(guān)庫爾勒香梨莖尖組織培養(yǎng)技術(shù)的研究已有一定進(jìn)展[13]，但尚未建立一套成熟的組織培養(yǎng)體系。本試驗(yàn)以庫爾勒香梨嫩芽為試驗(yàn)材料，研究了0.1% HgCl₂消毒的適宜時(shí)間，通過設(shè)置6-BA、IBA、GA₃三種重要植物生長調(diào)節(jié)劑的不同濃度處理，探索有利于庫爾勒香梨莖尖 （段） 生長、增殖及再生體系建立的條件，以期為建立庫爾勒香梨的再生體系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

庫爾勒香梨枝條取自新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院輪臺(tái)果樹資源圃。取休眠枝，將其根部浸水2周待萌芽發(fā)枝后取嫩芽作為外植體材料。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒及初代培養(yǎng) 先將嫩芽用流水沖洗30 min；再用70%酒精浸泡15 s后用無菌蒸餾水清洗，重復(fù)3次，前兩次清洗3 min，最后一次清洗5 min；之后用0.1%HgCl₂浸泡滅菌，浸泡時(shí)間設(shè)為3、5、7、9 min共4個(gè)處理。滅菌浸泡時(shí)要不間斷地勻力振蕩，最后用無菌蒸餾水沖洗5次。將消毒的芽苞剝?nèi)[片，取莖尖接種到MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L IBA+1.0 mg/L GA₃培養(yǎng)基中，每處理接種10個(gè)外植體。接種后置于人工氣候箱，溫度25℃，光照強(qiáng)度7 000 lx，觀察外植體恢復(fù)生長時(shí)間，2周后統(tǒng)計(jì)莖尖的污染率、褐化率及成活率。

1.2.2 增殖培養(yǎng) （繼代培養(yǎng)） 增殖培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，參考文獻(xiàn)[13、14]的配方，分別添加不同濃度配比的6-BA、IBA、GA₃三種激素，共設(shè)6個(gè)配方處理（見表1）。每個(gè)配方接種14個(gè)外植體，30 d繼代1次。每隔15 d觀察1次，記錄外植體的生長高度、葉片增加數(shù)及芽增殖個(gè)數(shù)。多次增殖后篩選出其適宜的培養(yǎng)基配方。

1.2.3 生根培養(yǎng) 選取增殖培養(yǎng)后梨苗高度大于2.5 cm且長出4片及以上真葉的外植體接種到不同的生根培養(yǎng)基中，置于人工氣候箱中暗培養(yǎng)7 d，然后進(jìn)行光培養(yǎng)，光周期為16 h/8 h，光照強(qiáng)度為3 000 lx，光、暗培養(yǎng)溫度均為25℃。生根培養(yǎng)基以1/2MS為基本培養(yǎng)基，分別添加0.05 g/L活性炭 （AC）及不同濃度（0.5、1.0、1.5 mg/L）的IBA，共3個(gè)處理，每個(gè)處理接種20個(gè)外植體。每30 d繼代1次。每隔7 d觀察1次，記錄根原基出現(xiàn)的時(shí)間及生根情況。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進(jìn)行顯著性分析（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 0.1%HgCl₂不同消毒時(shí)間對外植體的影響

由表2可知，本試驗(yàn)中0.1%HgCl₂浸泡對外植體的殺菌消毒效果良好。除浸泡7 min的處理總污染率為10%以外，其它處理污染率均為零。不同消毒時(shí)間外植體的褐化程度有所不同，其中HgCl₂浸泡9 min的褐化率最高，為40%，其余各處理褐化率均較低。各處理間外植體的生長遲滯情況也不相同，消毒時(shí)間為3 min和5 min時(shí)，外植體的生長遲滯情況較低。4個(gè)處理的存活率以消毒5 min時(shí)最高，為90%。此外，各處理間外植體的生長狀況差異較大（圖1）。綜合考慮，適宜的0.1%HgCl₂消毒時(shí)間為5 min。

