不同年齡馬睪丸組織中miRNA-34家族含量的變化

何良軍, 王時(shí)偉, 鄧海峰, 董　紅，4, 田　方, 陳靜波

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科學(xué)院，新疆石河子 832000; 2.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300;3.新疆伊犁州昭蘇馬場(chǎng)，新疆昭蘇 835602;4.新疆畜牧科學(xué)院，新疆烏魯木齊 830000)

?

不同年齡馬睪丸組織中miRNA-34家族含量的變化

何良軍1, 王時(shí)偉2, 鄧海峰3, 董紅1，4, 田方1, 陳靜波4*

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科學(xué)院，新疆石河子 832000; 2.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300;3.新疆伊犁州昭蘇馬場(chǎng)，新疆昭蘇 835602;4.新疆畜牧科學(xué)院，新疆烏魯木齊 830000)

摘要：為研究microRNA(miRNA)-34家族在馬不同發(fā)育階段睪丸組織內(nèi)的表達(dá)規(guī)律，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，以GAPDH 作為內(nèi)參基因，分別對(duì)miRNA-34家族(miRNA-34a、miRNA-34b 和miRNA-34c) 在3個(gè)發(fā)育階段哈薩克馬睪丸組織表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明miRNA-34a 在馬睪丸發(fā)育過(guò)程中表達(dá)量較為穩(wěn)定，在不同發(fā)育階段睪丸組織內(nèi)無(wú)顯著差異(P>0.05)。miRNA-34b和miRNA-34c在馬駒和周歲馬睪丸組織中的表達(dá)量較低，在這兩個(gè)年齡段表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)。而在成年馬階段出現(xiàn)明顯上升，成年馬miRNA-34b和miRNA-34c表達(dá)量與馬駒和周歲馬表達(dá)量有極顯著的差異(P<0.01)。位于同一基因簇上的miRNA-34b 和miRNA-34c具有極為類似的表達(dá)模式和結(jié)構(gòu)，分析認(rèn)為馬的miRNA-34b和miRNA-34c 也具有冗余功能。

關(guān)鍵詞：哈薩克馬；miRNA-34家族；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

MicroRNA(miRNA)是一種長(zhǎng)度為19 nt～25 nt的RNA。它們通過(guò)與靶基因3′UTR堿基互補(bǔ)方式進(jìn)行結(jié)合，能夠抑制mRNA翻譯或者降低mRNA的穩(wěn)定性[1]。成熟miRNA是由長(zhǎng)鏈的初級(jí)miRNA轉(zhuǎn)錄體和miRNA前體切割形成的。miRNA種子序列是成熟miRNA 5′端第2～8個(gè)堿基，這個(gè)片段與靶基因的3′-UTR區(qū)通過(guò)堿基配對(duì)的方式進(jìn)行結(jié)合。根據(jù)成熟miRNA和pre-miRNA的結(jié)構(gòu)和序列，miRNA可以被劃分為不同的miRNA家族[2]。同一家族內(nèi)的成員具有相同的種子序列，這意味著它們有冗余的功能。

已知很多miRNA有特異性表達(dá)模式，這種特異性表達(dá)模式表現(xiàn)在這些miRNA在特定組織內(nèi)或特定發(fā)育階段內(nèi)表達(dá)。從斑馬魚到人的進(jìn)化過(guò)程中，miRNA-122序列是保守的，并且在這2種物種中，miRNA-122均表現(xiàn)為肝臟特異性表達(dá)[3]。已證實(shí)miRNA-122是調(diào)控肝炎病毒C感染、類固醇代謝和肝癌發(fā)揮重要作用[4]。 再如，miRNA-1在心臟和肌肉組織中呈特異性表達(dá)的，敲除小鼠miRNA-1-2基因會(huì)導(dǎo)致50%的小鼠由于心臟缺陷在出生前后死亡，剩余的小鼠也表現(xiàn)出心臟缺陷[5]。上述研究表明，miRNA的分布可能決定了組織和細(xì)胞的功能特異性，在細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

