水中糞大腸菌群的多管發(fā)酵法檢測研究進展

王朝霞

摘要 多管發(fā)酵法是糞大腸菌群檢測的經(jīng)典方法，概述了其檢測意義、發(fā)展歷程、質(zhì)量控制以及與其他方法的對比等方面的研究進展，以期為加強對多管發(fā)酵法的認識和理解提供參考。

關(guān)鍵詞 水；糞大腸菌群；多管發(fā)酵法；檢測；質(zhì)量控制

中圖分類號 X832 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2016）07-0205-01

1 糞大腸菌群的檢測意義

糞大腸菌群是在44.5 ℃培養(yǎng)，24 h內(nèi)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。該菌主要來源于人畜糞便，其數(shù)量直接表明水體受糞便污染的程度。1992年，生活飲用水衛(wèi)生標準修訂會議上首次提出將糞大腸菌群作為糞便污染的重要衛(wèi)生學(xué)指標[1]。糞大腸菌群是當(dāng)前國內(nèi)、外環(huán)境監(jiān)測部門評價水體污染程度的公認指標和主要監(jiān)測項目之一，具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義[2]。2014年6月起修訂施行的《GB4789.39—2013食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 糞大腸菌群計數(shù)》將糞大腸菌群在食品微生物檢驗中由推薦檢測變成了強制檢測[3]。

2 多管發(fā)酵法的發(fā)展歷程

多管發(fā)酵法測定糞大腸菌群是國內(nèi)外沿用多年的方法，在我國，多管發(fā)酵法自1989年版《水和廢水監(jiān)測分析方法》到2007年國家環(huán)境保護行業(yè)標準（HJ/T347—2007），仍為經(jīng)典方法[4]。該方法技術(shù)要求相對較低，分析成本亦較低，便于進行普及和推廣。但該方法操作步驟繁雜，消耗大量人力物力，周期長，為此很多人在方法改進上下了不少功夫[5-10]。

3 多管發(fā)酵法的質(zhì)量控制

在微生物檢測中，不確定度主要來源于操作人員技能、計量器具校準、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基、樣品的均勻性等[11]，因此要保證檢測的準確度必須從以上幾個方面進行質(zhì)量控制。

3.1 操作人員技能

為減少樣品檢測的不確定度，應(yīng)定期或不定期地對實驗室分析人員進行各項專業(yè)技術(shù)訓(xùn)練和實驗室基本操作，及時排除各類問題以提高實驗室工作成效。

3.2 實驗設(shè)備質(zhì)量控制

恒溫培養(yǎng)箱：需每天檢查2次，記錄培養(yǎng)架上使用區(qū)的溫度是否準確和穩(wěn)定，溫度變化不可超過±0.5 ℃。

高壓蒸汽滅菌器：應(yīng)能提供均勻的高達121 ℃的高壓滅菌溫度，每月用熱變色濾紙條檢查滅菌效果。

紫外滅菌燈：每月用浸有乙醇的濕布擦拭1次，每季用紫外光度計測量紫外燈光強度不少于初始值的70%或用生長有200～250個細菌菌落的瓊脂平皿暴露于紫外燈下2 min，99%的菌數(shù)被殺滅，否則，即應(yīng)更換新燈[12]。

為保證儀器計量精確以及正常使用，應(yīng)該由熟悉儀器的人員定期對儀器進行維護，并按計量部門的要求定期進行檢定；肉湯中倒管的選擇要尺寸合適，太細太長容易排氣不暢，導(dǎo)致滅菌后的倒管內(nèi)有氣泡，在進行發(fā)酵實驗時產(chǎn)生假陽性現(xiàn)象，太短滅菌過程中肉湯沸騰，容易導(dǎo)致倒管翻轉(zhuǎn)。

