凍干重組人腦利鈉肽對(duì)兔心肌梗死后心肌組織病理改變的影響及機(jī)制

孫阿林，張光芳，肖麗，朱樂(lè)樂(lè)，王健

(濰坊市人民醫(yī)院，山東濰坊261041)

凍干重組人腦利鈉肽對(duì)兔心肌梗死后心肌組織病理改變的影響及機(jī)制

孫阿林，張光芳，肖麗，朱樂(lè)樂(lè)，王健

(濰坊市人民醫(yī)院，山東濰坊261041)

目的 觀察凍干重組人腦利鈉肽(rhBNP)對(duì)兔心肌梗死后心肌組織病理改變的影響，并探討其作用機(jī)制。方法 將32只新西蘭白兔隨機(jī)分為假手術(shù)組8只、模型組12只、rhBNP組12只。模型組、rhBNP組采用結(jié)扎冠脈前降支的方法制備心肌梗死模型，假手術(shù)組只開(kāi)胸不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈。記錄梗死前后十二導(dǎo)聯(lián)心電圖變化，明確模型制備成功。rhBNP組術(shù)后即刻及術(shù)后每間隔12 h耳緣靜脈推注rhBNP 7 μg/kg，直至術(shù)后72 h。術(shù)后4周取兔心肌組織行HE染色，觀察心肌細(xì)胞形態(tài)及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況；采用Western blotting法檢測(cè)各組心肌組織IL-1β、TGF-β1表達(dá)。結(jié)果 模型組、rhBNP組梗死心肌細(xì)胞變形、腫脹、破裂、壞死，排列雜亂，周?chē)装Y細(xì)胞浸潤(rùn)，rhBNP組上述改變程度均較模型組減輕。與假手術(shù)組比較，模型組、rhBNP組心肌組織IL-1β、TGF-β1表達(dá)均增加(P<0.05或<0.01)；與模型組比較，rhBNP組心肌組織IL-1β、TGF-β1表達(dá)均降低(P均<0.01)。結(jié)論 rhBNP可減輕兔心肌梗死后的心肌組織病理?yè)p傷，抑制心肌組織炎癥因子IL-1β、TGF-β1表達(dá)可能是其作用機(jī)制。

心肌梗死；凍干重組人腦利鈉肽；白細(xì)胞介素1β；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1；兔

心肌梗死后大量心肌細(xì)胞變形、腫脹、破裂和纖維增生導(dǎo)致心肌重構(gòu)，可加速心肌梗死后心力衰竭(簡(jiǎn)稱(chēng)心衰)的進(jìn)程。研究證實(shí)，炎癥反應(yīng)在心肌重構(gòu)過(guò)程中扮演重要角色[1～3]。凍干重組人腦利鈉肽(rhBNP)為一種治療心衰的新型藥物，具有利尿、排鈉、擴(kuò)血管、拮抗腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RASS)[4]和交感神經(jīng)系統(tǒng)(SNS)等[5]作用，但其是否具有抗炎作用及其機(jī)制尚不明確。2015年3～7月，本研究觀察了rhBNP對(duì)兔心肌梗死后心肌組織病理改變的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 新西蘭白兔32只，體質(zhì)量(2.70±0.18)kg，6～8個(gè)月，雌雄不限，購(gòu)自濰坊醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(魯)20150007。rhBNP(商品名：新活素)購(gòu)自成都諾迪康生物制藥有限公司。BCA 蛋白定量試劑盒及IL-1β、TGF-β1抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 動(dòng)物分組及處理 將32只新西蘭白兔隨機(jī)分為假手術(shù)組8只、模型組12只、rhBNP組12只。采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支的方法制備心肌梗死模型：三組均禁飲食12 h，胸前備皮，速眠新Ⅱ+氯胺酮麻醉，固定于手術(shù)臺(tái)上，心電圖機(jī)記錄兔十二導(dǎo)聯(lián)心電圖，氣管插管，連接動(dòng)物呼吸機(jī)。嚴(yán)格無(wú)菌條件下采用改良Fujita小切口法[6]沿胸骨正中線第2、3肋間偏左0.5～0.8 cm縱行開(kāi)胸，切口長(zhǎng)1.5～2.0 cm；模型組及rhBNP組采用5-0帶線眼科針沿左心耳右下緣結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支，肉眼觀察結(jié)扎區(qū)心肌顏色變蒼白，心電圖示胸前導(dǎo)聯(lián)廣泛ST段抬高0.2 mm以上，提示造模成功。逐層關(guān)胸，術(shù)后3天肌注青霉素預(yù)防感染。假手術(shù)組只開(kāi)胸，對(duì)應(yīng)位置穿線但不結(jié)扎。rhBNP 組術(shù)后即刻及術(shù)后每間隔12 h耳緣靜脈推注rhBNP 7 μg/kg，直至術(shù)后72 h；假手術(shù)組及模型組同時(shí)間點(diǎn)靜脈推注等量生理鹽水。

1.3 觀察方法 三組相同條件下標(biāo)準(zhǔn)喂養(yǎng)4周。靜脈推注10%氯化鉀2～3 mL處死，行心臟灌洗后迅速取出心臟，于結(jié)扎部位下1～5 mm梗死區(qū)取心臟組織行以下指標(biāo)觀察。

1.3.1 心肌組織病理學(xué) 取部分心肌組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，行HE染色，觀察心肌前壁細(xì)胞形態(tài)及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

