油棕體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)和次生胚的增殖研究

鄒積鑫　潘登浪　林位夫

摘 要 油棕體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)是油棕體胚發(fā)生技術(shù)體系中最關(guān)鍵的培養(yǎng)過(guò)程，通過(guò)建立油棕次生胚增殖培養(yǎng)方法可有效地實(shí)現(xiàn)油棕組培苗快速的增殖繁育。本研究通過(guò)系統(tǒng)的對(duì)油棕體細(xì)胞胚發(fā)生及次生胚再生途徑中若干影響因子的比較研究，建立油棕體細(xì)胞胚和次生胚再生體系。結(jié)果表明：油棕體細(xì)胞胚再生體系在不同基因型的油棕品種內(nèi)誘導(dǎo)率存在較大差別，其中植物外源激素二氯苯氧乙酸（2，4-D）對(duì)油棕胚誘導(dǎo)效果較好；油棕次生胚增殖在不同基因型的油棕品種內(nèi)差異不顯著，木本植物培養(yǎng)基（WPM）在油棕次生胚增殖中培養(yǎng)效果最好。

關(guān)鍵詞 油棕 ；體胚發(fā)生 ；胚狀體 ；次生胚

中圖分類號(hào) S565.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.08.006

Abstract Induction of oil palm somatic embryogenesis is the most critical cultural process in oil palm tissue culture. Rapid proliferation of oil palm can be effectively realized through the establishment of oil palm secondary embryogenesis regeneration in tissue culture. Several factors that affecting induction of oil palm somatic embryos and regeneration of secondary embryogenesis were compared systematically to establish a secondary oil palm somatic embryo regeneration system. The results showed that there is great difference in induction rate of somatic embryogenesis between different oil palm genotypes， and the woody plant medium （WPM） is the best basic medium in proliferation of oil palm secondary embryos.

Keywords oil palm ； somatic embryogenesis ； embryo ； secondary embryogenesis

油棕是世界上重要的熱帶木本油料作物，通過(guò)組培可對(duì)獲得的優(yōu)良單株進(jìn)行快速繁殖，從而大幅度縮短育種、育苗時(shí)間。次生胚發(fā)生途徑是指由原始體胚細(xì)胞（originally formed somatic embryos）或者初生胚狀體（primary somatic embryos）發(fā)育獲得體細(xì)胞胚的植物再生途徑，許多植物在通過(guò)體胚發(fā)生途徑獲得離體再生植株過(guò)程中，初生體細(xì)胞胚的萌發(fā)率非常低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于次生胚狀體的萌發(fā)率。因此通過(guò)建立高頻的次生胚狀體途徑獲得離體再生植株的研究在單子葉和雙子葉植物組織培養(yǎng)技術(shù)研究中都有廣泛的報(bào)道。李洪清等[1]以木薯成熟的胚狀體子葉為外植體材料建立次生胚再生體系，每個(gè)外植體材料可獲得32.5個(gè)次生胚狀體。孫艷香等[2]以苜蓿無(wú)菌苗下胚軸為外植體材料建立次生胚再生體系，篩選獲得2個(gè)具有較強(qiáng)次生胚發(fā)生能力的株系。Giridhar等[3]以咖啡的葉片和莖為外植體材料建立植株再生體系，通過(guò)MS培養(yǎng)基添加三十烷醇成功獲得高頻的咖啡的次生胚。油棕組織培養(yǎng)技術(shù)最早由法國(guó)科學(xué)家Rabechault等[4]于1976年研究獲得成功，隨后在東南亞地區(qū)、南美洲地區(qū)的多家研究機(jī)構(gòu)和公司有成功的報(bào)道[5]。目前馬來(lái)西亞、印度尼西亞、哥斯達(dá)黎加等國(guó)已經(jīng)開(kāi)始油棕組培苗的商業(yè)化生產(chǎn)[6]。在20世紀(jì)80年代中國(guó)已有開(kāi)展油棕組織培養(yǎng)相關(guān)的研究。崔元芳等[7]以油棕胚為外植體材料獲得愈傷組織并建立植株再生體系。龔崢等[8]以油棕葉片為外植體材料成功獲得愈傷組織。鄒積鑫等[9]以油棕葉片為外植體材料建立植株再生體系并獲得完整植株。雖然目前國(guó)內(nèi)相關(guān)的研究已經(jīng)取得了較大進(jìn)展，但尚未得到廣泛的應(yīng)用和系統(tǒng)的研究，特別是不同油棕單株的體胚發(fā)生效率不一致，影響植株再生頻率較低。鑒于此，本研究以前期建立的油棕離體再生體系為基礎(chǔ)，對(duì)油棕3個(gè)品系優(yōu)株的胚狀體誘導(dǎo)及次生胚的增殖開(kāi)展研究，旨在篩選獲得最佳的油棕體胚及次生胚的增殖方法。

