基于ITS序列探討空心瓜在葫蘆科中的系統(tǒng)分類(lèi)

江彪 劉文睿 何曉明 彭慶務(wù) 林毓娥 梁肇均 謝大森

摘 要 空心瓜是葫蘆科一年生草本植物，是葫蘆科重要的抗性資源。然而，長(zhǎng)期以來(lái)其系統(tǒng)分類(lèi)不清，嚴(yán)重影響空心瓜的利用?？招墓闲螒B(tài)學(xué)觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與冬瓜具有許多相似之處。隨后克隆其ITS序列，并與葫蘆科其他作物進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空心瓜與冬瓜的遺傳距離僅為0.03，位于進(jìn)化樹(shù)同一個(gè)分支末端，這表明空心瓜歸屬于冬瓜屬。本研究不僅為空心瓜的系統(tǒng)分類(lèi)提供直接的分子證據(jù)，而且為利用空心瓜拓寬冬瓜種質(zhì)資源奠定重要的研究基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 空心瓜 ；葫蘆科 ；ITS ；系統(tǒng)分類(lèi)

中圖分類(lèi)號(hào) Q949.782 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.06.012

The Taxonomic Classification of Praecitrullus fistulosus in Cucurbitaceae

based on Internal Transcribed Spacer Sequences

JIANG Biao LIU Wenrui HE Xiaoming

PENG Qingwu LIN Yu'e LIANG Zhaojun XIE Dasen

（Vegetable Research Institute， GAAS / Guangdong Provincial Key Lab for New Technology

Research on Vegetables， Guangzhou， Guangdong 510640）

Abstract Praecitrullus fistulosus is an annual Cucurbitaceae herb and it is an important resistant source in Cucurbitaceae. However， the systematic classification of P. fistulosus is unclear for a long time， which seriously affects its utility. Based on the morphological observation， author finds that there are many similarities between P. fistulosus and Benincasa hispida. Subsequently， this paper carries out phylogenetic analysis with other Cucurbitaceae species by clone the ITS sequence. The result showed that the genetic distance between P. fistulosus and B. hispida is only 0.03， and they locates in the same terminal branch of the phylogenetic tree. This indicates that P. fistulosus belongs to Benincasa. This study not only provides a more clear evidence for the classification of P. fistulosus， but also lays an important foundation for the utility of B. fistulosus to broaden B. hispida germplasm.

Keywords Praecitrullus fistulosus ； cucurbitaceae ； ITS ； phylogenetic classification

空心瓜[Praecitrullus fistulosus（Stocks）Pangalo，2n=2x=24]是葫蘆科一年生草本植物，起源于印度西北部，目前在印度、巴基斯坦等地廣泛種植。在印度，空心瓜被稱(chēng)為“tinda”，以幼嫩果實(shí)為食用器官，也被稱(chēng)為印度圓葫蘆（Indian Round Gourd）、蘋(píng)果葫蘆（Apple Gourd）和印度寶貝南瓜（Indian Baby Pumpkin）[1]。前人研究結(jié)果表明，空心瓜可能對(duì)白粉虱具有一定的抗性[2]。Levi等[3]的研究結(jié)果顯示，空心瓜在苗期抗枯萎病。因此，空心瓜可能是一個(gè)優(yōu)良抗性資源，對(duì)于葫蘆科作物育種具有重要的應(yīng)用潛力。

空心瓜在葫蘆科的系統(tǒng)分類(lèi)是一個(gè)復(fù)雜的認(rèn)知過(guò)程。由于空心瓜的花、種子和葉等許多形態(tài)學(xué)特征均與西瓜相似，因此，Sujatha等[1]認(rèn)為空心瓜是西瓜的一個(gè)近緣野生種，并將其命名為Citrullus vulgaris var. fistulosus（tinda）。此外，基于同工酶研究結(jié)果，Navot等[4]研究發(fā)現(xiàn)，空心瓜與所有西瓜屬植物均不同，因此認(rèn)為，空心瓜不應(yīng)該歸于西瓜屬。另一方面，也有報(bào)道認(rèn)為，空心瓜應(yīng)歸為甜瓜屬，因?yàn)槠淙旧w基數(shù)與甜瓜相同[5-6]。然而空心瓜與甜瓜雜交不親和，并且同工酶分析結(jié)果表明，空心瓜與西瓜、甜瓜均不相同[1]，因此空心瓜不應(yīng)歸于西瓜屬或甜瓜屬。此外，Levi等[7]利用RAPD標(biāo)記和ISSR標(biāo)記研究空心瓜與甜瓜屬、西瓜屬的親緣關(guān)系，結(jié)果表明，空心瓜與甜瓜屬、西瓜屬間的遺傳距離較遠(yuǎn)。

