人參果蔬酵素中人參皂甙含量的測定

陳書華，姜旭，張念潔（.延邊朝鮮族自治州產品質量檢驗所，吉林延吉33000；2.北京澤優(yōu)醫(yī)藥科技有限公司，北京00000）

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人參果蔬酵素中人參皂甙含量的測定

陳書華1，姜旭2，*，張念潔1
（1.延邊朝鮮族自治州產品質量檢驗所，吉林延吉133000；2.北京澤優(yōu)醫(yī)藥科技有限公司，北京100000）

摘要：建立高效液相法色譜測定人參果蔬酵素中的人參皂甙Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd的含量，用于評價產品的優(yōu)劣。色譜條件：DiamonsilC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，流動相為乙腈與0.05 mol/L磷酸二氫鉀水溶液，流速1 mL/min，梯度洗脫檢測波長為203nm。該方法對人參皂甙Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd具有良好的線性，相關系數在

0.9993～0.9999之間；重復性和精密度良好，樣品加標回收率在92.00%～101.50%之間。RSD小于5%；檢出限低。該方法線性范圍廣，準確性和精密度良好，操作較簡便，結果滿意，能滿足日常檢驗要求。

關鍵詞：人參果蔬酵素；人參皂甙；高效液相色譜

微生物酵素是以一種或多種新鮮蔬菜、水果、菌菇、中草藥等為原料，經多種有益菌發(fā)酵而產生的，含有豐富的維生素、酶、礦物質和次生代謝產物等營養(yǎng)成分的功能性微生物發(fā)酵產品。微生物酵素不但保存了發(fā)酵原料中所固有的營養(yǎng)物質，而且有不少有效成分大量增加，并產生了一些新的生物活性成分和生物酶[1]。研究證明：免疫系統是人機體內一個重要的感受和調節(jié)系統，益生菌和各種酶（酵素）使免疫細胞固有的識別和記憶功能正常。當免疫細胞因為識別和記憶發(fā)生障礙，攻擊和損傷正常細胞組織時，會發(fā)生自身免疫疾病。如I型胰島素依賴糖尿病，可能就是免疫細胞對胰腺中B細胞進行破壞，控制血糖胰島素的分泌減少，補充人參果蔬酵素調節(jié)免疫細胞的功能，提高免疫細胞的識別能力，使免疫功能逐步的恢復到動態(tài)平衡，進而達到對治療糖尿病的輔助治療的作用。

人參果蔬酵素是由人參、蔬菜和水果為原料，經過科學的生物轉化技術精制而成的純天然的植物飲料，營養(yǎng)完整的酵素是萃取自人參及多種天然果蔬植物精華，再以植入有益菌種轉化成熟的全機能性天然食品，富含多種維生素、礦物質和人體必需的氨基酸等，從中醫(yī)上講人參果蔬酵素具有補肝腎、益氣血、生津液、調節(jié)各個臟腑功能正常的作用。它對維護血管健康、強化微血管彈性有一定的作用。可作為高血壓、血管硬化、心臟疾病之輔助調養(yǎng)的食物，同時對預防腫瘤、抗衰老、抗心律失常、抑制細胞凋亡、降糖降脂、改善記憶、增強性功能和免疫功能及解酒等方面均有療效。人參果蔬酵素中含有人參皂甙、人參醇、人參多糖、揮發(fā)油、低分子肽、氨基酸、維生素及其有機酸和多種微量元素等多種成分，同時對于發(fā)酵液來說，發(fā)酵過程中破壞了細胞組織，有利于有效成分的浸出。對于判定該物質的優(yōu)劣，主要是從測定人參皂甙的含量來確定，人參皂甙主要包括有Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd等。含量測定方法有比色法[2]、薄層色譜法[3]、高效液相法[4]、超高速液相法[5]等。本文采用反相高效液相色譜法對人參果蔬酵素中人參皂甙Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd的含量進行了測定。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

KQ-100B超聲波清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司；1260 infinity高效液相色譜儀：美國安捷倫有限公司；Milli-Q Advantage Merck Millipore純水機：Merck Millipore USA；201s賽多利斯電子天平：北京賽多利斯儀器系統有限公司。

人參皂甙Rg1（批號AB421G）、人參皂甙Re（批號AB240G）、人參皂甙Rb1（批號AB120G）、人參皂甙Rb2（批號AB235G）、人參皂甙Rc（批號AB237G）、人參皂甙Rd（批號AB763G），以上標準品含量＞98 %：天津一方科技有限公司；乙腈、甲醇為HPLC級別：sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2色譜分析條件[6]

色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈與0.05 mol/L磷酸二氫鉀水，流動相組成見表1；流速：1 mL/min；紫外檢測波長：203 nm；進樣量：20 μL；柱溫：室溫。洗脫溶劑梯度見表1。

表1　洗脫溶劑梯度表Table 1 The gradient of elution solvent

高效液相色譜圖見圖1。

1.3對照品的制備

精密稱取人參皂甙Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd對照品，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解稀釋至刻度，超聲10min，得人參皂甙Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd對照品溶液作為儲備液，用0.25 μm針頭式濾膜過濾，初濾液棄去，續(xù)濾液備用。

1.4樣品的前處理

精密稱取人參果蔬酵素溶液20.00 g，加入甲醇置75℃水浴回流1 h，冷卻后加正丁醇提取3次，濃縮至近干，加入甲醇定容5 mL。用0.25 μm針頭式濾膜，初濾液棄去，續(xù)濾液進樣進行液相色譜測定。