1 材料與方法

1.1 材料

以油棕易碎胚性愈傷組織為材料。油棕母樹(shù)來(lái)自農(nóng)業(yè)部儋州油棕種質(zhì)資源圃，品種為RYL2、RYL4、RYL6，材料來(lái)源是由油棕幼嫩的葉片培養(yǎng)獲得，詳細(xì)方法參照鄒積鑫等[11]采用的愈傷組織誘導(dǎo)方法。愈傷組織誘導(dǎo)是將葉片接種到MS培養(yǎng)基（添加5 mg/L 2，4-D、10 mg/L TDZ和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖）獲得，再將愈傷組織接種到MS培養(yǎng)基（添加0.1～1.0 mg/L 2，4-D）中獲得易碎胚性愈傷組織。所有的培養(yǎng)基均添加6 g/L的瓊脂，并將pH調(diào)至5.8，121℃高壓滅菌15 min。 易碎胚性愈傷組織在光照培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，溫度為（28±2）℃，每1個(gè)月繼代1次。

1.2 方法

1.2.1 油棕初生胚狀體的誘導(dǎo)

選擇3種不同品系的油棕愈傷組織接種到油棕初生胚狀體培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，基本培養(yǎng)基為木本植物培養(yǎng)基（WPM），并附加4種不同種類的植物激素：二氯苯氧乙酸、毒莠定、麥草畏、萘乙酸，其濃度為1 mg/L，每個(gè)處理50個(gè)，重復(fù)3次。將接種好的培養(yǎng)物置于光培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（28±1）℃，光照強(qiáng)度為3 000 lx，光照時(shí)間為12 h/d，每2個(gè)月繼代培養(yǎng)1次，統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)1～4個(gè)月的出胚情況，每月統(tǒng)計(jì)1次。

1.2.2 油棕次生胚狀體的誘導(dǎo)及增殖

將培養(yǎng)2～4個(gè)月后的油棕初生胚狀體切分成8～12 mm小塊，接種到培養(yǎng)基中進(jìn)行次生胚狀體的誘導(dǎo)和增殖?；九囵B(yǎng)基為MS、WPM、Y3培養(yǎng)基（附加2，4-D 0.1 mg/L和200 mg/L椰子水），每處理重復(fù)3次，培養(yǎng)溫度為（28±1）℃，光照強(qiáng)度為3 000 lx，光照時(shí)間為12 h/d，每2個(gè)月繼代培養(yǎng)1次，每月統(tǒng)計(jì)次生胚狀體的生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)因素對(duì)油棕胚狀體誘導(dǎo)的影響

愈傷組織接種至初生胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基后，培養(yǎng)1個(gè)月開(kāi)始觀察到愈傷組織逐漸膨大（圖1-A），分化成心形胚組織，接著心形胚組織繼續(xù)分化，頂部不斷變尖成魚(yú)雷型胚組織，最終形成芽的前體組織（圖1-B）。品種、植物激素種類以及培養(yǎng)時(shí)間的多元方差分析和多重比較結(jié)果見(jiàn)表1、2。3個(gè)因素對(duì)油棕胚狀體誘導(dǎo)的影響效果為：植物激素種類>品種>培養(yǎng)時(shí)間，其中4種植物激素的種類對(duì)油棕胚誘導(dǎo)率的影響達(dá)顯著差異，不同油棕品種胚狀體培養(yǎng)4個(gè)月后平均誘導(dǎo)率為2.5%～11.83%。RYL02材料中，植物激素對(duì)胚狀體誘導(dǎo)率效果為：二氯苯氧乙酸>毒莠定>麥草畏>萘乙酸。RYL04材料中，植物激素對(duì)胚狀體誘導(dǎo)率效果為：毒莠定>二氯苯氧乙酸>麥草畏>萘乙酸。RYL06材料中，獲得的平均出胚率最高達(dá)11.83%，植物激素對(duì)胚狀體誘導(dǎo)率效果為：二氯苯氧乙酸>毒莠定>麥草畏>萘乙酸。3個(gè)不同品種對(duì)油棕胚誘導(dǎo)率的影響達(dá)顯著差異，其中RYL2品種與RYL4品種間無(wú)顯著差異。油棕胚的出胚率隨時(shí)間的增加而增加，但不同時(shí)間培養(yǎng)對(duì)油棕胚誘導(dǎo)率無(wú)顯著差異。