近年來(lái)，空心瓜在葫蘆科作物中的系統(tǒng)分類(lèi)有了新的發(fā)現(xiàn)[3，8-9]。Schaefer等[8]利用葉綠體多基因序列對(duì)葫蘆科114個(gè)屬的25%植物進(jìn)行了進(jìn)化分析，結(jié)果顯示，空心瓜與冬瓜（Benincasa hispida）位于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的同一個(gè)末枝，表明空心瓜與冬瓜具有較高的遺傳相似性。Levi等[3]利用分子標(biāo)記研究空心瓜與西瓜、甜瓜、冬瓜、葫蘆、南瓜等作物的親緣關(guān)系，結(jié)果表明，空心瓜與冬瓜的親緣關(guān)系最近，同時(shí)通過(guò)花粉粒形態(tài)觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空心瓜與冬瓜的花粉粒相似，均為球形或半球形，說(shuō)明空心瓜很可能是冬瓜屬植物。

核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacers， ITS）是研究植物分類(lèi)和親緣關(guān)系的重要工具[10-15]。因此，本研究通過(guò)克隆空心瓜的ITS序列，并與葫蘆科其他作物進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，從而探討空心瓜在葫蘆科作物中的分類(lèi)地位。

1 材料與方法

1.1 材料

空心瓜種子由鄭州果樹(shù)研究所王吉明研究員饋贈(zèng)，種植于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所白云試驗(yàn)基地。同時(shí)對(duì)空心瓜的形態(tài)學(xué)性狀進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計(jì)，包括葉、莖、雌雄花、果實(shí)、種子等。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

取剛展開(kāi)的幼嫩葉片，采用CTAB法提取基因組DNA[16]。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA濃度及質(zhì)量，并將其稀釋至50 ng/μL，置于-20℃冰箱中備用。

1.2.2 ITS序列擴(kuò)增

ITS序列包括ITS1、5.8 S rDNA和ITS2，采用雙引物擴(kuò)增。兩側(cè)引物分別為：ITSR 5′-CCTTATCATTAGAGGAAGGAG-3′[17]，ITSF 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′[18]。PCR反應(yīng)總體積為20 μL，包含基因組DNA 20 ng、正反向引物50 ng、dNTPs 2.5 mmol/L、MgCl2 2.5 mmol/L、10×PCR buffer和Taq DNA聚合酶1 U（TaKaRa）。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 1 min，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的克隆

PCR產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)，并用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（康為世紀(jì)）回收目的產(chǎn)物?；厥债a(chǎn)物經(jīng)純化后連接于pMD19-T載體（TaKaRa），并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37℃培育后，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取白色單克隆，在含有100 mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。最后以菌液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將陽(yáng)性克隆送往上海英俊生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.4 序列分析

去除載體序列后，將空心瓜ITS序列與葫蘆科其他作物的ITS序列進(jìn)行分析（表1）。基于已公布的序列信息[19]，確定各個(gè)ITS序列的ITS1、5.8 S和ITS2區(qū)。所有序列采用Cluster W進(jìn)行多序列比對(duì)[20]，并利用Bio XM 2.6進(jìn)行GC含量分析。同時(shí)，利用MEGA 5.05軟件以Kimura-2模型分析序列間的遺傳距離。進(jìn)一步以秋海棠的ITS序列（AF485089）作為外根群，利用MEGA 5.05軟件以鄰接法（Neighbor-joining）和最大簡(jiǎn)約法（Maximum parsimony）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，以自展法（bootstrap）進(jìn)行檢測(cè)，共循環(huán)1 000次[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 空心瓜的形態(tài)學(xué)觀察

空心瓜為一年生蔓生植物，莖被硬毛及長(zhǎng)茸毛，有棱溝。葉片腎形，具深裂，邊緣有小齒。葉柄粗壯，被粗硬毛和長(zhǎng)茸毛。雌雄同株異花，雄花具花瓣5～6枚，被長(zhǎng)茸毛，雄蕊3個(gè)；雌花具花瓣5～6枚，近球形，被較密的長(zhǎng)茸毛，分柱頭3個(gè)。成熟果實(shí)較小，近球形，被稀剛毛，果肉白色。種子為有棱雙邊，黑色，呈卵形，兩面平滑（圖1）。

2.2 空心瓜ITS序列克隆

以空心瓜基因組DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得一條約720 bp的目的片段（圖2）。目的片段通過(guò)回收測(cè)序、去除18S及26S序列后，獲得總長(zhǎng)度為614 bp的ITS1+5.8S+ITS2序列。該序列已提交到GenBank中，登錄號(hào)為KU358563。進(jìn)一步將其與其他55種葫蘆科作物的ITS序列（表1）進(jìn)行綜合比較。從表1中可看出，所有材料的ITS序列長(zhǎng)度變異較大，變化范圍為591～679 bp。葫蘆科作物的5.8S rRNA較為保守，長(zhǎng)度均為163 bp，GC含量變化范圍為57.67%～59.51%（表2）。而ITS1和ITS2變異較大，其中ITS1的長(zhǎng)度介于179～240 bp，GC含量變化范圍為50.00%～72.28%；ITS2的長(zhǎng)度為227～279 bp，GC含量變化范圍為54.51%～70.76%（表2）。

