姜辣素拮抗掌葉半夏毒針晶刺激性毒性的機制研究お

金羊平 吳皓 郁紅禮 潘耀宗 陳葉青 王奎龍 張程超 王衛(wèi)

[摘要]為探索姜辣素拮抗掌葉半夏毒針晶刺激性毒性的機制，該研究采用掌葉半夏毒針晶誘導的小鼠腹腔炎癥模型，觀察姜辣素對小鼠腹腔炎癥滲出液中炎癥介質PGE2的影響；采用大鼠腹腔巨噬細胞體外培養(yǎng)模型，以上清液中TNFα和IL1β為指標，研究姜辣素拮抗掌葉半夏毒針晶的致炎作用；采用掃描電鏡法觀察姜辣素拮抗掌葉半夏毒針晶刺激后巨噬細胞表面形態(tài)的改變；采用巨噬細胞中性粒細胞共培養(yǎng)模型，考察姜辣素拮抗掌葉半夏毒針晶對中性粒細胞遷移的影響。結果顯示，姜辣素可以顯著抑制掌葉半夏毒針晶所致的小鼠腹腔滲出液中PGE2的生成；姜辣素可以顯著抑制掌葉半夏毒針晶誘導巨噬細胞釋放炎癥因子，并具有一定的量效關系；掃描電鏡顯示，姜辣素可以顯著抑制巨噬細胞吞噬掌葉半夏毒針晶及細胞膜破損，并能顯著抑制掌葉半夏毒針晶誘導的中性粒細胞遷移。姜辣素拮抗掌葉半夏毒針晶刺激性毒性的機制可能是抑制了包括巨噬細胞激活、炎癥因子釋放、中性粒細胞遷移聚集的致炎毒性。

[關鍵詞]姜辣素； 掌葉半夏； 巨噬細胞； 炎癥因子； 掃描電鏡； 中性粒細胞趨化

掌葉半夏，又名虎掌南星，為天南星科植物掌葉半夏Pinellia pedatisecta Schott的干燥塊莖，最早記載于《神農本草經》[1]，為天南星科有毒中藥且毒性最強，對口腔、咽喉等具有強烈的刺激性[2]。

本課題組前期研究證實，掌葉半夏刺激性毒性成分主要是蛋白和草酸鈣結合形成的針晶復合物，被稱為“毒針晶”[3]，電鏡下毒針晶極細長、兩頭尖銳、質堅韌，具倒刺、凹槽[4]。毒理研究顯示，掌葉半夏的毒針晶在機體表現為刺激性炎性反應。誤食后在口腔咀嚼或吞咽的作用力下，大量毒針晶可刺入口腔及咽喉的黏膜組織，毒針晶刺入的同時針晶上的毒蛋白進入組織細胞誘發(fā)急性炎癥，故掌葉半夏的刺激性毒性是毒針晶刺入的機械刺激和毒蛋白化學刺激的雙重作用[56]。

生姜是姜科植物姜Zingiber officinale Rosc的根莖。生姜味辛，性溫；歸肺、胃、脾經；功效為發(fā)散風寒、溫中止嘔、化痰解毒，民間多用于解藥物和食物中毒。生姜及生姜提取物具有廣泛的藥理作用，包括調節(jié)免疫、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、止嘔等藥理作用。生姜的塊莖中含有多種化學成分，主要包括揮發(fā)油類、姜辣素、二苯基庚烷，其中姜辣素類成分是生姜抗炎的有效成分[7]。

課題組前期研究顯示，掌葉半夏刺激性毒性與其刺激巨噬細胞相關[810]。炎癥反應最重要的功能是將炎癥細胞輸送到炎癥局部，白細胞的滲出是炎癥反應最重要的特征，所以中性粒細胞遷移是炎癥反應中至關重要的一步，起到主要的防御作用。故本文采用腹腔注射掌葉半夏毒針晶致小鼠腹腔炎癥模型、大鼠腹腔巨噬細胞（MΦ）體外培養(yǎng)模型及體外中性粒細胞共遷移模型，深入研究姜辣素拮抗掌葉半夏毒針晶對巨噬細胞的致炎作用，為深入闡釋生姜解掌葉半夏及整個天南星科有毒中藥的毒性作用機制提供依據。

1材料

BP211D電子天平（德國Sartorius公司）；LDZ2（Y）低速離心機（北京京立有限公司）；Spectra Max 190酶標儀（美國AD公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（美國NUAIRE公司）；LEICA MPS 60 DM顯微鏡系統(tǒng)（德國萊卡公司）； IB5離子濺射儀（日本日立公司）； SEM505掃描電子顯微鏡（荷蘭飛利浦公司）。