2001年10月26日，《Science》雜志發(fā)表了美國(guó)麻省理工學(xué)院Whitehead生物研究所Nelson等利用Northern 雜交技術(shù)在秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis.elegans)中發(fā)現(xiàn)一組類似于lin-4和let-7(最先發(fā)現(xiàn)的2個(gè)miRNA)具有21 nt～24 nt的非編碼RNA，這組RNA可能具有調(diào)控作用，其中包括miRNA-34[6]。

自發(fā)現(xiàn)miRNA-34后，對(duì)其研究也隨即展開(kāi)。目前已知在無(wú)脊椎動(dòng)物中miRNA-34只有1個(gè)成員，而在哺乳動(dòng)物miRNA-34有3個(gè)分別是miRNA-34a、miRNA-34b 和 miRNA-34c，因此，人們也稱之為miRNA-34家族。p53是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)DNA損傷或細(xì)胞受脅迫時(shí)都可以激活p53[7]。為研究p53腫瘤抑制通路中miRNA的作用，通過(guò)放射處理小鼠野生型胚胎成纖維細(xì)胞與小鼠p53-/-胚胎成纖維細(xì)胞，結(jié)果只能增加野生型細(xì)胞中p53的表達(dá)，同時(shí)miRNA-34家族的3個(gè)成員的表達(dá)量與p53表達(dá)量呈正相關(guān)，并證實(shí)miRNA-34基因家族啟動(dòng)子有p53的結(jié)合位點(diǎn)。利用強(qiáng)力霉素(doxycycline)處理可重新激活內(nèi)源性p53的表達(dá)，從而增加miRNA-34家族的表達(dá)。這些證據(jù)表明miRNA-34家族是p53通路下游的重要成員[8]。此后miRNA-34家族就成為人們研究的熱點(diǎn)。

研究表明，miRNA-34家族參與多種生物功能，很多重要生物過(guò)程中發(fā)揮重要作用，例如細(xì)胞增生[9]、細(xì)胞凋亡[10]和細(xì)胞分化[11]。 因此，研究miRNA-34家族在不同組織中的表達(dá)量有重要意義。在人和小鼠的相關(guān)報(bào)道中，miRNA-34具有調(diào)節(jié)原始生殖發(fā)育和精子生成的作用[12]。在家畜中已研究了豬睪丸發(fā)育過(guò)程中miRNA-34家族成員的序列和功能及表達(dá)規(guī)律[13-14]。

截止2015年8月，在mirBase( http://www.mirbase.org ) 數(shù)據(jù)庫(kù)中已收錄馬的690個(gè)成熟的miRNA，715個(gè)前體miRNA，已有miRNA-34a、miRNA-34b和miRNA-34c的序列描述，miRNA-34a位于第2號(hào)染色體上，屬于起源于內(nèi)含子的miRNA， miRNA-34b和 miRNA-34c 位于第7號(hào)染色體上，形成一個(gè)miRNA 基因簇，但還沒(méi)有它們功能的報(bào)道。馬作為經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高的家畜，其繁殖能力是發(fā)展馬產(chǎn)業(yè)的關(guān)鍵因素。本試驗(yàn)參照馬的GAPDH為內(nèi)參基因，為分析miRNA在不同發(fā)育階段哈薩克馬睪丸組織的表達(dá)規(guī)律和特異性，運(yùn)用熒光定量PCR的方法對(duì)馬睪丸組織中miRNA-34家族的表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)和分析，研究這3個(gè)miRNA在馬睪丸不同發(fā)育階段的表達(dá)規(guī)律。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)用動(dòng)物及樣品的采集試驗(yàn)用馬匹均來(lái)自新疆伊犁地區(qū)的哈薩克馬，分別采集馬駒(5月齡)、周歲馬(1.5歲)和成年公馬(4歲～8歲)各3匹，每匹采集睪丸組織 ，共計(jì)9個(gè)組織樣品。在采集組織前，先通過(guò)牙齒，判斷馬的年齡。馬屠宰后，采集所有樣品迅速在液氮中冷凍，然后在-80℃保存。