序列經(jīng)Cluster W比對(duì)后，在259個(gè)ITS1位點(diǎn)中，變異位點(diǎn)共有196個(gè)，其中信息位點(diǎn)173個(gè)，占總位點(diǎn)的88.27%。332個(gè)ITS2位點(diǎn)中，變異位點(diǎn)有244個(gè)，其中信息位點(diǎn)有180個(gè)，占總位點(diǎn)數(shù)的54.22%。5.8S rRNA較為保守，在163個(gè)位點(diǎn)中，僅有16個(gè)變異位點(diǎn)，其中只有2個(gè)是信息位點(diǎn)。

2.3 葫蘆科作物ITS序列的遺傳距離及系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用Kimura-2模型，以MEGA 5.05軟件分析ITS序列間的遺傳距離。所有葫蘆科作物ITS之間的遺傳距離變化范圍為0.01～0.36，其中Cucumella aspera（Cucumella屬）與Oreosyce africana（Oreosyce屬）之間的遺傳距離最小，僅為0.01，而B(niǎo)olbostemma paniculatum（假貝母屬）與Gomphogyne cissiformis（錐形果屬），以及Cucurbita pepo（南瓜屬）與Gomphogyne cissiformis（錐形果屬）間的遺傳距離最大，達(dá)到0.36。將空心瓜的ITS序列與所有其他作物的ITS相比較，其遺傳距離變化范圍為0.03～0.30，其中與Benincasa hispida冬瓜（冬瓜屬）的遺傳距離最近（0.03），這表明與其他葫蘆科作物相比，空心瓜與冬瓜具有更近的親緣關(guān)系。

為確定空心瓜在葫蘆科中的分類(lèi)地位，以葫蘆科作物的ITS序列為材料，利用秋海棠作為外根群構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。所有序列經(jīng)Cluster W比對(duì)后，共有775個(gè)位點(diǎn)，其中369個(gè)為信息位點(diǎn)。分別采用鄰接法和最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，2種方法均得到基本相似的結(jié)果。圖3是鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，從圖3中可看出，這56份葫蘆科作物可分為11個(gè)亞族，其中空心瓜與冬瓜均屬于Benincaseae（冬瓜）亞族，且位于同一個(gè)分支末端，遠(yuǎn)離其他葫蘆科作物。

3 討論與結(jié)論

為了探討空心瓜在葫蘆科中的系統(tǒng)分類(lèi)，多年來(lái)分類(lèi)專(zhuān)家先后根據(jù)形態(tài)學(xué)及分子標(biāo)記等手段開(kāi)展了許多工作[1，3-8]。由于其形態(tài)特征與西瓜相似，而染色體基數(shù)與甜瓜相同，因此，人們誤認(rèn)為空心瓜歸屬于西瓜屬或甜瓜屬，并期望通過(guò)雜交來(lái)拓寬西瓜或甜瓜的遺傳基礎(chǔ)[1，5]。近年來(lái)，Schaefer等[8]和Levi等[3]先后通過(guò)葉綠體多基因序列及分子標(biāo)記和花粉粒形態(tài)學(xué)觀察等手段證實(shí)空心瓜與冬瓜具有較近的親緣關(guān)系，為空心瓜的系統(tǒng)分類(lèi)奠定了基礎(chǔ)。本研究通過(guò)對(duì)空心瓜的形態(tài)學(xué)觀察，同樣發(fā)現(xiàn)其與冬瓜具有許多相似之處。比如空心瓜的果實(shí)形狀與小冬瓜相似、種子形狀與冬瓜的雙邊籽類(lèi)似、幼果均被較多長(zhǎng)茸毛等。

本研究進(jìn)一步利用ITS序列研究空心瓜的系統(tǒng)分類(lèi)。ITS具有進(jìn)化速率快、穩(wěn)定性好、測(cè)序方便等特征，是研究植物分類(lèi)和親緣關(guān)系的重要工具，可解決在不同植物類(lèi)群中科內(nèi)的系統(tǒng)發(fā)育和分類(lèi)問(wèn)題[10-15，22]。Sharma等[22]利用ITS序列對(duì)從印度東北部收集到的蘭科植物進(jìn)行系統(tǒng)分類(lèi)研究。侯新東等[14]以ITS序列研究廬山地區(qū)12種蕁麻科植物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其分類(lèi)結(jié)果與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)的分類(lèi)結(jié)果基本一致。

本研究首先克隆了空心瓜的ITS序列，并與葫蘆科其他作物進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果顯示空心瓜與冬瓜的遺傳距離僅為0.03，遠(yuǎn)低于與其他葫蘆科作物的距離；系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，空心瓜與冬瓜均歸屬于Benincaseae冬瓜亞族，且位于于同一個(gè)進(jìn)化樹(shù)的分支末端。綜上所述，空心瓜與冬瓜親緣關(guān)系較近，歸屬于冬瓜屬。本研究不僅為空心瓜的系統(tǒng)分類(lèi)提供了更為直接的分子證據(jù)，而且為空心瓜優(yōu)異基因的挖掘利用及冬瓜種質(zhì)資源拓寬奠定了重要的研究基礎(chǔ)。

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