hTERT反義寡聚核苷酸對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Bcl-2蛋白含量的影響

楊蓉娟　宋春紅　許艷蕾　劉雪芹　李紅萍

050011　河北省石家莊市第四醫(yī)院

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·論著·

hTERT反義寡聚核苷酸對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Bcl-2蛋白含量的影響

楊蓉娟宋春紅許艷蕾劉雪芹李紅萍

050011河北省石家莊市第四醫(yī)院

【摘要】目的觀察人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶反義寡聚脫氧核苷酸對子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞株Bcl-2蛋白表達(dá)含量的影響。方法將2.5 μmol/L、5 μmol/L及10 μmol/L人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶反義寡聚脫氧核苷酸與Ishikawa細(xì)胞株共同培養(yǎng)，于24、48、72 h采用MTT法檢測細(xì)胞增殖，于48 h使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡和Bcl-2蛋白表達(dá)。結(jié)果人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶反義寡聚脫氧核苷酸呈時間和劑量依賴性抑制Ishikawa細(xì)胞增殖，并可呈劑量依賴性誘導(dǎo)Ishikawa細(xì)胞凋亡、降低Bcl-2蛋白表達(dá)量。結(jié)論人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶反義寡聚脫氧核苷酸可以誘導(dǎo)Ishikawa細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖，該作用與降低Bcl-2蛋白表達(dá)量有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】子宮內(nèi)膜腫瘤；人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶；反義寡聚脫氧核苷酸；Bcl-2

子宮內(nèi)膜癌占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的20%～30%，85%以上子宮內(nèi)膜癌端粒酶陽性[1]。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)是端粒酶的核心組成部分，是其催化亞單位和激活限速因子。設(shè)計(jì)互補(bǔ)于hTERT的反義寡聚脫氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)可抑制端粒酶合成端粒，從而使細(xì)胞退出細(xì)胞增殖周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Bcl-2蛋白是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要基因之一，參與了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展或演變[2]。本實(shí)驗(yàn)觀察hTERT ASODN對子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞株Bcl-2蛋白表達(dá)含量的影響。

1材料與方法

1.1hTERT ASODN的設(shè)計(jì)合成針對hTERT的mRNA序列，由起始密碼子上游6個堿基及后續(xù)的14個堿基作為的靶序列，設(shè)計(jì)出互補(bǔ)的反義片段。另設(shè)計(jì)出一組正義寡核苷酸序列(sense oligodeoxynucleotide,SODN)作為對照，并對每一條寡聚核苷酸鏈進(jìn)行全硫代修飾。冷藏備用。

1.2子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞株培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染高分化子宮內(nèi)膜癌Ishikawa。采用含10%新生牛血清(56℃滅活30 min)、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2、95%飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每周傳代2次，實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞保持在對數(shù)生長期。

1.3細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)采用MTT法。細(xì)胞處理后分為反義組、正義組及空白組。反義組和正義組分別加入不同濃度的ASODN和SODN，終濃度分別為2.5 μmo1/L、5.0 μmol/L、10.0 μmol/L，每孔設(shè)3個復(fù)孔?？瞻捉M加入等量培養(yǎng)液。24 h更換相應(yīng)濃度的寡核苷酸1次。分別于轉(zhuǎn)染后24、48、72 h，在培養(yǎng)皿中按培養(yǎng)液量的10%加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h吸盡培養(yǎng)液，加入與培養(yǎng)液等量的二甲基亞砜，震蕩10 min 使晶充分溶解。立即于自動酶標(biāo)儀492 nm波長測定各孔光密度值。細(xì)胞增殖抑制率=[(空白組光密度值-實(shí)驗(yàn)組光密度值)/空白組光密度值]×100%。MTT購自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司。

1.4凋亡細(xì)胞的觀察與檢測采用碘化丙啶一步插入性DNA定量熒光染色法。處理細(xì)胞，于加入寡聚核苷酸48 h后同時收集反義組、正義組和空白組細(xì)胞。細(xì)胞濃度為1×106/ml，每份樣品中加入DNA染液1 ml，4℃染色30 min，應(yīng)用FACS-420型流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率，每組共檢測3個樣本，重復(fù)3遍。