1.1.2主要試劑DEPC，Sigma公司產(chǎn)品；氯仿，國(guó)藥分析純；瓊脂糖，Biowest公司產(chǎn)品；胰蛋白胨，Oxoid公司產(chǎn)品；瓊脂粉,Chembase公司產(chǎn)品；酵母提取物，Oxoid公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000,TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.1.3主要儀器 電泳儀(DYY-5型),北京市六一儀器廠;紫外分光光度計(jì)(UV2101 PC型)、凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad公司產(chǎn)品;常規(guī)PCR儀，Thermo Forma公司產(chǎn)品;Mx3005P型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，低溫高速離心機(jī)等。

1.2方法

1.2.1總RNA的提取 利用Trizol 試劑(Invitrogen,USA)提取樣品中的總RNA，用Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer測(cè)定RNA的純度。試驗(yàn)運(yùn)用以往試驗(yàn)中介紹的方法[15]，測(cè)定馬睪丸組織中miRNA-34a ，miRNA-34b 和miRNA-34c 的表達(dá)量。參照Chen C F等[16]介紹的方法設(shè)計(jì)qRT-PCR的引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。試驗(yàn)應(yīng)用M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RevertAidTM和特異性引物(表1)，將1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件是37℃15 min ，85℃ 5 min，然后是4℃ 5 min。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析為了進(jìn)一步分析miRNA在不同發(fā)育階段哈薩克馬不同組織的表達(dá)規(guī)律，利用熒光定量PCR方法，以GAPDH作為內(nèi)參，分別對(duì)miRNA-34a、miRNA-34b 和miRNA-34c 在哈薩克馬3個(gè)不同發(fā)育階段(馬駒、周歲馬、成年馬)睪丸組織的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè),每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。

運(yùn)用Applied Biosystems 9700 Thermocycler 進(jìn)行SYBR Green PCR。試驗(yàn)條件為20 μL的反應(yīng)體積，包含1 μL cDNA (10倍稀釋)，95℃預(yù)變性3 min；95℃ 15 s，60℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)。本研究以馬GAPDH作為內(nèi)參基因[17-18]，采用2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量比較。用SPSS12.0進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

表1　實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

2結(jié)果

2.1miRNA-34家族在不同發(fā)育階段睪丸組織中的變化趨勢(shì)結(jié)果見(jiàn)圖1。

如圖1所示， miRNA-34a 在馬睪丸內(nèi)相對(duì)表達(dá)量較為穩(wěn)定，在成年馬階段略微有些下降?？傮w上看，在不同發(fā)育階段睪丸組織內(nèi)無(wú)顯著差異(P>0.05)。miRNA-34b和miRNA-34c在馬駒和周歲馬睪丸組織中的表達(dá)量較低，在這兩個(gè)年齡段表達(dá)量相似，均無(wú)顯著差異(P>0.05)。而在成年馬階段出現(xiàn)明顯上升，成年馬miRNA-34b和miRNA-34c表達(dá)量與馬駒和周歲馬表達(dá)量有極顯著的差異(P<0.01)。

圖1　miRNA-34家族在不同發(fā)育階段馬睪丸組織的

2.2miRNA-34家族的冗余功能

馬的miRNA-34家族在5′端有相同的“種子序列”(GGCAGUG)。miRNA-34a有22個(gè)堿基，與miRNA-34b 和miRNA-34c有19個(gè)堿基相同，具有86%(19/22 nt)和82%(18/22 nt)的同源性。miRNA-34b 與miRNA-34c序列長(zhǎng)度相同為23 nt，有21個(gè)堿基是相同，2個(gè)堿基是不同的，同源性是91%(21/23 nt)(圖2)。 表明miRNA-34b和miRNA-34c含有的相同靶基因比miRNA-34a的要多。本試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示miRNA-34b和miRNA-34c在不同發(fā)育階段睪丸組織表達(dá)量的平行關(guān)系可能也是一種預(yù)防差錯(cuò)的機(jī)制。

miRNA-34a和miRNA-34b之間相同序列用斜體標(biāo)識(shí)；miRNA-34b和miRNA-34c之間相同序列用下劃線標(biāo)識(shí)Sequences highlighted in italics indicate identical nucleotides shared miRNA-34b and miRNA-34c；Sequences highlighted by underlining indicate identical nucleotides shared miRNA-34b and miRNA-34c

