神經(jīng)生長因子對大鼠脛骨骨折愈合的影響及其機制

劉建軍，黃亮，韓慶斌，李新志，闕祥勇

(三峽大學(xué)仁和醫(yī)院，湖北宜昌443001)

·基礎(chǔ)研究·

神經(jīng)生長因子對大鼠脛骨骨折愈合的影響及其機制

劉建軍，黃亮，韓慶斌，李新志，闕祥勇

(三峽大學(xué)仁和醫(yī)院，湖北宜昌443001)

目的 觀察神經(jīng)生長因子(NGF)對大鼠脛骨骨折愈合的影響，并探討其相關(guān)機制。方法 將60只脛骨骨折模型大鼠隨機分為觀察組和對照組，每組30只。觀察組于造模后第2天開始肌注NGF 200 ng/kg，1次/d，連用2周。對照組以相同的方法肌注等量生理鹽水。兩組治療后1周(T0)、2周(T1)、4周(T2)行脛骨X線檢查，采用Perkins法計算骨痂體積；稱量全長脛骨濕重，采用RT-PCR法檢測骨痂組織胰島素樣生長因子-1(IGF-1)mRNA相對表達量。結(jié)果 隨術(shù)后時間延長，兩組骨痂體積及全長脛骨濕重均逐漸增加。兩組T0、T1時間點骨痂體積及全長脛骨濕重比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P均>0.05)；觀察組T2時間點骨痂體積及全長脛骨濕重明顯高于對照組，T0、T1時間點骨痂組織IGF-1 mRNA相對表達量均明顯高于對照組(P<0.05或<0.01)；兩組T2時間點骨痂組織IGF-1 mRNA相對表達量比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P均>0.05)。結(jié)論 NGF可促進大鼠脛骨骨折的愈合，可能與其促進骨折愈合過程中骨痂組織IGF-1表達有關(guān)。

脛骨骨折；骨折愈合；神經(jīng)生長因子；胰島素樣生長因子-1；大鼠

神經(jīng)生長因子(NGF)是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，與一些細胞因子之間存在協(xié)同效應(yīng)，對骨折愈合具有一定的促進作用，但是其作用機制尚不完全清楚[1，2]。胰島素樣生長因子-1(IGF-1)是由骨組織分泌的一種生長因子，對成骨細胞增殖和分化具有促進作用，既可作用于局部，又可作用于全身[3]。臨床上關(guān)于NGF促進骨折愈合的機制是否與IGF-1有關(guān)尚不明確。2014年7～9月，我們對脛骨骨折大鼠給予NGF治療，觀察其對骨折愈合的影響，并探討相關(guān)機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠60只，10周齡，體質(zhì)量(260±20)g，由三峽大學(xué)實驗動物中心提供。試劑及儀器：注射用NGF購于廈門北大之路生物工程有限公司，RT-PCR試劑盒購于大連寶生物工程有限公司，總RNA分離試劑、DNA Marker購于天根生化科技(北京)有限公司，瓊脂糖購于美國BIO-RAD公司；電子天平購于上海市第二天平儀器廠，PCR儀購于德國Biometra公司，凝膠成像分析系統(tǒng)購于美國Kodak公司。

1.2 脛骨骨折模型制備及分組處理 60只大鼠均建立脛骨骨折模型：5%水合氯醛腹腔注射麻醉。右后肢脫毛、消毒，于小腿中上1/3處行前正中切口，長約1.5 cm。切開皮膚、皮下組織及筋膜，扒開脛前肌，于脛骨結(jié)節(jié)下1.0 cm處橫形切斷脛骨。以1.0 mm克氏針經(jīng)遠端髓腔穿出，復(fù)位后逆行打入骨折近端。生理鹽水沖洗，逐層關(guān)閉切口。術(shù)后肌注青霉素10萬U，連用3天。將脛骨骨折模型大鼠隨機分為觀察組及對照組，每組30只。觀察組于造模后第2天肌注NGF 200 ng/kg，注射部位為兩側(cè)腓腸肌，1次/d，連用2周。對照組以相同的方法肌注等量生理鹽水。

1.3 相關(guān)指標觀察

1.3.1 骨痂體積 治療后1周(T0)、2周(T1)、4周(T2)，兩組于麻醉狀態(tài)下行脛骨X線檢查，采用DR閱片的PACS系統(tǒng)測量骨半徑、骨痂半徑、骨痂長度(分別記為r1、r2、L，單位mm)，攝片和指標測量均由兩位醫(yī)生按照雙盲原則進行操作。采用Perkins法計算骨痂體積，即V= 2πr1( r2-r1)L。

