過(guò)度激活的Rho/ROCK通路介導(dǎo)的心肌缺血再灌注損傷及貝那普利的改善作用

劉曉波 顧靖華 許驥 陳新 何佳 陳海庭 陳銳勇

[摘要] 目的 該研究探索過(guò)度激活的Rho/ROCK信號(hào)通路在缺血再灌注損傷中的參與機(jī)制及貝那普利的改善作用。 方法 SD大鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組、缺血再灌注組、Y27632組和貝那普利組。采用大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎法復(fù)制心肌缺血再灌注模型，Y27632組和貝那普利組分別給予對(duì)應(yīng)藥物灌胃治療。分析各組血清中MDA、SOD、GSHpx、Rho/ROCK、MMP2/9及Bax/Bcl2和Caspase3/9的表達(dá)。結(jié)果 模型組血清MDA水平明顯增高（15.6→24.1 μg/mL）而SOD（83.1→34.6 U/mL）水平明顯降低，Rho/ROCK（0.18→0.64；0.19→0.69；0.16→0.65）、MMP2/9（0.28→0.60；0.27→0.63）、Caspase9表達(dá)明顯增強(qiáng)（0.25→0.68）。Y27632和貝那普利組大鼠的上述異常得到顯著的改善。結(jié)論 貝那普利通過(guò)抑制過(guò)度激活的Rho/ROCK、激活的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路、改善細(xì)胞外基質(zhì)降解與重構(gòu)發(fā)揮保護(hù)缺血再灌注大鼠心肌損傷的作用。

[關(guān)鍵詞] Rho/ROCK通路；缺血再灌注；心肌損傷；貝那普利；細(xì)胞凋亡

[中圖分類號(hào)] R614 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2016）03（c）-0117-04

Participation Mechanism of Excessively Activated Rho/ROCK Signaling Pathway in Cardiac Reperfusion Injury and Improvement Effect of Benazepril

LIU Xiao-bo， GU Jing-hua， XU Ji， CHEN Xin， HE Jia， CHEN Hai-ting， CHEN Rui-yong

Diving Medical Research Laboratory，Naval Medical Research Institute of PLA， Shanghai， 200433 China

[Abstract] Objective To study the participation mechanism of excessively activated Rho/ROCK signaling pathway in cardiac reperfusion injury and improvement effect of benazepril. Methods The SD rats were randomly divided into 4 groups， namely sham operation group， ischemic reperfusion group， Y27632 group and benazepril group， the cardiac reperfusion injury model was copied by ligating the left anterior descending coronary artery in rats， the Y27632 group and benazepril group were respectively treated with corresponding drug gavage， the expressions of MDA， SOD， GSHpx， Rho/ROCK， MMP2/9， Bax/Bcl2 and Caspase3/9 in serum of all groups were analyzed. Results The serum NDA level in the model group obviously increased （15.6→24.1 μg/mL）， but the SOD （83.1→34.6 U/mL） level obviously decreased， the expressions of Rho/ROCK （0.18→0.64；0.19→0.69；0.16→0.65）， MMP2/9 （0.28→0.60；0.27→0.63） and Caspase9 were obviously enhanced （0.25→0.68）， the above abnormalities in the Y27632 group and benazepril group were obviously improved. Conclusion Benazepril plays a protection role in rats with cardiac reperfusion injury by suppressing the excessively activated Rho/ROCK， activated cell apoptosis signaling pathway and improving extracellular matrix degradation and reconstruction.

[Key words] Rho/ROCK signaling pathway； Ischemia reperfusion； Myocardial injury； Benazepril； Apoptosis