圖2馬成熟miRNA-34a、miRNA-34b和 miRNA-34c

(http://www.mirbase.org)序列

Fig.2Mature sequences of miRNA-34a,miRNA-34b and miRNA-34c

3討論

3.1miRNA-34家族在不同發(fā)育階段睪丸組織的表達(dá)

miRNA-34家族參與哺乳動(dòng)物精子發(fā)生的過(guò)程。有研究顯示，miRNA-34a在小鼠不同組織內(nèi)廣泛表達(dá)[19-20]，其中miRNA-34b和miRNA-34c主要在大腦、肺臟和睪丸內(nèi)表達(dá)[20]。在小鼠睪丸發(fā)育的整個(gè)過(guò)程中，miRNA-34a表達(dá)量較為恒定，并且只在精原細(xì)胞內(nèi)表達(dá)[21]。通過(guò)對(duì)小鼠的研究顯示，miRNA-34b和miRNA-34c在成年鼠睪丸組織內(nèi)表達(dá)高[22]。比較未成熟和成熟睪丸組織發(fā)現(xiàn)，在小鼠[22]、豬[13]和獼猴[23]的成熟睪丸內(nèi)，miRNA-34b和miRNA-34c有很高程度的特異性表達(dá)。本研究顯示哈薩克公馬不同發(fā)育階段睪丸內(nèi)miRNA-34家族時(shí)空表達(dá)模式與小鼠、豬、獼猴的相類似。

miRNA-34作為一類保守的、非編碼miRNA，通過(guò)p53通路調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡，其在生殖領(lǐng)域中的作用引起廣泛關(guān)注。Bouhallier F等[24]發(fā)現(xiàn)，miRNA-34c在小鼠出生后12 d睪丸中表達(dá)量很低，此后miRNA-34c表達(dá)量迅速升高到成年水平，并且發(fā)現(xiàn)miRNA-34c在小鼠粗線期精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量很高，說(shuō)明miRNA-34c的表達(dá)體現(xiàn)出減數(shù)分裂期特異性；miRNA-34b與miRNA-34c有相同的表達(dá)模式，但是miRNA-34b表達(dá)量要低于miRNA-34c，證明它們?cè)谛∈蟛G丸內(nèi)的功能主要與精子發(fā)生過(guò)程后期有關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果不僅證實(shí)了以上結(jié)論，而且更清楚地表達(dá)了馬睪丸組織中miRNA-34家族表達(dá)量從馬駒到成年階段的表達(dá)規(guī)律。從本研究結(jié)果可以看出，伴隨著馬的生殖發(fā)育過(guò)程，馬睪丸組織中miRNA-34b和miRNA-34c表達(dá)變化趨勢(shì)是先增后減，待睪丸組織發(fā)育到成熟階段相對(duì)表達(dá)量顯著上升，并高于miRNA-34a，據(jù)此推斷miRNA-34b和miRNA-34c可能與公馬生殖細(xì)胞發(fā)育相關(guān)。