1.3.2 全長脛骨濕重 兩組分別于T0、T1、T2時間點隨機選取10只大鼠，麻醉狀態(tài)下處死。取其全長脛骨，標本采集時注意保護骨折附近區(qū)域組織，以免破壞骨痂組織。去除內(nèi)固定物，用天平稱量全長脛骨濕重。

1.3.3 骨痂組織IGF-1 mRNA表達 采用RT-PCR法。各組稱量脛骨全長濕重后，于骨折處上、下各2 mm取骨痂組織，液氮凍存。將骨痂組織研磨勻漿后，以TRIzol試劑一步法提取細胞總RNA，隨后進行反轉(zhuǎn)錄。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，IGF-1上游引物：5′-CTTTGCGGGGCTGAGCT-3′，下游引物：5′-CTTCAGCGGAGCACAGT-3′，片段長度：184 bp；以GAPDH為內(nèi)參，上游引物：5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCATATTC′，下游引物：5′-GACATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3′，片段長度：196 bp。PCR擴增條件：94 ℃、5 min，94 ℃、45 s，54 ℃、45 s，72 ℃、45 s，72 ℃、6 min，共29個循環(huán)。采用凝膠成像分析系統(tǒng)檢測條帶的單位面積光密度值(OD值)，以真彩色醫(yī)學(xué)圖像分析軟件(Image-proplus6.0)對結(jié)果進行半定量分析，以目的基因與內(nèi)參基因OD值的比值計算mRNA相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 兩組各時間點骨痂體積比較 隨術(shù)后時間延長，兩組骨痂體積均逐漸增大。兩組T0、T1時間點骨痂體積比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P均>0.05)，觀察組T2時間點骨痂體積明顯大于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組各時間點骨痂體積比較±s)

注：與對照組同時間點比較，*P<0.05。

2.2 兩組各時間點全長脛骨濕重比較 隨術(shù)后時間延長，兩組全長脛骨濕重均逐漸增加。兩組T0、T1時間點全長脛骨濕重比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P均>0.05)，觀察組T2時間點全長脛骨濕重明顯高于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組各時間點全長脛骨濕重比較±s)

注：與對照組同時間點比較，*P<0.05。

2.3 兩組各時點骨痂組織IGF-1 mRNA相對表達量比較 觀察組T0、T1時間點骨痂組織IGF-1 mRNA相對表達量均明顯高于對照組(P<0.05或<0.01)，兩組T2時間點骨痂組織IGF-1 mRNA相對表達量比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表3。

表3 兩組各時點骨痂組織IGF-1 mRNA 相對表達量比較±s)

注：與對照組同時間點比較，*P<0.05，#P<0.01。

3 討論

骨折愈合是一個復(fù)雜的骨再生過程，除了需要適當?shù)纳锪W(xué)環(huán)境外，多種組織、細胞及各種細胞因子之間的相互作用在骨折愈合過程中也發(fā)揮重要作用。隨著高能量損傷和開放性損傷發(fā)生率的升高，骨折不愈合患者數(shù)量逐年增加。盡管眾多新觀念、新技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床中，但目前骨折不愈合的治療仍然面臨著許多難題。

研究顯示，合并中樞神經(jīng)損傷的骨折患者愈合速度明顯加快，骨痂生成也明顯增多[4]。Bidner 等[5]研究認為，在機體的中樞神經(jīng)受到損傷后，某些生長因子能夠透過血腦屏障釋放出來，作用于骨折局部而發(fā)揮作用。因此，以NGF為代表的神經(jīng)營養(yǎng)因子在骨折愈合中的作用受到了廣泛關(guān)注。NGF是最初發(fā)現(xiàn)能夠促進神經(jīng)細胞生長的一種因子，其作為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床。隨著研究的不斷深入，NGF促進骨折愈合的作用也逐漸得到證實[6～9]。Grills等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在骨折斷端局部注射NGF后骨痂生成明顯增多，骨痂剛度和抗折彎強度也顯著增加。研究證實，NGF不僅可誘導(dǎo)神經(jīng)纖維長入骨痂，還能刺激機體釋放P物質(zhì)、降鈣素基因相關(guān)肽等神經(jīng)肽類物質(zhì)，而這些肽類物質(zhì)能抑制骨吸收，促進成骨作用，對骨折的修復(fù)具有促進作用[11]。NGF能促進血管內(nèi)皮細胞分化，加速毛細血管的形成，改善骨折處的血液供應(yīng)；還可刺激骨細胞增殖分化，提高成骨細胞活性，是其促進骨折愈合的一條重要途徑[11]。本研究結(jié)果顯示，隨術(shù)后時間延長，兩組骨痂體積及全長脛骨濕重均逐漸增加，但觀察組T2時間點骨痂體積及全長脛骨濕重明顯高于對照組，說明NGF對大鼠脛骨骨折的愈合具有促進作用。

