蝦殼甲殼素提取工藝優(yōu)化及其輔助降血糖活性研究

孟凡欣，吳麗艷，徐盼菊，滕利榮，董媛（.吉林大學(xué)珠海學(xué)院，廣東珠海5904；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林長春3203）

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蝦殼甲殼素提取工藝優(yōu)化及其輔助降血糖活性研究

孟凡欣1，吳麗艷1，徐盼菊1，滕利榮1，董媛2，*
（1.吉林大學(xué)珠海學(xué)院，廣東珠海519041；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林長春132013）

摘要：優(yōu)化了蝦殼中甲殼素提取工藝及其對糖尿病小鼠的影響。首先采用期望函數(shù)和響應(yīng)面法優(yōu)化了EDTA提取蝦殼脫鈣脫蛋白質(zhì)工藝，并通過四氧嘧啶建立糖尿病小鼠模型，分別考察甲殼素、二甲雙胍和二者聯(lián)合給藥1個(gè)月后，糖尿病小鼠的體重、血糖等指標(biāo)的變化。最終確定最佳提取工藝為：EDTA脫鈣條件pH 11，EDTA濃度11 %，反應(yīng)時(shí)間2 h，料液比1∶14（g/mL），之后過濾，烘干，雙氧水脫色，烘干，既得甲殼素提取物。驗(yàn)證試驗(yàn)與預(yù)測值相對誤差為2.8 %，較優(yōu)化前提高了20.3 %。降血糖結(jié)果顯示，與模型組，或是甲殼素和二甲雙胍單獨(dú)給藥組相比，二者聯(lián)合給藥能夠緩解小鼠體重下降（P＜0.05），顯著降低糖尿病小鼠的血清總膽固醇、甘油三酯、血糖、糖化血紅蛋白含量（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01），增加胰島素表達(dá)（P＜0.05）。也能緩解對胰腺組織的損傷（P＜0.05）。甲殼素能夠增強(qiáng)二甲雙胍的抗糖尿病功效，在臨床上應(yīng)用有重要的意義。

關(guān)鍵詞：期望函數(shù)；響應(yīng)面；甲殼素；二甲雙胍；糖尿??；四氧嘧啶

甲殼素（chitin），又名甲殼質(zhì)，幾丁質(zhì)，是從甲殼動(dòng)物外殼中提取出來的一種氨基多糖[1]。在自然界中資源豐富，是除蛋白質(zhì)外數(shù)量最多的含氮天然高分子化合物[2]。自1811年首次被發(fā)現(xiàn)以來，甲殼素及其衍生物在食品、醫(yī)藥、環(huán)境等多個(gè)領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用，具有抗癌、抗感染、提高機(jī)體免疫力等多種功效[3-4]。然而市場上銷售的甲殼素作為保健品，往往被消費(fèi)者濫用，不能合理、科學(xué)的使用。此外，傳統(tǒng)的提取方法多采用酸堿法，不僅容易破壞甲殼素的結(jié)構(gòu)，且污染環(huán)境，所以本研究希望通過滿意度函數(shù)和響應(yīng)面法優(yōu)化EDTA代替強(qiáng)酸強(qiáng)堿提取甲殼素的工藝，同時(shí)，為了考察甲殼素降血糖的輔助治療作用，采用四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病小鼠動(dòng)物模型，探討甲殼素輔助二甲雙胍（一種常規(guī)糖尿病治療藥物）在降糖、降血脂等領(lǐng)域的預(yù)防及治療效果，如果能夠通過藥物控制血糖，將大大減少由于注射胰島素等方式給患者帶來的痛苦，具有重要的意義。

1　材料與方法

1.1儀器與材料

蝦：購于長春市光復(fù)路水產(chǎn)市場，將整蝦洗凈后，剝?nèi)ノr仁，將蝦殼和蝦頭等，清洗烘干后備用；ELX800型酶標(biāo)儀：美國BIOTEK有限公司；昆明鐘小鼠（清潔級，18～22 g，雄性）：購自吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號SCXK（吉）2013～0003；四氧嘧啶、二甲雙胍、檸檬酸、EDTA等試劑：美國Sigma公司；葡萄糖（GLU）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、糖化血紅蛋白（GHb）、胰島素（Ins）測定試劑盒：南京建成生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1甲殼素的提取工藝研究

1.2.1.1工藝流程

蝦殼樣品預(yù)處理→EDTA脫鈣脫蛋白→過濾→烘干→雙氧水脫色→水洗→烘干

1.2.1.2樣品預(yù)處理

洗凈烘干后的蝦殼樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過40目篩，備用。

1.2.1.3甲殼素的提取

精確稱取10 g蝦殼粉，浸泡于一定pH的EDTA溶液當(dāng)中，30℃恒溫水浴中攪拌一定時(shí)間，直至脫去蝦殼粉中的鈣和蛋白質(zhì)，過濾，留取濾渣，50℃烘干至恒重，浸泡于10 %過氧化氫溶液中脫色2 h，直至濾渣變?yōu)榘咨勰?，即為甲殼素。甲殼素得?%=甲殼素質(zhì)量/蝦殼粉質(zhì)量×100。

