HPLC測(cè)定宮衣凈酊中葛根素含量

朱永剛，崔東安，王　磊，王旭榮，張景艷，林　杰，楊志強(qiáng)，李建喜

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所/甘肅省中獸藥工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州 730050)

?

HPLC測(cè)定宮衣凈酊中葛根素含量

朱永剛，崔東安，王磊，王旭榮，張景艷，林杰，楊志強(qiáng)，李建喜*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所/甘肅省中獸藥工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州 730050)

摘要：為了建立宮衣凈酊中葛根素的高效液相色譜(HPLC)測(cè)定方法,應(yīng)用色譜柱為安捷倫Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-水(25∶75)，流速為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm，柱溫為30℃。結(jié)果表明，在此色譜條件下，葛根素的線性范圍為18.25 μg/mL～584.00 μg/mL(r=0.999 9，n=6)，平均回收率為108.83% (RSD=1.03%)。說明本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可以作為宮衣凈酊的質(zhì)量控制方法。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜；宮衣凈酊；葛根素；含量測(cè)定

宮衣凈酊是由葛根、益母草、紅花等中藥制成的酊劑，其臨床功效主要有活血化瘀、促進(jìn)胎衣排出、凈化子宮、加快產(chǎn)后子宮復(fù)舊、促進(jìn)產(chǎn)后繁殖性能的恢復(fù)。前期試驗(yàn)證實(shí)，宮衣凈酊具有治療奶牛胎衣不下的效果，治愈率達(dá)85.7%[1]。葛根為豆科植物野葛的干燥根，具有解肌退熱、生津止渴、透疹、升陽止瀉等功效，由于中醫(yī)臨床炮制的方法不同，使用方法也有所不同。葛根素是葛根的主要成分之一，由于其性質(zhì)穩(wěn)定，因此選用葛根素作為宮衣凈酊有效成分的含量控制指標(biāo)之一。《中國(guó)獸藥典》(2010年版)中錄入了葛根中葛根素的HPLC含量測(cè)定方法[2]，但該方法樣品制備步驟繁瑣，不適宜于宮衣凈酊中葛根素的含量測(cè)定。本文采用較為簡(jiǎn)便的方法對(duì)宮衣凈酊中的葛根素進(jìn)行處理和含量測(cè)定，以期為衣凈酊的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器Waters e2695 Alliance 高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司產(chǎn)品；Eclipse XDB-C18 色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，美國(guó)安捷倫科技公司產(chǎn)品；超聲波清洗器KQ-250型，昆山市超聲儀有限公司產(chǎn)品；超純水制備儀，力康公司產(chǎn)品；ME235S微量分析天平，Sartorius公司產(chǎn)品。

1.1.2藥品葛根素對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究所，批號(hào)：110752-201313)；宮衣凈酊樣品，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研制，主要由葛根、紅花、益母草等藥組成，每瓶200 mL；甲醇(Fisher Scientific，色譜純)；純化水自制；乙醇為分析純。

1.2方法

1.2.1色譜條件色譜柱：安捷倫Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫30℃；流動(dòng)相：甲醇-水(25∶75)；流速1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm。在上述色譜條件下，葛根素的典型保留時(shí)間為12.1 min，理論塔板數(shù)以葛根素峰計(jì)算不低于4 000。

1.2.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取葛根素對(duì)照品5.84 mg，用甲醇制成每1 mL含584 μg的溶液作為對(duì)照品溶液。

1.2.3供試品溶液的制備精密量取宮衣凈酊樣品溶液2 mL，加甲醇稀釋至10 mL，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.4陰性對(duì)照溶液的制備取處方中不含葛根藥材的陰性樣品，按照供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