胎牛血清（美國WISENT 公司）；RPMI 1640培養(yǎng)液（美國Hyclone公司）；trasnwell小室，48孔培養(yǎng)板（美國Corning公司）；DextranT500（葡聚糖）（美國Pharmacia公司），Percoll分離液；快速瑞姬氏染液（南京建成生物工程研究所）；TNFα，IL1β ELISA試劑盒（美國Ebioscience公司）；Mouse PGE2 ELISA試劑盒（南京翼飛雪生物科技有限公司）；臺盼藍（南京化學試劑有限公司）；非特異性酯酶染液（南京建成生物有限公司）；戊二醛（電鏡級，美國Alfa公司）；乙醇（色譜純，國藥集團化學試劑有限公司）；生理鹽水（南京小營藥業(yè)集團）；PBS緩沖液（實驗室自制，高壓蒸氣滅菌）；羧甲基纖維素鈉（化學純，國藥集團化學試劑有限公司），相關溶液均使用去離子水配制。

SD大鼠，SPF級，雄性，體重200～220 g，由浙江省實驗動物中心提供，許可證號SCXK（浙）20140001；ICR小鼠，清潔級，雄性，體重20～22 g，由揚州大學比較醫(yī)學中心提供，許可證號SCXK（蘇）20120004。

掌葉半夏采自河南省禹州市，藥材經南京中醫(yī)藥大學王春根教授鑒定為天南星科植物掌葉半夏Ppedatisecta的塊莖。生姜藥材購自南京市農貿市場，經南京中醫(yī)藥大學劉訓紅教授鑒定為姜科植物姜的新鮮根莖。

2方法

21樣品制備

211掌葉半夏毒針晶的分離純化取鮮掌葉半夏適量，去皮切碎，置于研缽內，加入適量的有機溶劑，進行研磨，重復2～3次，將研磨提取的混懸液合并，先用4層醫(yī)用紗布過濾，濾液再經過022 μm微孔濾膜抽濾，得到的白色濾餅即為掌葉半夏毒針晶[11]。

212生姜姜辣素的制備取鮮生姜適量，切碎，低溫烘干，打成粗粉，用10倍量乙酸乙酯加熱回流2 h，重復2次，回收溶劑，得到乙酸乙酯浸膏；水蒸氣提取除去揮發(fā)油，得到姜辣素部位[12]，得率為09%。

以6姜酚為對照品，采用紫外分光光度法對生姜姜辣素部位中總姜辣素含量進行測定。結果顯示，生姜姜辣素部位中總姜辣素質量分數為8928%。

22姜辣素拮抗掌葉半夏毒針晶刺激性毒性作用研究

221姜辣素對掌葉半夏毒針晶致小鼠腹腔炎癥滲出液中PGE2含量的影響取小鼠60只，隨機分為6組，空白組、毒針晶組、阿司匹林組（25 g·kg-1）、姜辣素高劑量組（8 g·kg-1）、姜辣素中劑量組（4 g·kg-1）、姜辣素低劑量組（2 g·kg-1）。實驗前1 d晚上禁食不禁水，實驗時小鼠腹腔注射1 g·L-1掌葉半夏毒針晶生理鹽水混懸液，空白組腹腔注射生理鹽水001 mL·g-1。各組立即灌胃給予相應藥物，姜辣素高、中、低劑量組分別灌以8，4，2 g·kg-1姜辣素05% CMCNa混懸液，空白組和毒針晶組均灌以05% CMCNa溶液，阿司匹林組灌以025 g·kg-1阿司匹林05% CMCNa混懸液，002 mL·g-1。1 h后處死，立即向每只小鼠腹腔注射生理鹽水10 mL，輕揉腹部使之混勻。在5 min內取出小鼠腹腔內全部溶液置刻度離心管中，得到小鼠腹腔滲出液。取滲出液，按ELISA試劑盒方法測定前列腺素E2（PGE2）的含量[8]。

222巨噬細胞的提取分離純化將健康大鼠脫頸椎處死，加入75%乙醇浸泡3 min后取出，腹腔注射20 mL PBS緩沖液，輕揉腹部5 min，使PBS緩沖液散布于整個腹腔，收集腹腔液，1 000 r·min-1離心5 min，得到富含巨噬細胞的沉淀。棄去上清，沉淀用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸并調節(jié)細胞密度至1×106個/mL，將此密度的細胞接種于細胞板中，37 ℃，5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)2 h后，用PBS緩沖液洗去未貼壁的細胞，未被洗去的貼壁細胞即為所需的巨噬細胞，非特異性酯酶染色鑒定巨噬細胞純度為99%；臺盼藍染色鑒定細胞存活率為99%[9]。