1.2.1.4蛋白質(zhì)含量測定

凱氏定氮法檢測樣品提取前后蛋白質(zhì)含量[5]。脫蛋白質(zhì)率/ %=（提取前蛋白質(zhì)含量-提取后蛋白質(zhì)含量）/提取前蛋白質(zhì)含量×100。

1.2.1.5鈣含量測定

根據(jù)GB/T 6436-2002《飼料中鈣的測定》測定樣品提取前后的鈣含量。脫鈣率/ %=（提取前鈣含量-提取后鈣含量）/提取前鈣含量×100。

1.2.1.6期望函數(shù)

通過期望函數(shù)，可以將多個(gè)指標(biāo)轉(zhuǎn)化為一個(gè)無量綱的指標(biāo)，即期望值（Dv）。本試驗(yàn)將期望函數(shù)定義如下：

其中：Yi代表的是第i個(gè)考察指標(biāo)的試驗(yàn)所得響應(yīng)值；yi是人為設(shè)定的第i個(gè)考察指標(biāo)的最低響應(yīng)值；Li是第i個(gè)考察指標(biāo)設(shè)定的最高響應(yīng)值；di是第i個(gè)考察指標(biāo)的期望值。當(dāng)每一個(gè)考察指標(biāo)均被轉(zhuǎn)化為di后，將其組合成一個(gè)Dv值，代表總體的期望值，Dv被定義為：

wi是每一個(gè)考察指標(biāo)的權(quán)重值，反映的是不同響應(yīng)值在重要性上的差別；n是考察變量的總數(shù)[6]。本試驗(yàn)的期望函數(shù)參數(shù)如表1所示。

表1　期望函數(shù)各參數(shù)表Table 1 The parameters of the desirability function in currentstudy

1.2.1.7響應(yīng)面法優(yōu)化甲殼素提取工藝

采用四因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)表（表2），以期望值（Dv）為指標(biāo)，優(yōu)化蝦殼中甲殼素提取工藝，并通過Design-expert8.0.6進(jìn)行ANOVA統(tǒng)計(jì)學(xué)分析[7]。

表2　響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 2 Independent variables and their levels in the Box-Behnken design

1.2.1.8驗(yàn)證試驗(yàn)

對響應(yīng)面預(yù)測最優(yōu)結(jié)果進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，驗(yàn)證其提取效果。

1.2.2甲殼素輔助治療糖尿病的實(shí)驗(yàn)觀察

1.2.2.1糖尿病小鼠模型的建立、分組及給藥

參照文獻(xiàn)[8-9]的方法，選取健康小鼠，禁食不禁水16 h，腹腔注射四氧嘧啶溶液（150 mg/kg，溶于生理鹽水，現(xiàn)用現(xiàn)配）。于注射后3 h灌胃給予25 %葡萄糖1 mL/100g。24h后重復(fù)此過程1次。建模72 h后，眼靜脈叢采血，測定空腹血糖濃度，其中血糖濃度高于16.7mmol/L的小鼠被視為造模成功小鼠。將造模成功小鼠隨機(jī)分成4組，每組10只，Ⅰ組灌胃給藥二甲雙胍（60 mg/（kg·d），Met），飼喂基礎(chǔ)飼料；Ⅱ組灌胃給藥60 mg/（kg·d）二甲雙胍，飼喂甲殼素飼料（10 %甲殼素，90 %基礎(chǔ)飼料）；Ⅲ組灌胃同等體積的生理鹽水，飼喂甲殼素飼料；Ⅳ組灌胃同等體積的生理鹽水，飼喂基礎(chǔ)飼料，作為模型組（DM）。并隨機(jī)選取10只健康小鼠作為空白對照組（CT）。

1.2.2.2口服糖耐量實(shí)驗(yàn)

末次給藥后，按照參照文獻(xiàn)[8]考察各組糖尿病小鼠口服糖耐量實(shí)驗(yàn)，觀測小鼠口服葡萄糖之后0.5 h，1 h和2 h血糖值。并按照（3）計(jì)算血糖曲線下面積（AUC）。

AUC/（mmol/L·h）=（0 h血糖值+ 0.5 h血糖值）× 0.25+（0.5h血糖值+1h血糖值）×0.25+（1h血糖值+2h血糖值）×0.5（3）

