TaqMan熒光定量PCR快速檢測(cè)錦鯉皰疹病毒方法的建立與應(yīng)用

李濤 萬譯文 劉登望

摘要：本研究采用一步DNA提取法快速提取錦鯉組織樣品中的DNA，利用針對(duì)錦鯉皰疹病毒（Koi herpesvirus，KHV）TK基因保守區(qū)設(shè)計(jì)的一對(duì)特異性引物、一條特異熒光探針，經(jīng)反應(yīng)體系優(yōu)化，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)，通過對(duì)熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)實(shí)現(xiàn)對(duì)KHV的定量檢測(cè)。整個(gè)過程快速、簡(jiǎn)捷，操作簡(jiǎn)單，可對(duì)KHV進(jìn)行快速有效的診斷，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：錦鯉皰疹病毒；熒光定量PCR；TaqMan；一步法

中圖分類號(hào)：S941.41+9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2016）07-0125-04

錦鯉皰疹病毒病是由錦鯉皰疹病毒（Koi herpesvirus，KHV）引起的一種傳染性疾病。KHV能夠感染錦鯉、鯉魚和剃刀魚，其魚苗、幼魚、成魚均可感染。錦鯉皰疹病毒病多發(fā)于春、秋季，潛伏期兩周左右，魚發(fā)病并出現(xiàn)癥狀24～48 h后開始死亡，2～4 d內(nèi)死亡率可迅速達(dá)到80%～100%[1，2]。此病首先在以色列暴發(fā)，接著美國(guó)、歐洲（如英國(guó)、德國(guó)、比利時(shí)）及亞洲一些國(guó)家均有此病發(fā)生，給錦鯉和鯉魚養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失[3，4]。

錦鯉皰疹病毒顆粒呈球狀，有囊膜，直徑約170～230 nm，其核衣殼為對(duì)稱十面體，直徑為100～110 nm，該病毒由31種病毒多肽組成，遺傳物質(zhì)為雙鏈DNA，基因組大小約為277 kb[5，6]。

目前錦鯉皰疹病毒病的檢測(cè)方法有電鏡檢測(cè)、ELISA、普通PCR和熒光定量PCR等[7]。TaqMan熒光定量PCR是在PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一種特異性熒光探針，該探針為一段寡聚核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5′→3′外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步[8～11]。

鑒于錦鯉皰疹病毒病對(duì)養(yǎng)殖業(yè)帶來的危害，對(duì)其進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測(cè)具有重要意義。本研究通過比對(duì)兩種不同的核酸提取方法，建立了基于TaqMan熒光定量PCR技術(shù)快速檢測(cè)KHV的方法，以期為有效控制錦鯉皰疹病毒病的傳播提供技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1病毒株

KHV標(biāo)準(zhǔn)毒株VR1592購(gòu)自北京中原公司。錦鯉細(xì)胞系（KF）、鯉春病毒血癥病毒（SVCV）、傳染性造血器官壞死病毒（IHNV）、病毒性出血性敗血癥病毒（VHSV）和鯉魚皰疹病毒（CHV）核酸由湖南水產(chǎn)科學(xué)研究所饋贈(zèng)。

1.2主要儀器和試劑

熒光定量PCR儀購(gòu)自上海宏石醫(yī)療科技有限公司；通用一步法DNA提取液、柱式病毒基因組抽提試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司（簡(jiǎn)稱上海生工）；脫氧三磷酸核苷酸（dNTPs）、Taq DNA聚合酶購(gòu)自普洛麥格生物技術(shù)有限公司（北京）；三羥甲基氨基甲烷（Tris）、氯化鉀（KCl）、氯化鎂（MgCl2）、硫酸銨、甘油等購(gòu)自西隴化工有限公司（廣州）。

1.3引物設(shè)計(jì)

查找KHV相關(guān)基因并利用ClustalX2進(jìn)行序列比對(duì)，最后選定TK基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物和探針，使用引物設(shè)計(jì)軟件Oligo7。正向引物F1：5′-GCTGGAGCGTCTGTCCT-3′；反向引物F2：5′-ATGGCCACCTTGGACTCTT-3′；TaqMan探針：FAM-5′-ACGCTGCATCGCCGTCAAGCAC-3′-BQ1，擴(kuò)增長(zhǎng)度為90 bp。經(jīng)NCBI網(wǎng)站上的Primer-Blast分析本套引物具有KHV特異性。同時(shí)以KHV全長(zhǎng)基因組序列（KJ627438）為模板合成含TK基因的質(zhì)粒做為參考品。引物、探針及質(zhì)粒皆由上海生工合成。

1.4TaqMan熒光定量PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

PCR反應(yīng)體系（50 μL）包括Tris-HCl （pH 8.0） 10 mmol/L，KCl 50 mmol/L，dNTPs 30 mmol/L，MgCl2 5 mmol/L，Taq酶10 U，添加（NH4）2SO4 10 mmol/L和甘油3%增加擴(kuò)增的特異性和穩(wěn)定性。

引物和探針終濃度的篩選：利用0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 μmol/L的引物終濃度和0.03、0.06、0.12、0.24、0.48 μmol/L的探針終濃度對(duì)樣品進(jìn)行擴(kuò)增，篩選引物和探針的最佳濃度。

擴(kuò)增程序如下：95℃ 5 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)，收集熒光信號(hào)；4℃保溫。

1.5病毒培養(yǎng)

將KHV 標(biāo)準(zhǔn)毒株VR1592 接種KF 細(xì)胞，待出現(xiàn)細(xì)胞病變收獲病毒培養(yǎng)液（以下簡(jiǎn)稱細(xì)胞毒）。