1.3.2 心肌組織IL-1β、TGF-β1表達(dá) 取心肌組織標(biāo)本，裂解心肌組織，離心取上清液，嚴(yán)格按照BCA 蛋白定量試劑盒說(shuō)明進(jìn)行蛋白定量測(cè)定，采用Western blotting法檢測(cè)心肌組織IL-1β、TGF-β1與內(nèi)參β-actin，顯色、曝光，圖片經(jīng)吸光度圖像掃描儀(HP)掃描，經(jīng)GSD8000密度掃描分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，以IL-1β或TGF-β1灰度與β-actin灰度的比值作為相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 心肌組織病理改變 模型組梗死心肌細(xì)胞變形、腫脹、破裂、壞死，細(xì)胞排列雜亂，周?chē)装Y細(xì)胞浸潤(rùn)；rhBNP組梗死心肌細(xì)胞稍有變形，腫脹明顯減輕，偶見(jiàn)細(xì)胞破裂，心肌纖維排列稍紊亂，有心肌纖維斷裂，周?chē)儆醒装Y細(xì)胞浸潤(rùn)，壞死細(xì)胞較模型組明顯減少；假手術(shù)組心肌細(xì)胞排列規(guī)則，未見(jiàn)明顯病理改變，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)插頁(yè)Ⅲ圖3。

2.2 心肌組織IL-1β、TGF-β1表達(dá) 與假手術(shù)組比較，模型組、rhBNP組心肌組織IL-1β、TGF-β1表達(dá)均升高(P<0.05或<0.01)；與模型組比較，rhBNP組心肌組織IL-1β、TGF-β1表達(dá)均降低(P均<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 三組心肌組織IL-1β、TGF-β1相對(duì)表達(dá)量比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05，#P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，▲P<0.01。

3 討論

研究證實(shí)，心肌梗死后心肌壞死的嚴(yán)重程度與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)可導(dǎo)致心肌瘢痕和纖維化形成，促進(jìn)心室重構(gòu)，加速心肌梗死后的心衰進(jìn)程[7]。因此，心肌梗死后的抗炎治療尤為重要。

rhBNP與心室肌細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)源性腦尿鈉肽(BNP)具有相同的32個(gè)氨基酸序列，因此也具有相同的作用機(jī)制[8]。作用機(jī)制主要包括：①擴(kuò)張動(dòng)靜脈，增加血管通透性，降低體循環(huán)及肺循環(huán)阻力，降低心臟前后負(fù)荷，增加冠脈血流，增加心臟輸出量，緩解呼吸困難和液體潴留癥狀，快速改善血流動(dòng)力學(xué)紊亂而不引起心率的變化[9]；②拮抗RASS系統(tǒng)和交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活，減少腎素、醛固酮的分泌和活性，抑制后葉加壓素和交感神經(jīng)的液體潴留作用，多環(huán)節(jié)抑制神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的過(guò)度激活[10]；③作用于腎臟，擴(kuò)張腎小球入球小動(dòng)脈，抑制近曲小管對(duì)鈉的重吸收，提高腎小球?yàn)V過(guò)率，增強(qiáng)鈉的排泄，具有明顯的利尿作用[11]；④通過(guò)直接抑制心臟組織纖維化基因表達(dá)，抑制心臟纖維母細(xì)胞合成膠原纖維，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解，減輕心肌纖維化，抑制心室重構(gòu)[12,13]。

IL-1β是由單核和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，由caspase-1等蛋白質(zhì)激活分泌至全身，其局部異常增多可造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞和功能障礙，引起細(xì)胞凋亡[14]，在冠心病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。NF-κB通路激活可促進(jìn)IL-1β表達(dá)，IL-1β高表達(dá)又可進(jìn)一步激活NF-κB轉(zhuǎn)錄，形成炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[15]。心肌梗死后NF-κB通路激活是促進(jìn)IL-1β等炎癥因子表達(dá)的主要途徑[16]。TGF-β1是一種多功能非炎癥細(xì)胞因子，具有廣泛的生理和病理作用，幾乎表達(dá)于所有細(xì)胞和組織中，介導(dǎo)Smads依賴(lài)和非Smads依賴(lài)兩條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可通過(guò)TGF-β1/Smads通路參與心肌損傷后的修復(fù)過(guò)程，調(diào)節(jié)心肌梗死后的炎癥反應(yīng)和纖維化過(guò)程[18,19]；TGF-β1可通過(guò)TGF-β1/非Smads依賴(lài)的TAK1/p38MAPK通路而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)炎癥因子如IL-1β等的產(chǎn)生，參與心肌梗死后心肌細(xì)胞增殖、肥大及壞死等病理過(guò)程[20]。本研究模型組心肌組織IL-1β、TGF-β1表達(dá)均高于假手術(shù)組，提示IL-1β、TGF-β1高表達(dá)可能參與心肌梗死的發(fā)生。rhBNP組心肌組織上述病理變化明顯減輕，心肌組織IL-1β、TGF-β1表達(dá)明顯低于模型組，提示rhBNP可減輕心肌梗死后心肌組織的病理?yè)p傷；抑制心肌組織炎癥因子IL-1β、TGF-β1表達(dá)可能是其作用機(jī)制。

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王健(E-mail: 13953670058@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.20.010

R542.2

A

1002-266X(2016)20-0031-03

2015-10-25)