223人外周血中性粒細胞的分離純化無菌采集健康志愿者的外周靜脈血，加EDTAK2抗凝，取5 mL，加等量生理鹽水稀釋，再加1/3體積的6% T500，混合后靜置30 min，吸取上清于1 500 r·min-1離心10 min， 棄去上清液，沉淀用1 mL RPMI 1640培養(yǎng)液重懸。100%的Percoll細胞分離液用無菌生理鹽水分別配成75%，60% 2種不同密度的分離液，在離心管中依次加入75% Percoll，60% Percoll和細胞懸液，于2 500 r·min-1離心20 min，收集2層分離液中間的細胞層，并用PBS緩沖液清洗2遍，即得到純化的中性粒細胞[9]。

224姜辣素拮抗掌葉半夏毒針晶誘導巨噬細胞釋放炎癥因子取222項下分離純化的巨噬細胞用PBS緩沖液清洗數次，并加入新鮮配制的含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液。取適量掌葉半夏毒針晶于紫外燈下充分照射滅菌，用 PBS緩沖液配成針晶混懸液。將培養(yǎng)的巨噬細胞分成7組，每組設置3個復孔，其中6組給予半夏毒針晶混懸液，使終濃度為50 mg·L-1；空白組給予相同體積的PBS緩沖液，搖晃均勻后于37 ℃，5% CO2環(huán)境中孵育，10 min后其中2組給予阿司匹林溶液，使終濃度為25，50 mg·L-1；另外3組分別給予對應濃度的姜辣素溶液， 使終濃度為25，50，100 mg·L-1。孵育1 h后收集細胞上清液，上清液中炎癥因子TNFα和IL1β的水平按照ELISA試劑盒說明書的方法分別進行檢測[9]。

225姜辣素拮抗掌葉半夏毒針晶對巨噬細胞形態(tài)的影響大鼠腹腔巨噬細胞以1×106個/mL的密度接種于內置無菌蓋破片的6孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)成血清饑餓狀態(tài)。掌葉半夏毒針晶經紫外照射充分滅菌后，用PBS緩沖液配制成針晶混懸液。培養(yǎng)的巨噬細胞分為5組，每組設2個復孔。其中4組加入等體積的掌葉半夏毒針晶混懸液，使終濃度保持為50 mg·L-1，其中3組分別同時加入不同質量濃度的姜辣素溶液（25，50，100 mg·L-1）；空白組加入等體積的PBS緩沖液，放置于37 ℃，5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)。培養(yǎng)1 h后中止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，用PBS緩沖液清洗，最后用25%戊二醛4 ℃固定過夜。載有固定好的巨噬細胞的蓋玻片用30%，50%，70%，80%，90%，100%乙醇逐級脫水，噴金，并在掃描電鏡下以6 000倍放大觀察巨噬細胞的形態(tài)，并拍攝照片[9]。

226姜辣素拮抗掌葉半夏毒針晶刺激巨噬細胞引起的中性粒細胞遷移本實驗采用transwell小室模型，上室中加入RPMI 1640混勻的中性粒細胞懸液100 μL，密度為1×106個/mL，下室中分別為：①預培養(yǎng)的巨噬細胞+PBS緩沖液；②預培養(yǎng)的巨噬細胞+PBS緩沖液配制的掌葉半夏毒針晶混懸液，使其終濃度為50 mg·L-1；③預培養(yǎng)的巨噬細胞+掌葉半夏毒針晶混懸液（50 mg·L-1）+姜辣素溶液（25，50，100 mg·L-1）。

每組設置3個復孔。于37 ℃，5% CO2中培養(yǎng)1 h后，將小室取出，用棉簽將小室上表面的殘留細胞除去，并用快速瑞姬氏染色試劑盒對小室下表面細胞進行染色，于顯微鏡400倍鏡下觀察，并對穿過微孔膜的著色中性粒細胞進行計數[13]。

3結果

31姜辣素對掌葉半夏毒針晶致小鼠腹腔炎癥滲出液中PGE2含量的影響

毒針晶組與空白組比較有顯著性差異（P<00l），說明掌葉半夏毒針晶能造成小鼠腹腔炎癥液中PGE2含量顯著增高；而姜辣素組能顯著地抑制掌葉半夏毒針晶所致的小鼠腹腔炎癥滲出液中PGE2合成與釋放，并呈一定的劑量依賴性（圖1）。