1.6DNA提取方法比較

KHV DNA分別用兩種試劑盒提取并進(jìn)行對(duì)比。

方法一：一步法，利用通用一步法DNA提取液。將約2 μL液體樣品或固體組織研磨液（剪取約20 mg錦鯉腮腺組織，加入200 μL生理鹽水，用玻璃勻漿器充分研磨得到組織研磨液）加入到50 μL提取液中，80℃加熱5 min后，簡(jiǎn)短振蕩混勻后取裂解物直接進(jìn)行PCR。

方法二：柱提法，利用柱式病毒基因組抽提試劑盒。按照試劑盒說明書操作，經(jīng)過蛋白酶K裂解、吸附柱收集、DNA洗脫等步驟，大約需要1 h。

1.7特異性試驗(yàn)

應(yīng)用建立的熒光定量PCR方法同時(shí)對(duì)錦鯉皰疹病毒（KHV）、鯉春病毒血癥病毒（SVCV）、傳染性造血器官壞死病毒（IHNV）、病毒性出血性敗血癥病毒（VHSV）和鯉魚皰疹病毒（CHV） DNA進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)KHV引物和探針的特異性。

1.8敏感性試驗(yàn)

KHV質(zhì)粒由上海生工合成后，然后按照下面的公式轉(zhuǎn)換成質(zhì)粒的拷貝數(shù)：每微升質(zhì)?？截悢?shù)=（6.02×1023）×（ng/μL×10-9）/（DNA序列長(zhǎng)度×660）。將質(zhì)粒進(jìn)行10 倍梯度稀釋，檢測(cè)該方法的敏感性。

1.9重復(fù)性試驗(yàn)

取3個(gè)批次細(xì)胞毒樣本，用一步法提取DNA后進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。同一樣本做3個(gè)平行檢測(cè)。

1.10樣品檢測(cè)

應(yīng)用建立的熒光定量PCR方法將30 份細(xì)胞培養(yǎng)物與攻毒魚組織樣本進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)利用普通PCR進(jìn)行檢測(cè)，比較熒光定量PCR方法的應(yīng)用情況。

2結(jié)果與分析

2.1PCR反應(yīng)體系的建立

最終確定引物、探針終濃度分別為0.1、0.06 μmol/L時(shí)能獲得較理想的擴(kuò)增結(jié)果，濃度增加擴(kuò)增效果提高不明顯，濃度降低則熒光信號(hào)較低。

最終的PCR反應(yīng)體系（50 μL）：Tris-HCl （pH 8.0） 10 mmol/L，KCl 50 mmol/L，（NH4）2SO4 10 mmol/L，甘油3%，dNTPs 30 mmol/L，MgCl2 5 mmol/L，Taq酶10 U，正、反向引物各0.1 μmol/L，熒光探針0.06 μmol/L。

2.2兩種DNA提取方法比較

對(duì)同一細(xì)胞毒運(yùn)用兩種方法提取DNA，并用熒光定量PCR方法重復(fù)檢測(cè)3次。結(jié)果顯示兩種方法無明顯差異（圖1，表1），說明一步法可以提取代柱提法進(jìn)行KHV DNA提取并進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)。

2.3特異性試驗(yàn)結(jié)果

應(yīng)用建立的熒光定量PCR方法同時(shí)檢測(cè)KHV、SVCV、IHNV、VHSV和CHV DNA，只有KHV有擴(kuò)增曲線（圖2），說明該方法具有良好的特異性。

2.4敏感性試驗(yàn)結(jié)果

將KHV質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，共4個(gè)梯度，分別為3×104、3×103、3×102、3×10 拷貝/μL，最低檢測(cè)限為30 拷貝/μL（圖3）。以質(zhì)粒濃度30 拷貝/μL為模板進(jìn)行20次重復(fù)檢測(cè)，檢出率為95%，證明該方法檢測(cè)KHV具有極高的靈敏度。

2.5重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

3個(gè)批次細(xì)胞毒樣本用一步法分別提取DNA后均分3次進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，結(jié)果（圖4，表2）顯示該方法重復(fù)性較好，變異系數(shù)CV<2.00%。

2.6臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

采用建立的一步DNA提取法結(jié)合熒光定量PCR方法檢測(cè)30份細(xì)胞培養(yǎng)物與攻毒魚組織樣本（表3），熒光定量PCR陽性檢出率為96.67%（29/30），普通PCR陽性檢出率為60%（18/30）。兩種方法比較，熒光定量PCR方法檢測(cè)KHV具有更高的靈敏度。

3討論與結(jié)論

熒光定量PCR利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)系對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析，簡(jiǎn)化了檢測(cè)過程，重復(fù)性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果清晰，具有廣泛用途[8～11]。

在其它利用熒光定量PCR方法檢測(cè)錦鯉皰疹病毒的研究中，DNA提取方法大多采用商業(yè)試劑盒柱提法[3， 6]或經(jīng)典CTAB法[12]。柱提法步驟繁多，耗時(shí)長(zhǎng)；而經(jīng)典CTAB法所用有機(jī)試劑酚、氯仿等可造成環(huán)境污染，對(duì)人體危害大。本研究選用的一步法，整個(gè)提取過程不包含去蛋白、去RNA及其它次生代謝物的過程，無需有機(jī)溶劑抽提，無需無水乙醇沉淀，簡(jiǎn)便、快捷，操作簡(jiǎn)單，只用一步（約5～10 min）即可得到用于 PCR 擴(kuò)增的 DNA模板，且質(zhì)量穩(wěn)定可靠。結(jié)合優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系，可對(duì)錦鯉皰疹病毒進(jìn)行快速有效診斷，具有一定應(yīng)用價(jià)值。

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