3.3 培養(yǎng)條件

復(fù)發(fā)酵用提高培養(yǎng)溫度的方法將糞便中的大腸菌群與自然環(huán)境中的大腸菌群區(qū)分，接種后如不盡快升溫，那些在44.5 ℃以下生長的非糞大腸菌群類細菌就會發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，這樣就會提高復(fù)發(fā)酵陽性率，因此標準要求“接種后所有發(fā)酵管必須在30 min 內(nèi)放進水浴中”[13]。并且將接種好的樣品放入生化培養(yǎng)箱時，箱內(nèi)溫度達到（44.5±0.5） ℃方可放入。如用恒溫水浴箱時，其水面要高于接種物面。

3.4 培養(yǎng)基

每一批次的培養(yǎng)基[14]，要用陰陽性菌株驗證其有效性；培養(yǎng)基溶解后和滅菌后分別測量pH值，以保證細菌生長所需的pH值；配制后的培養(yǎng)基，要盡快分裝到試管中進行滅菌，以免細菌繁殖破壞培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分；培養(yǎng)基在高壓滅菌器滅菌結(jié)束后，當(dāng)氣壓降至0后，應(yīng)立即從滅菌器中取出培養(yǎng)基，使之冷卻；震動可能在內(nèi)置倒管內(nèi)產(chǎn)生氣泡從而產(chǎn)生假陽性結(jié)果，因此在使用之前要檢查試管，將有氣泡的培養(yǎng)基廢棄掉；配制好的培養(yǎng)基，不宜保存過久，且每批應(yīng)注明配制日期。已滅菌的培養(yǎng)基可在4～10 ℃存放7 d；存放時應(yīng)避免陽光直射，且要避免液體蒸發(fā)和雜菌侵入；當(dāng)培養(yǎng)液顏色變化，或體積變化明顯時廢棄不用。肉湯管水分散失的簡單檢查方法是標記每一批次的幾根管的原始水平，如果估算的水分散失超過10%，應(yīng)廢棄肉湯管。

3.5 樣品均勻性

樣品在接種前，應(yīng)充分振搖，使菌落盡可能分散分布。

4 各種檢測方法的對比

隨著環(huán)境及食品問題的日益嚴峻，對糞大腸菌群的檢測要求不斷增加，各種應(yīng)急監(jiān)測的需求不斷增大，多管發(fā)酵法因其操作步驟繁雜、檢測周期長、培養(yǎng)基保存時間短、工作量大、干擾因素多、需要消耗大量的人力和物力的缺點，已經(jīng)不能滿足當(dāng)前國內(nèi)外的檢測需求，因而國內(nèi)外相繼研發(fā)出各種快速簡便的檢測方法，下面對各種檢測方法進行對比。

濾膜法：可檢測體積較大的水樣，操作簡單，一次到位，避免操作過程中的二次污染；稀釋度越大，誤差越大；受孔徑影響，不能檢測濁度大、非大腸桿菌類細菌密度大的水樣[15]。

紙片法：人力物力成本不高，檢測周期短，不需要確認試驗，操作和結(jié)果判斷均比較容易，與多管發(fā)酵法的相關(guān)性好，但其穩(wěn)定性不足，二次污染大[16-17]。

酶底物法：操作簡便，檢測周期短，準確度高，不需要確認試驗，可同時檢測水中大腸菌群和大腸埃希氏菌的污染狀況，可作為應(yīng)急監(jiān)測或者災(zāi)害監(jiān)測的重要方法[18]。不受濁度的影響，適用于任何水質(zhì)。密封培養(yǎng)技術(shù)檢測醫(yī)院廢水時，可以避免檢測人員受到疾病威脅[19]。缺點是成本較高。

聚合酶鏈式技術(shù)、熒光原位雜交技術(shù)以及自動化檢測方法等先進的方法，檢驗周期短，不需要確認實驗，但這些先進的技術(shù)檢測設(shè)備及試劑費用高昂，技術(shù)復(fù)雜，還無法短時間內(nèi)應(yīng)用普及[20]。

5 結(jié)語

隨著技術(shù)的進步和經(jīng)濟的發(fā)展，各種先進的檢測技術(shù)一定會取代傳統(tǒng)方法，節(jié)省時間和人力資源，在新技術(shù)支持下，精確、快速、可靠、環(huán)保、低廉的自動檢測儀器被研發(fā)并應(yīng)用與普及將使自動化檢測方法成為監(jiān)測工作的發(fā)展方向。但其他方法的研究都是與多管發(fā)酵法進行準確度和可靠性的比較，因此多管發(fā)酵法始終是糞大腸菌群檢測的經(jīng)典方法。

6 參考文獻

[1] 湯琳.糞大腸菌群酶底物法在環(huán)境監(jiān)測中的應(yīng)用研究[J].環(huán)境監(jiān)控與預(yù)警，2014，6（3）：32.