崔勝等利用原位雜交技術(shù)也得出類似結(jié)果，地高辛核酸標(biāo)記探針檢測(cè)，證實(shí)miRNA-34c可作用于環(huán)磷酸腺苷(轉(zhuǎn)錄激活因子Ⅰ，ATF1)來(lái)促進(jìn)小鼠雄性生殖細(xì)胞的凋亡。研究數(shù)據(jù)顯示，在胚胎期第13.5天至出生后12 d，小鼠睪丸內(nèi)均未檢測(cè)到miRNA-34c，而在出生后第14天的粗線期精母細(xì)胞內(nèi)開(kāi)始出現(xiàn)miRNA-34c，并于出生后第16天信號(hào)開(kāi)始加強(qiáng)，直至成年后幾乎每個(gè)曲精細(xì)管內(nèi)都存在miRNA-34c的信號(hào)[25]。小鼠睪丸組織學(xué)觀察顯示，小鼠生后初期睪丸曲細(xì)精管中只有支持細(xì)胞和原始生精細(xì)胞; 至生后8 d出現(xiàn)精原細(xì)胞;15 d出現(xiàn)初級(jí)精母細(xì)胞；23 d時(shí)出現(xiàn)次級(jí)精母細(xì)胞及少量圓形精子細(xì)胞，此后圓形精子細(xì)胞逐漸增多；30 d時(shí)圓形精子細(xì)胞發(fā)生變態(tài)；36 d時(shí)大量精子開(kāi)始穩(wěn)定出現(xiàn)于曲細(xì)精管管腔中，并延續(xù)至此后各期[26]。說(shuō)明小鼠睪丸中miRNA-34c的表達(dá)與精母細(xì)胞的出現(xiàn)是同步的。

新疆哈薩克公馬睪丸組織的觀察顯示，雄性幼駒的曲精細(xì)管尚未發(fā)育完整，為睪丸索，睪丸索之間有大量間質(zhì)細(xì)胞。睪丸索管腔內(nèi)含有生殖母細(xì)胞(精原細(xì)胞)和支持細(xì)胞；周歲馬的曲細(xì)精管已經(jīng)形成，曲細(xì)精管密度明顯增大，管腔直徑變化大，曲細(xì)精管內(nèi)細(xì)胞多由3層～4層組成，但是生殖細(xì)胞發(fā)育還不完全，細(xì)胞間出現(xiàn)空腔，與小鼠出生后11日齡睪丸組織學(xué)特征相似[26]。成年馬睪丸曲細(xì)精管管腔中生殖細(xì)胞種類完整，可見(jiàn)精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、圓形精子細(xì)胞和長(zhǎng)形精子細(xì)胞的存在，后2種細(xì)胞位于管腔中央，精原細(xì)胞位于基底膜上，睪丸已發(fā)育成熟，此階段miRNA-34c的含量是最高的。本研究證明了精母細(xì)胞的數(shù)量與miRNA-34c表達(dá)量呈正相關(guān)，與小鼠的研究結(jié)果相類似。

由于miRNAs 通過(guò)直接抑制靶mRNA的翻譯發(fā)揮著重要的基因調(diào)控作用，接下來(lái)的工作是預(yù)測(cè)和篩選miRNA-34家族可能的靶基因，以進(jìn)一步了解它們及其靶基因在公馬生殖發(fā)育過(guò)程中的作用。

3.2miRNA-34家族的冗余功能

在生物體內(nèi)，一個(gè)miRNA有幾十到幾百個(gè)靶基因，同時(shí)一個(gè)靶基因又受到多個(gè)miRNA的控制，這種現(xiàn)象造成了miRNA功能的冗余。miRNA-34b 和miRNA-34c作為miRNA-34基因家族中的成員，在結(jié)構(gòu)上具有很高的同源性。miRNA-34b 和miRNA-34c 位于同一基因簇上，具有同源性，同時(shí)在整個(gè)RNA片段的非種子序列也具有同源性。這種具有高度同源和成簇排列的方式還出現(xiàn)在其他類型的基因中，例如rRNA基因簇。研究者發(fā)現(xiàn)rRNA基因成簇排列，這種排列方式可能有利于RNA基因高效、協(xié)調(diào)地轉(zhuǎn)錄和胚胎發(fā)育以及早期rRNA基因的大量擴(kuò)增[27]。與單個(gè)基因以及基因家族不成簇的其他成員不同，成簇基因表達(dá)不僅保持高度的時(shí)空協(xié)調(diào)，在表達(dá)量上也表現(xiàn)出高度的協(xié)調(diào)性。同一簇內(nèi)基因在各發(fā)育分化階段保持合適的表達(dá)比例，確保功能上的平衡[27]。在本研究發(fā)現(xiàn)位于同一基因簇上的miRNA-34b 和miRNA-34c具有極為類似的表達(dá)模式和結(jié)構(gòu)，這種現(xiàn)象可能是機(jī)體為了實(shí)現(xiàn)miRNA時(shí)空表達(dá)的高度精確控制。