1.2.2.3生化指標(biāo)測定

給藥30 d期間，每10天記錄1次各組小鼠體重。末次給藥后，禁食不禁水12 h，眼靜脈叢采血，采用試劑盒測定血清中TC、TG、GLU、GHb、Ins含量。

1.2.2.4臟器指數(shù)測定

處死前稱量體重，脫臼處死后立即取出心、肝、脾、肺、腎、胰腺6種臟器，除去污血，濾紙擦干后置于電子天平上稱量臟器的重量，臟器指數(shù)以臟器重量（g）與體重（g）之比表示。

1.2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)用均值±SD表示，采用origin 8.0軟件進(jìn)行變異數(shù)分析，以t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。P＜0.05被認(rèn)為是具有顯著差異。

2　結(jié)果與分析

2.1提取工藝

2.1.1響應(yīng)面結(jié)果

四因素三水平BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)表格如表3所示，ANOVA方差分析如表4所示。

對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行ANOVA分析后，得到一個(gè)多元二次回歸方程來擬合實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

Y=+0.75+0.029A+0.03B-0.005C+0.17D-0.028AB-0.028AC-0.072AD-0.007BC+0.02BD-0.025CD-0.09A2-0.1B2-0.1C2-0.12D2（3）

該模型的F檢驗(yàn)為26.4，P值小于0.05，R2= 0.973 7，說明模型具有很好的擬合度，二次回歸模型顯著。而A、B、D、AD、A2、B2、C2、D2項(xiàng)P值均小于0.05，說明對響應(yīng)值影響顯著，尤其pH和料液比交互作用顯著。三維圖顯示，pH和料液比等高線為橢圓型，且直徑線與坐標(biāo)軸存在一定角度，與統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果一致（圖1），能更直觀地顯示各個(gè)因素之間的交互作用。優(yōu)化后得到蝦殼中甲殼素提取的最佳工藝為：EDTA脫鈣條件pH 11，EDTA濃度11 %，反應(yīng)時(shí)間2 h，料液比1∶14（g/mL），之后過濾，烘干，雙氧水脫色，烘干，既得甲殼素提取物。預(yù)測的最大Dv值對應(yīng)的甲殼素最大干重為2.52g，脫鈣率為85%，脫蛋白率為94%。驗(yàn)證試驗(yàn)提取的平均甲殼素干重為2.57 g，與模型的預(yù)測值相對誤差為2.8%，較未優(yōu)化提取工藝時(shí)提高了20.3%。

表3　四因素三水平BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)表格Table 3 The design matrix generated for the BBD and the obtained response values

表4　響應(yīng)面方差分析Table 4 ANOVA analysis for Response Surface Quadratic Model

圖1　響應(yīng)面優(yōu)化交互作用圖Fig.1 The interaction effect of response surface method

2.2降血糖實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1糖耐量試驗(yàn)

糖耐量實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚍磻?yīng)糖尿病患者對血糖的調(diào)節(jié)能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

從圖2中可以看出，二甲雙胍和甲殼素聯(lián)合給藥后，糖尿病小鼠AUC面積低于二甲雙胍或者甲殼素單獨(dú)給藥組的AUC面積，且與模型組有顯著差異（P＜0.01）。

2.2.2小鼠體重實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各組糖尿病小鼠體重結(jié)果如表5所示。

圖2　糖尿病小鼠口服糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Results of oral glucose tolerance test in diabetic mice注：DM與CT組比較，##P＜0.01；與DM組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

表5　各組糖尿病小鼠體重監(jiān)測結(jié)果（n=10）Table 5 Body weight of diabetic mice（n=10）

由表5可知，甲殼素輔助二甲雙胍給藥30 d后，糖尿病小鼠體重降低有所緩解，與模型組相比，存在顯著差異（P＜0.05），與二甲雙胍或者甲殼素單獨(dú)給藥組小鼠體重相近。

2.2.3生化指標(biāo)檢測結(jié)果

各組糖尿病小鼠各項(xiàng)血液生化指標(biāo)檢測結(jié)果如表6所示。

表6　各組糖尿病小鼠血液生化檢測結(jié)果（n=10）Table 6 Biochemical values of of diabetic mice（n=10）

由表6可知，模型組糖尿病小鼠血清TG、TC、GLU、Ins、GHb均與正常對照組存在顯著差異（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01），表現(xiàn)出糖尿病典型的高血脂、高血糖，糖化血紅蛋白水平及胰島素水平異常等癥狀。甲殼素輔助二甲雙胍給藥后，與模型組相比，能夠顯著降低糖尿病小鼠TG、TC、GLU水平（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01），使其恢復(fù)到接近正常范圍內(nèi)。同時(shí)，糖化血紅蛋白和胰島素水平雖沒有完全恢復(fù)到正常值，但與模型組相比，胰島素水平有所提高（P＜0.05）糖化血紅蛋白水平有所下降（P＜0.05）。且對糖尿病小鼠的降血糖、降血脂效果優(yōu)于二甲雙胍或甲殼素單獨(dú)給藥。