1.5Bcl-2蛋白定量檢測采用間接免疫熒光標(biāo)記法。處理細(xì)胞，于加入寡聚核苷酸48 h后同時收集反義組、正義組和空白組細(xì)胞。細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106/ml，一抗為大鼠抗人Bcl-2單克隆抗體(1∶100)，二抗為羊抗大鼠IgG(1∶100)，空白組以PBS緩沖液代替一抗。一抗和二抗均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。應(yīng)用FACS-420型流式細(xì)胞儀檢測Bcl-2蛋白。每組共檢測3個樣本，重復(fù)3遍。結(jié)果分析以熒光指數(shù)(fluorescence index,FI)表達(dá)相對含量，用均道值表示FI。計(jì)算公式：FI=(X-Mode)×340。

2結(jié)果

2.1不同濃度寡聚核苷酸對子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞株凋亡的影響ASODN和SODN處理過的Ishikawa細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)反義組細(xì)胞培養(yǎng)液稍混濁，從形態(tài)上看生長無序，漂浮細(xì)胞增多，細(xì)胞密度減小，胞體變長，細(xì)胞之間無明顯界限，細(xì)胞內(nèi)顆粒物質(zhì)增多，存活細(xì)胞減少。隨作用時間和作用濃度的增加上述現(xiàn)象更為明顯。形態(tài)上正義組細(xì)胞生長有序，細(xì)胞液較透明，細(xì)胞內(nèi)顆粒物質(zhì)較少，核隱約可見，細(xì)胞為梭形，復(fù)層生長，密度較大，生長良好；作用48 h后，隨著ASODN濃度增大，細(xì)胞凋亡率上升(P<0.01)。10 μmol/L的ASODN可使細(xì)胞凋亡率增至26%以上。經(jīng)過SODN處理的細(xì)胞與空白組細(xì)胞相比，凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1，圖1。

表1作用48 h后hTERT ASODN對Ishikawa細(xì)胞凋亡率的影響

組別2.5μmol/L5.0μmol/L10.0μmol/L空白組6.98±0.496.98±0.496.98±0.49正義組5.45±0.366.44±1.016.03±0.52反義組12.46±0.60*#18.24±0.34*#26.65±3.23*#

注：與空白組比較，*P<0.01；與正義組比較，#P<0.01

2.2不同濃度寡聚核苷酸對子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞株增殖的影響ASODN作用24 h，Ishikawa細(xì)胞增殖受到抑制，72 h細(xì)胞增殖抑制達(dá)到高峰。隨著ASODN作用濃度增加，細(xì)胞增殖抑制率為顯著(P<0.01)。正義組與空白組相比細(xì)胞增殖抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

圖1正義寡聚脫氧核苷酸(A)和反義寡聚脫氧核苷酸(B)處理48 h后Ishikawa細(xì)胞(顯微鏡×200)

表2hTERT ASODN對Ishikawa細(xì)胞增殖抑制率的影響

組別24h48h72h空白組6.43±1.616.78±1.497.01±1.56SODN(2.5μmol/L)6.81±1.756.66±1.266.98±1.52SODN(5.0μmol/L)6.76±1.676.79±1.407.11±1.39SODN(10.0μmol/L)6.80±1.716.29±1.977.14±1.91ASODN(2.5μmol/L)18.29±1.17*27.10±1.02*44.7±0.96*ASODN(5.0μmol/L)27.68±1.20*#33.6±1.43*#56.01±0.94*#ASODN(10.0μmol/L)37.29±1.71*#△48.53±1.55*#△66.71±1.24*#△