2.2 不同激素濃度配比對外植體生長的影響

由表3可知，培養(yǎng)30 d時(shí)，不同處理外植體平均伸長量、葉片總數(shù)及增殖率差異較為明顯，各處理外植體生長狀況見圖2。處理2的外植體伸長最長，為2.08 cm，顯著高于處理6，但與其它各處理差異不顯著；處理6的外植體伸長最短，除與處理4差異不顯著外，顯著低于其余各處理。處理3、4、5的葉片總數(shù)差異不顯著，但均顯著高于其它3個(gè)處理。處理4增殖率最高（30.8%），其次為處理1，處理5、6的增殖率最低。綜合考慮，處理4培養(yǎng)基配方最適宜于庫爾勒香梨外植體的增殖。

2.3 不同配方對外植體生根情況的影響

觀察發(fā)現(xiàn)，在暗培養(yǎng)第6 d時(shí)，3個(gè)處理的外植體均有白色的根原基出現(xiàn)，而第30 d時(shí)只有1/2 MS+0.05 g/L AC+1.0 mg/L IBA培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出一條根，并繞瓶子生長，培養(yǎng)60 d后，未發(fā)現(xiàn)側(cè)根 （圖3）。其余處理均未長出根。因此庫爾勒香梨的最優(yōu)生根培養(yǎng)基有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論與討論

本研究以庫爾勒香梨莖段萌發(fā)的嫩芽為材料，通過綜合分析得出適宜的0.1% HgCl₂消毒時(shí)間為5 min；適宜的外植體增殖培養(yǎng)基為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA+1.5 mg/L GA₃；適宜的生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.05 g/L AC+1.0 mg/L IBA。

HgCl₂為劇毒的重金屬鹽消毒劑，可導(dǎo)致外植體褐化甚至死亡。隨著消毒時(shí)間的增加，消毒劑對外植體的毒害作用加強(qiáng)，會(huì)導(dǎo)致褐變加?。坏绻緯r(shí)間不夠，易造成細(xì)菌浸染，也會(huì)使外植體變褐、衰敗死亡。因此選擇適宜的消毒時(shí)間，對外植體的生長具有重要影響[15]。崔雪艷等[16]以紅樹莓新梢為材料，研究了HgCl₂消毒時(shí)間對外植體褐化的影響，發(fā)現(xiàn)滅菌時(shí)間過長，外植體褐化率增高的現(xiàn)象，該結(jié)論與本試驗(yàn)結(jié)果一致。羅婭等[17]利用梨矮化中間砧試管苗，研究6-BA、IBA、GA₃對試管苗增殖及生根的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，2～3 mg/L 6-BA、0.1～0.2 mg/L IBA和1～2 mg/L GA₃組合能有效促進(jìn)梨矮化中間砧試管苗的增殖，但不同品種間最適宜的激素配比均有一定差異。孫文英等[18]在建立綠寶石梨的組織快繁體系時(shí)發(fā)現(xiàn)，激素配比為1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA+1.0 mg/L GA₃的組合最適宜綠寶石梨的增殖。趙雪慧等[7]研究表明，無子刺梨的適宜生根培養(yǎng)基為LM+0.1 mg/L NAA。李曉剛等[5]研究表明，適宜的豆梨生根培養(yǎng)基為1/2MS+1.5 mg/L IBA。

利用組織培養(yǎng)進(jìn)行快繁，可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量品質(zhì)優(yōu)良的再生植株，為基因工程在果樹育種中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。整個(gè)過程操作方便、快捷、不受外界環(huán)境的影響[19]。本研究結(jié)果為香梨組培快繁體系的建立奠定了基礎(chǔ)，加強(qiáng)了可操作性；此外，選用莖段萌發(fā)的嫩芽作為外植體，而不通過愈傷組織，使其遺傳性更加穩(wěn)定[20]。

參 考 文 獻(xiàn)：

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