2.2 不同培養(yǎng)因素對(duì)油棕次生胚誘導(dǎo)的影響

初生胚接種到次生胚培養(yǎng)基后，在胚狀體表面開(kāi)始形成小的突起，突起不斷的生長(zhǎng)變大，形成白色次生胚狀體，次生胚狀體繼續(xù)分化形成魚(yú)雷型胚，然后逐漸形成芽的前體（圖1-C、1-D）。培養(yǎng)2個(gè)月后不同處理產(chǎn)生的次生胚個(gè)數(shù)為14.0～31.6個(gè)，RYL02在M3培養(yǎng)基中獲得的次生胚數(shù)最高為31.6個(gè)，RYL04在M3培養(yǎng)基中獲得的次生胚數(shù)最高為29.6個(gè)，RYL06在M2培養(yǎng)基中獲得的次生胚數(shù)最高為31.6個(gè)。對(duì)品種、培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時(shí)間的多元方差分析和多重比較分析結(jié)果見(jiàn)表3、4。在誘導(dǎo)次生胚的培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基的種類對(duì)次生胚誘導(dǎo)的影響達(dá)顯著差異，而品種類型對(duì)次生胚誘導(dǎo)的影響差異不顯著，次生胚的數(shù)量隨著時(shí)間的增加而不斷增加，3種處理對(duì)次生胚誘導(dǎo)數(shù)量的影響大小為：培養(yǎng)基>培養(yǎng)時(shí)間>品種。

3 討論與結(jié)論

通過(guò)體胚發(fā)生途徑建立油棕組織培養(yǎng)技術(shù)體系，其初生胚的誘導(dǎo)比較困難，且誘導(dǎo)率也比較低，因此胚的誘導(dǎo)是整個(gè)油棕組織培養(yǎng)過(guò)程中最關(guān)鍵的技術(shù)環(huán)節(jié)，這一現(xiàn)象在其他的棕櫚科植物，如椰子、海棗、檳榔等同樣發(fā)生[10-12]。植物外源激素對(duì)油棕胚的誘導(dǎo)影響作用很大，二氯苯氧乙酸即2，4-D在油棕胚的誘導(dǎo)中，作用效果明顯。近年來(lái)，關(guān)于油棕組織培養(yǎng)技術(shù)的報(bào)道中，2，4-D、毒莠定、麥草畏等植物外源激素都有使用，但2，4-D的使用更加廣譜。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2，4-D在初生胚誘導(dǎo)的過(guò)程中通用性較好，在3種不同基因型的油棕品系中，胚誘導(dǎo)率圴達(dá)到了比較高的水平。但在后續(xù)芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，筆者發(fā)現(xiàn)，使用毒莠定的出芽率及芽發(fā)育的質(zhì)量效果會(huì)更好。