缺血再灌注損傷即在一定條件下機(jī)體恢復(fù)血液再灌注后缺血性損傷進(jìn)一步加重的現(xiàn)象[1-3]。缺血再灌注可引起機(jī)體多種器官的損傷，尤其是心肌組織，但對(duì)其損傷的確切機(jī)制尚未完全闡明。Rho/ROCK（Ras homologue/Rho Associate Kinase）信號(hào)通路機(jī)體內(nèi)存在的一種與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化有關(guān)的信號(hào)通路，廣泛參與機(jī)體的多種病理及生理過(guò)程[4-5]。Rho/ROCK信號(hào)通路主要由Rho蛋白、ROCK1和ROCK2蛋白組成，通過(guò)上調(diào)下游系列蛋白發(fā)揮作用[6]。研究共使用SD大鼠24只，自2013年5月—2014年12月在該單位實(shí)驗(yàn)中心完成。該研究探索過(guò)度激活的Rho/ROCK信號(hào)通路在缺血再灌注損傷中的參與機(jī)制及貝那普利的改善作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

24只8周齡SD大鼠購(gòu)自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雌性不拘，體重220～240 g，許可證號(hào)SZXK（浙）20080033，動(dòng)物于（55±5）%濕度，（20±2）℃條件下給予標(biāo)準(zhǔn)飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由飲食；Y27632、貝那普利均購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich公司；RhoA、ROCK1/2、MMP2/9及Caspase3/9一抗均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz；二抗及顯色試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司；其余試劑均為市售分析純。所有操作均符合上海市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例。

1.2 缺血再灌注大鼠模型復(fù)制

所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，自由飲食。24只SD大鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組、缺血再灌注組、Y27632組及貝那普利組（n=6）。采用冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎大鼠建立大鼠心肌缺血再灌注模型：結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支前0.5 h從右腔靜脈注射生理鹽水，結(jié)扎左前降支0.5 h后松開(kāi)并再行灌注2 h。假手術(shù)組僅穿線但不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支。Y2632組（20 mg/kg）和貝那普利組（20 mg/kg）于結(jié)扎前0.5 h于右腔靜脈注射相應(yīng)藥物。造模結(jié)束后逐層縫合肌肉、皮膚，大鼠手術(shù)切口處注射少許青霉素注射液防止手術(shù)感染。

1.3 生化指標(biāo)及免疫印跡法

血清MDA、SOD及GSHpx試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。所有實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。免疫印跡法參照以往報(bào)道方法進(jìn)行[5]。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，并采用 t 檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺血再灌注大鼠異常的MDA、SOD及GSHpx

研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注大鼠血清MDA水平明顯增高（15.6→24.1 μg/mL）而SOD水平明顯降低（83.1→34.6U/mL）（P=0.006），而貝那普利和Y27632對(duì)上述異常有顯著的改善作用（P=0.008），見(jiàn)圖1。

2.2 缺血再灌注大鼠異常表達(dá)的RhoA及ROCK1/2

研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注大鼠心肌組織RhoA（0.18→0.64）及ROCK1/2（0.19→0.69；0.16→0.65）水平明顯增高（P=0.004，P=0.002，P=0.003），而貝那普利和Y27632對(duì)上述異常有顯著的改善作用（P=0.005，P=0.003，P=0.007），見(jiàn)圖2。

2.3 缺血再灌注大鼠異常表達(dá)的MMP2/9

2.4 缺血再灌注大鼠異常表達(dá)的Caspase3/9

3 討論

缺血再灌注存在于多種病理過(guò)程中，會(huì)對(duì)機(jī)體多種組織造成嚴(yán)重的損傷，尤其是心肌組織。心肌缺血再灌注損傷表現(xiàn)為心肌組織中心肌細(xì)胞壞死、細(xì)胞內(nèi)存在過(guò)多氧自由基，甚至發(fā)生細(xì)胞凋亡，并導(dǎo)致心律失?；蛐氖沂湛s力減弱[7]。該研究探索過(guò)度激活的Rho/ROCK信號(hào)通路在缺血再灌注損傷中的參與機(jī)制及貝那普利的改善作用是發(fā)現(xiàn)模型組血清MDA水平明顯增高（15.6→24.1 μg/mL）而SOD（83.1→34.6 U/mL）水平明顯降低，Rho/ROCK（0.18→0.64；0.19→0.69；0.16→0.65）、MMP2/9（0.28→0.60；0.27→0.63）、Caspase9表達(dá)明顯增強(qiáng)（0.25→0.68）。Y27632和貝那普利組大鼠的上述異常得到顯著的改善。因此，貝那普利通過(guò)抑制過(guò)度激活的Rho/ROCK、激活的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路改善缺血再灌注大鼠心肌損傷。