注：與空白組比較，*P<0.01；與ASODN (2.5 μmol/L)比較，#P<0.01；與ASODN (5.0 μmol/L)比較，△P<0.01

2.3不同濃度寡聚核苷酸對子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞株Bcl-2蛋白含量的影響通過流式細(xì)胞儀檢測Bcl-2蛋白表達(dá)可發(fā)現(xiàn)，SODN處理的Ishikawa細(xì)胞在三種濃度下Bcl-2蛋白表達(dá)量與空白組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而經(jīng)過ASODN處理的細(xì)胞，Bcl-2蛋白表達(dá)量與空白組相比顯著下降，并且隨著ASODN濃度的增加，蛋白表達(dá)量下降(P<0.01)。見表3。

表3Bcl-2蛋白在不同濃度ASODN和SODN處理的

Ishikawa細(xì)胞中的表達(dá)

組別2.5μmol/L5.0μmol/L10.0μmol/L空白組302.85±9.30302.85±9.30302.85±9.30正義組299.08±12.20290.61±1.20308.69±3.79反義組221.68±1.67*#200.11±5.08*#177.05±1.67*#

注：與空白組比較，*P<0.01；與正義組比較，#P<0.01

3討論

子宮內(nèi)膜癌為女性生殖系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率有上升趨勢，主要癥狀包括異常陰道流血、月經(jīng)失調(diào)和不育等。子宮內(nèi)膜癌可分為Ⅰ型癌和Ⅱ型癌。Ⅰ型癌以子宮內(nèi)膜樣腺癌為代表，為雌激素依賴性，約占子宮內(nèi)膜癌的80%，主要治療方法包括手術(shù)、放療和化療。約90%Ⅰ型癌處于FIGO-Ⅰ期和Ⅱ期，手術(shù)是主要治療方式。但對于年輕未生育女性來說，子宮切除意味著失去生育能力，另外對于晚期子宮內(nèi)膜癌及復(fù)發(fā)癌不能手術(shù)切除的患者，只能采用放療或化療，但治療效果有限。尋找新的、有效的治療方法勢在必行。

端粒酶由人端粒酶RNA、hTERT、和人端粒酶結(jié)合蛋白組成，是一種核糖核蛋白酶。85%以上子宮內(nèi)膜癌端粒酶陽性，且端粒酶活性增高與子宮內(nèi)膜癌手術(shù)分期、淋巴轉(zhuǎn)移高度相關(guān)[1,3]。hTERT是端粒酶的重要組成部分，它以端粒酶自身攜帶的RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成DNA，其合成的端粒DNA重復(fù)序列添加到端粒末端，從而維持端粒長度和染色體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。hTERT基因轉(zhuǎn)錄水平與端粒酶活性呈正相關(guān)，是端粒酶活性限速步驟和決定因素[4]。有研究發(fā)現(xiàn)85%以上子宮內(nèi)膜癌組織hTERT表達(dá)強(qiáng)陽性，且與子宮內(nèi)膜癌肌層浸潤及臨床分期呈正相關(guān),且在子宮內(nèi)膜癌中hTERT mRNA表達(dá)與端粒酶活性呈正相關(guān)[5]。通過抑制hTERT基因表達(dá)調(diào)控端粒酶活性，對探索子宮內(nèi)膜癌基因治療開辟了新方向。

由于ASODN能與特定基因按堿基配對原理結(jié)合其mRNA、抑制基因的表達(dá)，是具有精確選擇性的靶向治療藥物。ASODN不改變細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)，不需要載體和病毒的介導(dǎo)作用，經(jīng)全硫代修飾后，硫代寡核苷酸具有良好的水溶性、穩(wěn)定性，能基本滿足臨床需求，在動物實(shí)驗(yàn)中取得了一定的成功，，已有多種反義藥物進(jìn)入臨床前及臨床試驗(yàn)[6,7]。有研究發(fā)現(xiàn)，ASODN在子宮內(nèi)膜癌HEC-1-A細(xì)胞株中可降低hTRET mRNA的表達(dá)、抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦表明，ASODN呈時間和劑量依賴性抑制Ishikawa細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，能有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長。