2　結果與討論

2.1線性方程、方法檢測限和精密度

標準曲線的制備精密吸取人參皂甙Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd對照品2.0、4.0、6.0、8.0 mL分別置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別吸取20 μL，注入液相色譜儀，按照1.2項下的方法測定，取其中一個混合標準溶液重復測定6次，以峰面積與質量濃度進行一元線性回歸分析，計算峰面積的相對標準偏差，進行線性關系、線性范圍、檢測限和精密度的測定。6種人參皂甙在較寬的濃度范圍內均具有良好地線性、相關系數都大于0.99，檢測限較低，精密度較好，標準較好，見表2所示，最低檢出線以信噪比為3∶1計算。

表2　人參皂苷工作曲線、線性、檢測限和精密度（n=6）Table2 Theworkingcurve，linearities，detectionlimitsand RSD% of standard samples of ginsenosides（n=6）

2.2穩(wěn)定性試驗

樣品溶液，按照1.2的方法在0、2、4、8、16、24 h分別進樣20 μL，測定峰面積，結果人參Rg1+ Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd，表明樣品溶液在24 h內保持穩(wěn)定。見表3所示。

表3　人參皂苷穩(wěn)定性試驗Table 3 Stability experiments of ginsenosides

2.3重復性試驗

取同一批人參果蔬酵素樣品6份，按1.2的方法測定峰面積，見表4所示，相對標準偏差在2 %以內。

表4　人參皂甙重復性試驗Table 4 Repeated experiment of ginsenosides

2.4加樣回收率試驗

精密稱取人參果蔬酵素樣品20 g，分別加入一定量的（3個梯度濃度）人參皂甙Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd混合對照品溶液，按1.4的制備方法及1.2的條件方法進行測定，進樣分析，每個平行樣6次平行測定，計算其回收率。結果表明，平均回收率92.00 %～101.50 %之間。見表5所示。

表5　人參皂苷加樣回收率的試驗結果（n=6）Table 5 Results of recovery ratio of ginsenosides（n=6）

2.7樣品的含量測定

取按照1.4的方法處理得到的樣品處理液，按照1.2的下的方法測定，人參果蔬酵素樣品中含人參皂甙Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd的含量見表6所示。

表6　樣品中人參皂苷的含量（n=6）Table 6 The contents of in samples of ginsenosides（n=6）

3　結論

1）在樣品前處理的過程中經過多種試驗方法的比較，最終選擇該前處理方法，由于樣品劑型為果蔬酵素溶液，先用甲醇溶解去除樣品中的一些雜質及蛋白質，冷卻后加正丁醇提取3次，提取溶液中的皂甙成分。經試驗對比，該提取方法簡單易行，回收率高。

2）液相檢測方法經過多種試驗方法的比較，同時測出樣品中的人參果蔬酵素中人參皂甙Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd的含量，本方法分離效果好，快速靈敏，穩(wěn)定。可以根據人參皂甙的含量來評價酵素的優(yōu)劣，為評價提供依據。

3）最近十幾年來微生態(tài)、酵素[7]水解被應用到食品提取這個領域中來，采用酵素水解技術和生物發(fā)酵技術的處理更好的提高樣品的含量，此產品前處理簡單，易提取，這次試驗的結果為以后的制備人參皂苷制品及酵素制品提供了一定的參考價值。

參考文獻：

[1]蔣增良.天然微生物酵素發(fā)酵機理、代謝過程及生物活性研究[D].杭州:浙江理工大學,2013

[2]吳和珍,李婷婷,李菁,等.高效液相色譜法測定益智寧顆粒中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的含量[J].現代藥物與臨床,2012(4):25-27

[3]桂雙英,周亞球.比色法測定人參中人參總皂苷的含量[J].安徽中醫(yī)學報,2003(4):51-52

[4]劉志,阮長春,劉天志,等.HPLC法同時測定林下參、鮮人參、生曬參和紅參中14種人參皂苷[J].中草藥,2012,43(12):2431-2434

[5]畢曉黎.超高速液相測定西洋參中人參皂苷Rg1、Re、Rb1的含量研究[J].中國藥師,2012,15(5):651-652

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[7]張念潔,曲新砉,劉洪亮.人參和酶解人參中的人參二醇和人參三醇的含量比較[J].食品研究與開發(fā),2015,36(6):28-31

Determination of Panaxoside in Enzyme of Ginseng and Fruit and Vegetable by HPLC

CHEN Shu-hua1，JIANG Xu2，*，ZHANG Nian-jie1
（1.Yanbian State Product Inspection，Yanji 133000，Jilin，China；2.Beijing Zeyou Medeicine Technologies Co.，Ltd.，Beijing 100000，China）

Abstract：To determine the content of panaxosides，such as Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd in enzyme of ginseng and fruit and vegetable，to evaluate the quality of the products，the HPLC method was established.Chromatographic conditions：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）chromatographic column，flow phase for acetonitrile and 0.05 mol/L KH2PO4aqueous solution，flow rate was 1 mL/min，gradient elution detection wavelength at 203 nm.The method had good linear correlation coefficient Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd and the correlation coefficient was between 0.999 3 and 0.999 9.The recovery rate was between 92 % and 101.50 %.RSD was less than 5 %，the detection limit was low.The method has a wide linear range，good accuracy and precision，the operation is simple，the results are satisfactory，can meet the daily inspection requirements.

Key words：enzyme of ginseng and fruit and vegetable；panaxosides；HPLC

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.05.027

作者簡介：陳書華（1968—），男（漢），工程師，本科，研究方向：產品質量檢測。

*通信作者：姜旭（1977—），女（漢），工程師，研究生，研究方向：食品質量分析。

收稿日期：2015-11-02