ROCK是與細(xì)胞凋亡相關(guān)的激酶，參與調(diào)解細(xì)胞的多種生理功能，如增殖、分化、凋亡、收縮及粘附等。在心血管系統(tǒng)中，RhoA/ROCK通路也與血管再狹窄、肺動(dòng)脈高壓、心肌肥厚、高血壓以及心力衰竭等病理過(guò)程密切相關(guān)。研究證實(shí)，壓力負(fù)荷可以促進(jìn)心肌肥厚的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程，且此過(guò)程中存在RhoA/ROCK相關(guān)蛋白的上調(diào)表達(dá)（RhoA：126.2%；ROCK1：108.8%），而藥物干預(yù)可以通過(guò)抑制上調(diào)的RhoA/ROCK表達(dá)（RhoA：123.5%；ROCK1：105.1%）改善心肌肥厚的進(jìn)展[8]。與上述研究結(jié)論相似，該研究也發(fā)現(xiàn)冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎復(fù)制的缺血再灌注心肌損傷模型中心肌組織RhoA及ROCK1/2的表達(dá)明顯增強(qiáng)（RhoA：0.18→0.64；ROCK1：0.19→0.69；ROCK：0.16→0.65），而內(nèi)那普利可以顯著抑制該通路的異常發(fā)揮抑制心肌損傷的作用。該研究中也證實(shí)，冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎復(fù)制的缺血再灌注心肌損傷模型中心肌組織中促凋亡蛋白Caspase9表達(dá)明顯增強(qiáng)，而內(nèi)那普利可以通過(guò)抑制ROCK通路抑制心肌細(xì)胞的凋亡。但是，該研究中所采用的Y27632為特異性的ROCK蛋白抑制劑，而對(duì)Rho蛋白表達(dá)無(wú)明顯的調(diào)控作用。在以后的研究中將采用Rho蛋白特異性抑制劑進(jìn)行干預(yù)，進(jìn)一步分析Rho/ROCK通路中各個(gè)蛋白在此病理過(guò)程中的具體作用，為臨床精準(zhǔn)治療提供參考。

因此，貝那普利通過(guò)抑制過(guò)度激活的Rho/ROCK、激活的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路、改善細(xì)胞外基質(zhì)降解與重構(gòu)發(fā)揮缺血再灌注大鼠心肌損傷的保護(hù)作用。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 吳鵬程，張文芳，張書(shū). VEGF和MMP-9在大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中表達(dá)及相關(guān)性研究[J]. 國(guó)際眼科雜志，2014，8（5）：815-818.

[2] 趙朝華， 吳樹(shù)強(qiáng)， 茍興春， 等. 姜黃素對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中NO 和S100β水平的影響[J]. 吉林大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2014，6（5）：223-225.

[3] 趙雅君，王艷麗，杜麗娟，等. 精胺預(yù)處理對(duì)離體灌流大鼠心肌缺血/再灌注損傷及細(xì)胞凋亡的影響[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2012（8）：1135-1140.

[4] 王吉萍，郭曉華，王陵軍，等. Rho/ROCK信號(hào)通路參與晚期糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)的人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)改變[J]. 生理學(xué)報(bào)，2009（2）：132-138.

[5] 王保奇，殷子杰，程志清. 三參飲對(duì)病毒性心肌炎慢性期Rho/Rock信號(hào)通路的作用[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014（6）：140-144.

[6] 陳艷霞，房向東，涂衛(wèi)平. Rho/ROCK信號(hào)通路與糖尿病腎病[J]. 生命的化學(xué)，2014（2）：275-279.

[7] 陳輝，黃政德. Bcl-2、Bax與心肌缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014（9）：116-120.

[8] 常文靜，趙凌杰，趙智明，等. 丹參酮ⅡA對(duì)壓力負(fù)荷增加大鼠心肌肥厚的抑制作用[J]. 心臟雜志，2013，3：311-316.