1.2.5方法專屬性試驗(yàn)按照1.2.1所述色譜條件，分別取宮衣凈酊供試品溶液、陰性溶液以及葛根素對(duì)照品溶液進(jìn)行HPLC分析。

1.2.6標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密量取葛根素對(duì)照品溶液，分別制備成18.25、36.5、73.00、146、00、292.00、584.00 μg/mL的濃度梯度對(duì)照品溶液。按照1.2.1所述色譜條件，取上述葛根素標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行HPLC分析，以峰面積y相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度x進(jìn)行線性回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7精密度試驗(yàn)取同一宮衣凈酊供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，按照1.2.1所述色譜條件，測(cè)定其峰面積。

1.2.8穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一宮衣凈酊供試品溶液，室溫放置，于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，按照1.2.1所述色譜條件，測(cè)定葛根素含量。

1.2.9重復(fù)性試驗(yàn)取同一批宮衣凈酊供試品溶液，按照供試品制備方法平行制備6份，按照1.2.1所述色譜條件測(cè)定葛根素含量。

1.2.10加樣回收率試驗(yàn)精密量取同一批次已知含量的宮衣凈酊樣品溶液6份，每份1 mL，置于10 mL容量瓶中，分別加入與樣品所含葛根素量相當(dāng)?shù)膶?duì)照品，加700 mL/L乙醇溶液至刻度，搖勻。按制備供試品溶液的方法制備，并測(cè)定其含量，計(jì)算回收率。

回收率=(實(shí)測(cè)值-供試品中葛根素含量)/對(duì)照品葛根素加入量×100%。

2結(jié)果

2.1葛根素含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

葛根素線性回歸方程：y=0.658 9x+0.398 9 (R2=0.999 9，n=6)，結(jié)果如圖1所示。葛根素在18.25 μg～584.00 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2樣品含量的計(jì)算方法

按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中葛根素含量的公式：x=C/V

x為樣品中葛根素的含量(mg)；C為樣品中色譜峰的面積積分值對(duì)應(yīng)的葛根素的濃度(mg/mL);V為樣品的體積(mL)。

圖1　葛根素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3精密度試驗(yàn)

宮衣凈酊樣品中葛根素含量的RSD為1.025%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.4穩(wěn)定性試驗(yàn)

宮衣凈酊中葛根素含量的RSD為0.9411%(n=6)，表明宮衣凈酊供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5重復(fù)性試驗(yàn)

宮衣凈酊中葛根素含量的RSD為1.32%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

2.6加樣回收率試驗(yàn)

宮衣凈酊中葛根素的平均回收率為103.21%，RSD為1.76%(表1)，表明本試驗(yàn)具有良好的回收率。

2.7方法專屬性試驗(yàn)

結(jié)果顯示在該色譜條件下，其他成分不干擾葛根素的測(cè)定，可與其他成分達(dá)到基線分離(圖2)。

表1　葛根素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

3討論

3.1提取方法的選擇

由于宮衣凈酊中乙醇含量為360 mL/L～400 mL，且含有羥基紅花黃色素A等熱不穩(wěn)定性成分，因此《中國(guó)獸藥典》中300 mL乙醇加熱回流提取葛根素的供試品溶液制備方法并不適用于宮衣凈酊樣品中葛根素的提取。有文獻(xiàn)報(bào)道用超聲60 min提取葛根素效果最好[3]，本試驗(yàn)對(duì)供試品溶液提取方法進(jìn)行比較，結(jié)果表明，直接加甲醇提取與超聲振蕩提取測(cè)定結(jié)果基本一致，因直接提取方法較為簡(jiǎn)便，故最終采用甲醇為供試品提取溶劑。