Bcl-2蛋白主要位于線粒體膜、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，可以抑制多種因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。是細(xì)胞凋亡過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。Bcl-2基因家族是目前研究最多的一類細(xì)胞凋亡基因，其表達(dá)和調(diào)控是影響細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素之一。Bcl-2可以抑制凋亡蛋白激酶和核酸內(nèi)切酶對DNA的降解；另外，可以防止受損的DNA激活凋亡誘導(dǎo)基因。研究表明，Bcl-2基因參與了子宮內(nèi)膜增殖性病變的發(fā)展[2,9]；Bcl-2基因多態(tài)性與中國女性子宮內(nèi)膜癌發(fā)生有關(guān)[10]。雷公藤甲素等藥物誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡的作用與降低Bcl-2蛋白表達(dá)有關(guān)[11]。Bcl-2 基因可通過抑制細(xì)胞凋亡而使腫瘤細(xì)胞發(fā)生堆積來顯示出其致癌性[12]。有文獻(xiàn)報(bào)道證實(shí) Bcl-2 在多種腫瘤細(xì)胞組織中的高水平表達(dá)使得細(xì)胞轉(zhuǎn)化及腫瘤形成的前提條件是基因突變或表達(dá)異常[13]，現(xiàn)已證明 Bcl-2 是最重要的抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的基因，有研究表明子宮內(nèi)膜癌的形成與Bcl-2高表達(dá)有關(guān)，且主要作用發(fā)生在癌前病變的早期[14]。有研究發(fā)現(xiàn)Bax/Bcl-2兩因子之間的比例決定了細(xì)胞凋亡的強(qiáng)弱，Bcl-2過度表達(dá)可以抑制程序性細(xì)胞死亡，延遲或阻礙正常細(xì)胞的分化，使細(xì)胞的壽命延長，甚至引起增殖性病變或腫瘤發(fā)生[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ASODN呈劑量依賴性抑制Ishikawa細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)。蛋白表達(dá)受轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控，mRNA加工、成熟水平上的調(diào)控及翻譯水平上的調(diào)控。ASODN對Bcl-2表達(dá)影響的機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。該研究筆者發(fā)現(xiàn)國內(nèi)外鮮有報(bào)道。

綜上所述，ASODN可以抑制Ishikawa細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并抑制抗凋亡基因Bcl-2蛋白的表達(dá)，有效抑制腫瘤細(xì)胞生長。hTERT ASODN是具有精確選擇性的靶向治療藥物，有望成為子宮內(nèi)膜癌預(yù)防和治療的新型藥物。

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Effects of hTERT antisense oligodeoxynucleotide on the expression levels of Bcl-2 protein in endometrial carcinoma cellsYANGRongjuan,SONGChunhong,XUYanlei,etal.TheFourthHospitalofShijiazhuangCity,Hebei,Shijiazhuang050011,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of hTERT antisense oligodeoxynucleotide (ASODN) on the expression levels of Bcl-2 protein in human endometrial carcinoma Ishikawa cells.Methods Human endometrial carcinoma Ishikawa cells were cultured in the medium with 2.5, 5 and10 umol/L hTERT ASODN for 24h,48h,72h,then the cell proliferation of Ishikawa cells was detected by MTT assay.The apoptosis rate of Ishikawa cells and the expression levels of Bcl-2 protein were detected by flow cytometry on 48h. ResultsThe hTERT ASODN inhibited proliferation of Ishikawa cells in a dose-dependent and time-dependent manner,moreover, which could induce apoptosis of Ishikawa cells in a dose-dependent way and could decrease the expression levels of Bcl-2 protein.ConclusionThe hTERT ASODN can induce apoptosis of Ishikawa cells,inhibit tumor cell proliferation,and its action mechanism may be correlated to decreasing the expression levels of Bcl-2 protein.

【Key words】endometrial carcinoma;human telomerase reverse transcriptase;antisense oligodeoxynucleotide; Bcl-2

(收稿日期：2015-11-27)

【中圖分類號】R 711.7

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1002-7386(2016)09-1306-03

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.09.007