次生胚誘導(dǎo)和增殖途徑是油棕實(shí)現(xiàn)體胚增殖很有效的一種途徑，可以彌補(bǔ)前期油棕初生胚誘導(dǎo)率較低的缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)油棕組培苗數(shù)量上的大規(guī)模繁育。從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果看，在油棕次生胚培養(yǎng)階段，不同基因型即不同油棕品種差異的影響不顯著，如果在前期能夠培養(yǎng)獲得油棕初生胚，后期的次生胚培養(yǎng)可通過(guò)比較一致的方法進(jìn)行增殖培養(yǎng)。同時(shí)，基本培養(yǎng)基的組成成分對(duì)油棕次生胚的誘導(dǎo)和再生具有顯著的影響。本實(shí)驗(yàn)所選擇的3種基本培養(yǎng)基中，MS是通用性較強(qiáng)的培養(yǎng)基[13]；WPM是針對(duì)木本植物培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基[14]；Y3培養(yǎng)基的成分比較復(fù)雜，常用于椰子等棕櫚植物的組織培養(yǎng)[15]。從誘導(dǎo)效果來(lái)看，WPM培養(yǎng)基和Y3培養(yǎng)基的作用明顯優(yōu)于MS培養(yǎng)基，這表明在無(wú)機(jī)鹽相對(duì)較低的環(huán)境下可能比較利于次生胚的誘導(dǎo)；而WPM和Y3培養(yǎng)基比較，前者的組分相對(duì)后者簡(jiǎn)單，更利于大規(guī)模的商業(yè)化生產(chǎn)。

參考文獻(xiàn)

[1] 李洪清，梁承鄴，黃毓文，等. 影響木薯次生胚狀體發(fā)生及植株再生因素的研究[J]. 廣西植物，1999，19（3）：246-250.

[2] 孫艷香，楊紅梅，尹 軍，等. 紫花苜蓿高頻體細(xì)胞胚與次生胚再生體系的建立[J]. 南開(kāi)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007，53（4）：1-6

[3] Giridhar P，Indu E P，Ravishankar G A，et al. Influence of triacontanol on somatic embryogenesis in Coffea arabica L. and Coffea canephora P. ex. Fr[J]. In Vitro Cellular Developing Biological Plant， 2004， 40（1）： 200-203.

[4] Rabechault H，Ahee J，Guenin G. Recherches sur la culture in vitro des embryos de palmier a huile （Elaeis guineensis Jacq.）. XII. Effects de substances de croissance a des doses supraoptimales. Relation avec le brunissement des tissues[J]. Oleagineux， 1976， 31（1）： 159-163.

[5] Zamzuri I， Mohd A S， Rajanaidu N， et al. Commercial feasibility of clonal oil palm planting material production[R]. PORIM Occasional Paper， 1999（40）： 52.

[6] Corley R H V， Tinker P B H. The oil palm[M]. Hoboken： John Wiley & Sons Ltd， 2008.

[7] 崔元方，龔 崢， 陳幸華，等. 油棕胚愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生的研究[J]. Journal of Integrative Plant Biology，1986，28（6）：582-588.

[8] 龔 崢，崔元方，陳幸華，等. 油棕葉片愈傷組織的誘導(dǎo)[J]. 熱帶作物研究，1987，7（3）：15-18.

[9] 鄒積鑫，尤麗莉，林位夫. 影響油棕葉片愈傷組織誘導(dǎo)因素研究[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，34（2）：54-58.

[10] Karunaratne S，Periyapperuma K. Culture of immature embryos of coconut， Cocos nucifera L： callus proliferation and somatic embryogenesis[J]. Plant Science， 1989， 62（2）： 247-253.

[11] Eshraghi P，Zarghami R，Mirabdulbaghi M. Somatic embryogenesis in two Iranian date palm cultivars[J]. African Journal of Biotechnology， 2005， 4（11）：1 309-1 312.

[12] Radha E， Karun A， Ananda K S， et al. Plantlet regeneration via direct and indirect somatic embryogenesis from inflorescence explants of arecanut palms（Areca catechu L.）[J]. Journal of Plantation Crops，2006， 34（3）： 540.

[13] Murashige T，Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures[J]. Physiol Plant， 1962， 15（3）： 473-497.

[14] Lloyd G， McCown B. Commercially-feasible micropropagation of mountain laurel， Kalmia latifolia， by use of shoot tip culture[J]. Int Plant Prop Soc Proc， 1981， 30（3）： 421-427.

[15] Eeuwens， C J. Mineral requirements for growth and callus initiation of tissue explants excised from mature coconut palms（Cocos nucifera）and cultured in vitro[J]. Physiologia Plantarum， 1976， 36（1）： 23-28.