與空白組比較1）P<001；與毒針晶組比較2）P<001（圖2，4同）。

32姜辣素拮抗掌葉半夏毒針晶對巨噬細胞釋放炎癥因子的影響

姜辣素拮抗掌葉半夏毒針晶誘導巨噬細胞釋放炎癥因子，與掌葉半夏毒針晶模型組相比，不同質量濃度的姜辣素（25，50，100 mg·L-1）均能顯著抑制巨噬細胞釋放的炎癥因子TNFα和IL1β的水平，并且這種抑制作用呈一定的量效相關（圖2）。

33姜辣素拮抗掌葉半夏毒針晶對巨噬細胞形態(tài)的影響

與半夏毒針晶組相比，加入不同質量濃度的姜辣素（25，50，100 mg·L-1），可以不同程度的抑制巨噬細胞的皺縮、偽足增多、細胞膜破損，并且高濃度的姜辣素組可以使活化的巨噬細胞恢復至正常狀態(tài)（圖3）。結果表明，姜辣素能夠抑制掌葉半夏毒針晶激活巨噬細胞吞噬異物的功能。

34姜辣素拮抗掌葉半夏毒針晶刺激巨噬細胞對中性粒細胞趨化的影響

與毒針晶模型組相比，加入姜辣素（25，50，100 mg·L-1）組中性粒細胞遷移數量顯著降低，這表明姜辣素抑制了掌葉半夏毒針晶刺激巨噬細胞引起的中性粒細胞遷移，并呈一定的劑量依賴性，此結果進一步證實了姜辣素可以顯著抑制掌葉半夏毒針晶的致炎作用（圖4）。

4討論

本文實驗結果表明，姜辣素灌胃給藥能明顯減輕掌葉半夏毒針晶所致的炎癥反應，口服姜辣素能顯著降低毒針晶所致小鼠腹腔炎癥介質PGE2的生成，且這種拮抗作用呈劑量依賴性，說明生姜確實可以降低因服用掌葉半夏而導致的一些毒副作用。實驗將阿司匹林作為陽性對照，結果阿司匹林也能明

顯降低掌葉半夏毒針晶所致的炎癥反應，表明阿司

匹林作為解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥具有確切的抗炎作用，也可進一步說明掌葉半夏毒針晶確實能導致刺激性炎癥反應。

實驗中各模型掌葉半夏毒針晶致炎劑量的確定，采用掌葉半夏毒針晶的量毒曲線和時毒曲線進行考察，結果小鼠腹膜炎模型選擇01%掌葉半夏毒針晶劑量；參考中醫(yī)臨床生姜解半夏中毒的用量30 g，相當于小鼠灌胃劑量4 g·kg-1。從實驗結果看，此劑量對掌葉半夏毒針晶引起的炎癥反應均具有較好的抑制作用，能減少炎癥介質的合成與釋放，降低炎癥組織水腫。

本文選擇大鼠腹腔巨噬細胞體外培養(yǎng)、巨噬細胞中性粒細胞共培養(yǎng)2個模型，根據課題組前期研究結果選擇掌葉半夏毒針晶50 mg·L-1作為致炎濃度，研究姜辣素拮抗掌葉半夏毒針晶的刺激性毒性機制。結果顯示，姜辣素能夠顯著拮抗掌葉半夏毒針晶刺激巨噬細胞釋放炎癥因子；掃描電鏡顯示，姜辣素可以顯著抑制巨噬細胞激活、偽足增多，細胞變形、細胞膜破損，說明姜辣素可以抑制巨噬細胞吞噬異物的功能；巨噬細胞中性粒細胞共培養(yǎng)實驗表明，姜辣素能夠抑制掌葉半夏毒針晶刺激巨噬細胞引起的中性粒細胞趨化，并呈一定的劑量依賴性。故姜辣素拮抗掌葉半夏毒針晶刺激性毒性的機制可能是抑制了包括巨噬細胞激活、吞噬異物、炎癥因子

釋放、中性粒細胞遷移聚集，最終抑制了強烈的炎癥反應的發(fā)生。

天南星科有毒中藥半夏、掌葉半夏、天南星、白附子均含有毒針晶，本課題組研究發(fā)現，以上 4 種中藥毒針晶是其共性毒性成分。本文從細胞分子水平上初步闡釋了生姜解掌葉半夏毒的作用機制，為進一步揭示天南星科有毒中藥的炮制解毒機制及安全性評價提供理論依據。

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[責任編輯馬超一]