IGF-1是一種在骨細胞中含量豐富的生長因子，對成骨細胞功能具有重要的調(diào)節(jié)作用[12]，可增加成骨細胞和骨髓基質(zhì)細胞的增殖和分化能力，減少骨膠原退化，增加骨質(zhì)沉積；還能促進骨基質(zhì)合成鈣化，具有加速骨折愈合的作用[13]。本研究觀察組T0、T1時間點骨痂組織IGF-1 mRNA相對表達量均明顯高于對照組，說明NGF可能通過刺激 IGF-1的分泌而增強骨細胞的增殖分化，可能是NGF能夠促進骨折愈合的重要機制之一。

綜上所述，NGF對大鼠脛骨骨折的愈合具有促進作用，提高骨痂組織IGF-1表達有關(guān)可能是其作用機制。

[1] Zhuang YF, Li J. Serum EGF and NGF levels of patients with brain injury and limb fracture[J]. Asian Pac J Trop Med, 2013,6(5):383-386.

[2] 懷文娟,韓曉峰,朱穎華.經(jīng)皮局部注射神經(jīng)生長因子對骨折愈合的影響[J].中國藥業(yè),2015,34(12):41-42.

[3] Langdahl BL, Kassem M, Moller MK, et al. The effects of IGF-I and IGF-II on prolifertion and differention of human osteoblasts and interactionswith growth hormine[J]. Eur J Clin Invest, 1998,28(3):176.

[4] Boes M, Kain M, Kakar S, et al. Osteogenic effects of traumatic brain injury on experimental fracture-healing[J]. J Bone Joint Surg Am, 2006,88(4):738-743.

[5] Bidner SM, Rubins IM, Desjardins JV, et al. Evidence for humoral mechanism for enhanced osteogenesis after head injury[J]. J Bone Joint Surg Am, 1990,72(8):1144-1149.

[6] Zhuang YF, Li J. Serum EGF and NGF levels of patients with brain injury and limb fracture[J]. Asian Pac J Trop Med, 2013,6(5):383-386.

[7] 梁珊,何畔,王愉思.麝香烏龍丸對糖尿病兔骨折愈合的影響及其機制探討[J].山東醫(yī)藥,2014,54(48):13-15.

[8] Furfaro F, Ang ES, Lareu RR, et al. A histological and micro-CT investigation in to the effect of NGF and EGF on the periodontal, alveolar bone, root and pulpal healing of replanted molars in a rat model-a pilot study[J]. Prog Orthod, 2014,15(6):2.

[9] Dobnig H, Sipos A, Jiang Y, et al. Early changes in biochemical markers of bone formation correlate with improvements in bone structure during teriparatide therapy[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2005,90(7):3970-3977.

[10] Grills BL, Schuijers JA, Ward AR. Topical application of nervegrowth factor improves fracture healinginrats[J]. Jorthop Res, 1997,15(2):235-242.

[11] 劉振剛,劉宇鵬,李放,等.神經(jīng)生長因子在骨折愈合中的作用[J].中國醫(yī)藥指南,2013,11(4):491-493.

[12] 鄭少濤,林喜容,周少鵬.腦外傷合并骨折患者血清胰島素生長因子Ⅱ水平的變化[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生,2014,34(12):19-23.

[13] Chen QQ, Wang WM. Expression of FGF-2 and IGF-1 in diabetic rats with fracture[J]. Asian Pac J Trop Med, 2014,7(1):71-85.

三峽大學(xué)青年基金資助項目(KJ2012A020)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.32.008

R687.3

A

1002-266X(2016)32-0027-03

2015-11-24)