2.2.4臟器指數(shù)結(jié)果

臟器指數(shù)結(jié)果如表7所示。

表7　各組糖尿病小鼠臟器指數(shù)結(jié)果（n=10）Table 7 Organ indices of diabetic mice（n=10）

模型組小鼠心臟、肝臟、肺3種臟器指數(shù)與正常組沒有差異（P＞0.05），可能是由于四氧嘧啶建模時(shí)間短，小鼠還沒有出現(xiàn)心、肝和肺組織的明顯腫大，而脾指數(shù)、腎指數(shù)和胰腺指數(shù)卻與正常對照組存在顯著差異（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01），說明存在脾、腎和胰腺的損傷或腫大。甲殼素與二甲雙胍聯(lián)合給藥后，對糖尿病小鼠的胰腺有一定的保護(hù)作用，與模型組存在差異（P＜0.05）。

3　結(jié)論

甲殼素，作為天然高分子材料，對人、畜、農(nóng)作物無任何副作用，在日本已經(jīng)用于制成保健品[10]。本文采用期望函數(shù)和響應(yīng)面法優(yōu)化了EDTA處理蝦殼提取甲殼素的工藝，較未優(yōu)化提取工藝時(shí)甲殼素產(chǎn)量提高了20.3 %。隨后研究了甲殼素和降糖藥二甲雙胍聯(lián)合給藥對糖尿病小鼠的影響，結(jié)果顯示甲殼素能增強(qiáng)二甲雙胍的降糖、降脂效果，體現(xiàn)在能夠緩解糖尿病導(dǎo)致的體重減輕（P＜0.05），同時(shí)，降血糖、降血脂效果比單獨(dú)使用二甲雙胍或者甲殼素時(shí)效果更好，血脂和血糖恢復(fù)到正常水平。糖耐量實(shí)驗(yàn)和糖化血紅蛋白的檢測能夠體現(xiàn)患者對血糖的調(diào)節(jié)能力和近期的血糖水平，對二者的研究發(fā)現(xiàn)，甲殼素聯(lián)合二甲雙胍給藥后，能夠在口服葡萄糖2h內(nèi)恢復(fù)正常血糖值，且糖化血紅蛋白水平也接近正常值，效果優(yōu)于單獨(dú)給藥，與模型組存在顯著差異（P＜0.01，P＜0.01）。改善胰島素表達(dá)水平和對胰腺、腎等臟器的損傷。通過實(shí)驗(yàn)觀察，甲殼素可以和降糖藥聯(lián)合給藥，增強(qiáng)降糖藥的降糖、降脂效果。

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Optimization of the Extraction Process of Chitin from Shrimp Shell and Its Anti-diabetic Activity

MENG Fan-xin1，WU Li-yan1，XU Pan-ju1，TENG Li-rong1，DONG Yuan2，*
（1.Zhuhai College，Jilin University，Zhuhai 519041，Guangdong，China；2.Jilin Medical University，Changchun 132013，Jilin，China）

Abstract：In order to extract chitin from shrimp shell and investigate it's hypoglycemic effect，response surface method and desirability function were applied to optimism the extraction process of chitin from shrimp shell.Then the hypoglycemic effect of chitin was studied.The diabetic mice model was established by using alloxan.After one month's treatment，the hepoglycemic effects of chitin，metformin and chitin combined with metformin on the body weight，blood glucose and so on were studied.The optimum extraction condition of chitin was as follow：pH 11，EDTA concentration 11 %，reaction time 2 h，solid-liquid ratio 1∶14（g/mL），after filtration，drying，hydrogen peroxide bleaching and drying，vested chitin extract.Compared verification tests with the model predictive value，the relative error was 2.8 % which was improved by 20.3 %.The hypoglycemic results showed that，compared with the model group，or the chitin and metformin alone，the combination of the two drugs could relieve the weight loss of mice induced by diabetes mellitus（P＜0.05），and the serum total cholesterol，triglyceride，blood glucose levels were significantly reduced（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01）.The insulin expression increased（P＜0.05）.The mouse organ index showed that the combined administration of chitin and metformin could also relieve the damage to the pancreas tissue（P＜0.05）.Chitin can enhance the efficacy of metformin in lowering blood glucose and blood lipid，and it has important significance in clinical application.

Key words：desirability function；response surface method；chitin；metformin；diabetes；alloxan

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.05.023

基金項(xiàng)目：《吉林大學(xué)珠海學(xué)院“三個(gè)層次”師資骨干隊(duì)伍建設(shè)》項(xiàng)目（E201421）

作者簡介：孟凡欣（1981—），男（漢），講師，博士，研究方向：生物制藥。

*通信作者：董媛（1986—），女，講師，博士，研究方向：生物制藥。

收稿日期：2015-11-18