3.2流動(dòng)相的選擇

采用HPLC法測(cè)定中藥復(fù)方制劑中的葛根素，流動(dòng)相系統(tǒng)的選擇有不同組成[4-7]，為了得到較好的色譜圖和適宜的保留時(shí)間，本試驗(yàn)曾比較不同流動(dòng)相分離的效果，如甲醇∶乙腈∶水(10∶10∶80)1 mg/mL枸櫞酸-甲醇(75∶25)(22∶78)(24∶76)，均未能與雜質(zhì)峰達(dá)到基線分離，而當(dāng)選擇甲醇-水(25∶75)作為流動(dòng)相系統(tǒng)時(shí)，葛根素在11 min～13 min之間出峰，并與雜質(zhì)峰能達(dá)到基線分離，分離效果好，保留時(shí)間適中，故選其作為流動(dòng)相。

A.宮衣凈酊陰性樣品;B.葛根素標(biāo)準(zhǔn)品;C.宮衣凈酊供試品

A.The negative sample of Gong-Yi-Jing tincture;B.The standard sample of puerarin;C.The sample of Gong-Yi-Jing tincture

圖2宮衣凈酊中葛根素的HPLC色譜圖

Fig.2HPLC chromatogram of puerarin in Gong-Yi-Jing tincture

參考文獻(xiàn):

[1]謝家聲，楊銳樂，李世宏，等．宮衣凈酊劑及宮衣凈 Ⅱ 號(hào)合劑防治奶牛胎衣不下效果觀察[J]．中獸醫(yī)學(xué)雜志，2008(S)：47-49．

[2]中國(guó)獸藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)獸藥典[M]．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2010：453．

[3]肖學(xué)鳳，高嵐．HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地葛根中葛根素的含量[J]．中草藥，2001，32(3)：220-220．

[4]李汶，黃諾嘉．高效液相色譜法測(cè)定芩連葛根片中葛根素的含量[J]．中國(guó)藥事，1997， 11(3)：186-187．

[5]趙曉莉，崔小兵，狄留慶．HPLC法測(cè)定葛根素葡萄糖注射液中葛根素及3′-甲氧基葛根素含量[J]．中國(guó)中藥雜志，2000，25(7)：413-415．

[6]陳立明，鞠瑞芬，熊付良，等．HPLC法測(cè)定黃芪降糖膠囊中葛根素的含量[J]．中成藥，1999，21(10)：505-506．

[7]劉舒平，溫國(guó)慶．HPLC法測(cè)定葛根炮制品中葛根素的含量[J]．中國(guó)中藥雜志，1998，23(12)：723-725．

文獻(xiàn)綜述

Determination of Puerarin Content in Gong-Yi-Jing Tincture by HPLC

ZHU Yong-gang，CUI Dong-an，WANG Lei，WANG Xu-rong，ZHANG Jing-yan，LIN Jie，YANG Zhi-qiang，LI Jian-xi

(LanzhouInstituteofAnimalHusbandryandPharmaceuticalScienceofCAAS,Engineering&TechnologyResearchCenterofTraditionalChineseVeterinaryMedicineofGansuProvince,Lanzhou,Gansu,730050,China)

Abstract:In order to establish an HPLC method for the determination of puerarin in Gong-Yi-Jing tincture,the Agilent Eclipse XDB-C(18) column(4.6 mm×250 mm,5 μm),the mobile phase of methanol to water (25∶75),flow rate of 1 mL/min were used.The column temperature is 30℃.The results showed that,in this chromatographic conditions,the liner range of puerarin was 18.25-584.00μg/mL(r=0.999 9,n=6).The average recovery rate was 108.83%(r=1.76%, n=6).The system precision is 1.025%.The results illustrated that the HPLC method is simple,accurate,repeatable and can be used for quality control of Gong-Yi-Jing tincture.

Key words:HPLC;Gong-Yi-Jing tincture;puerarin;content determination

文章編號(hào):1007-5038(2016)04-0074-03

中圖分類號(hào):S853.74

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

作者簡(jiǎn)介：朱永剛(1991-)，男，安徽安慶人，碩士研究生，主要從事奶牛中獸藥研發(fā)工作。*通訊作者

基金項(xiàng)目：公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)項(xiàng)目(201303040)

收稿日期：2015-10-02