[2] 史建.糞大腸菌群檢測方法研究進展[J].河北化工，2012，35（7）：32-35.

[3] 郭盈希.食品微生物糞大腸菌群計數(shù)新舊標準比對分析[J].中國食物與營養(yǎng)，2014，20（7）：10.

[4] 蘆慧，趙淑娥，張云偉，等.24孔板發(fā)酵法測定地表水和廢水中糞大腸菌群的研究[J].環(huán)境科學(xué)與管理，2014，39（5）：122-124.

[5] 呂琦，陳之江.快速測定地表水中糞大腸菌群[J].環(huán)境監(jiān)測管理與技術(shù)，2003，15（6）：37.

[6] 馮青英，劉娟，楊大衛(wèi).糞大腸菌群多管發(fā)酵測定法的改進研究[J].中國環(huán)境監(jiān)測，2009，25（6）：43-46.

[7] 謝嶸.五管發(fā)酵測定糞大腸菌群的研究[J].干旱環(huán)境監(jiān)測，2004，18（3）：191-192.

[8] 謝嶸.十管發(fā)酵測定糞大腸茵群的研究[J].黑龍江環(huán)境通報，2009，33（4）：37-39.

[9] 張濟龍，何吉明，袁泉，等.多管發(fā)酵法與其改進法檢測水中糞大腸菌群的比較[J].四川環(huán)境，2012，31（5）：8-11.

[10] 楊虹，劉金冠，郭玉敏.酶底物法與多管發(fā)酵法測定水中糞大腸菌群的對比分析[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2015（20）：162.

[11] 李永.多管發(fā)酵法測定污水中糞大腸菌群結(jié)果不確定度的評定[J].廣東化工，2013，40（21）：146-147.

[12] 國家環(huán)境保護總局.水和廢水監(jiān)測分析方法[M].4版.北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社，2002：726-727.

[13] 陳國鋒.略論糞大腸菌群及其多管發(fā)酵法檢測研究[J].環(huán)境科學(xué)與管理，2013，38（7）：134.

[14] 高瑞坤，湯琳，付強.水中糞大腸菌群快速檢測方法-固定底物酶底物法與多管發(fā)酵法的比較[J].中國環(huán)境監(jiān)測，2008，24（4）：39-41.

[15] 王燕，龍加洪，許雄飛，等.水中糞大腸菌群測定方法的比較研究分析：酶底物法與多管發(fā)酵法[J].環(huán)境科學(xué)與管理，2013，38（7）：126-128.

[16] 趙春霞，張哲海，厲以強，等.酶底物法與多管發(fā)酵法和紙片法監(jiān)測環(huán)境水樣大腸菌群的比較[J].環(huán)境監(jiān)測管理與技術(shù)，2009，21（2）：63-64.

[17] 趙凌宇.糞大腸菌群快速測定：紙片法的應(yīng)用[J].環(huán)境監(jiān)測管理與技術(shù)，2007，19（4）：18-20.

[18] 馬原，劉虹.幾種糞大腸菌群檢測方法的比較[J].黑龍江環(huán)境通報，2010，34（3）：45.

[19] 趙春霞，厲以強，梅卓華.酶底物法檢測地表水糞便污染的適用性探討[J].環(huán)境監(jiān)控與預(yù)警，2009，1（2）：25-27.

[20] 張少峰，劉國強，魏春雷.糞大腸菌群檢測方法及研究進展[J].海洋通報，2008，27（3）：102-106.