馬的miRNA-34家族在5′端有相同的“種子序列”(GGCAGUG)。對(duì)HeLa (LGC Promochem) 細(xì)胞用RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分析miRNA-34a和miRNA-34c的通路，證明它們的靶基因不完全相同，但是有部分是重疊的[28]。 哺乳動(dòng)物miRNA通過(guò)5′端和它們靶基因的3′-UTR區(qū)通過(guò)堿基互補(bǔ)結(jié)合調(diào)控靶基因。但有時(shí)候，miRNA 3′端也會(huì)參與堿基配對(duì)，有時(shí)甚至補(bǔ)償5′端的堿基錯(cuò)配[29]。馬成熟miRNA-34b 和 miRNA-34c 有21個(gè)堿基是相同，2個(gè)堿基是不同的。miRNA-34a和miRNA-34b 有19個(gè)堿基相同(圖2)。表明miRNA-34b和miRNA-34c含有的相同靶基因比它們與miRNA-34a的要多。已證明miRNA-449家族與miRNA-34家族含有相同的“種子序列”，這兩個(gè)家族在小鼠睪丸內(nèi)功能是冗余的[21]。在小鼠睪丸內(nèi)敲除miRNA-449會(huì)上調(diào)miRNA-34b和miRNA-34c表達(dá)，同時(shí)并不影響精子發(fā)生。證明這種冗余現(xiàn)象是一種預(yù)防差錯(cuò)的機(jī)制。本試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示miRNA-34b和miRNA-34c在不同發(fā)育階段睪丸組織表達(dá)量的平行關(guān)系可能也是一種預(yù)防差錯(cuò)的機(jī)制。

參考文獻(xiàn):

[1]Kim V N.MicroRNA biogenesis:coordinated cropping and dicing[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2005,6:376-385.

[2]Kozomara A,Griffiths-Jones S.MiRBase:integrating microRNA annotation and deep-sequencing data[J].Nucleic Acids Res,2011,39:D152-D157.

[3]Wienholds E,Kloosterman W P,Miska E,et al.MicroRNA expression in zebrafish embryonic development[J].Science,2005,309:310-311.

[4]Lewis A P,Jopling C L.Regulation and biological function of the liver-specific miR-122 [J].Biochem Soc Trans,2010,38:1553-1557.

[5]Zhao Y,Ransom J F,Li A K,et al.Dysregulation of cardiogenesis, cardiac conduction,and cell cycle in mice lacking miRNA-1-2[J].Cell,2007,129:303-317.

[6]Lau N C,Lim L P,Weistein E G,et al.An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles inCaenorhabditiselegans[J].Science,2001,294(5543):858-862.

[7]Vogelstein B,Lane D,Levine A J.Surfing the p53 network[J].Nature,2000,408:307-310.

[8]He L,He X Y,Lim L P,et al.A miRNA component of the p53 tumour suppressor network[J].Nature,2007,447(7148):1130-1134.

[9]Comey D C,Flesken-Nikitin A,Godwin A K,et al.MicroRNA-34b and microRNA-34c are targets of p53 and cooperate in control of cell proliferation and adhesion-independent growth[J].Cancer Res,2007,67:8433-8438.

[10]Welch C,Chen Y,Stallings R L.MicroRNA-34a functions as a potential tumor suppressor by inducing apoptosis in neuroblastoma cells[J].Oncogene,2007,26:5017-5022.

[11]Aranha M M,Santos D M,Sola S,et al.MiR-34 regulates mouse neural stem cell differentiation[J].PLoS One,2011,6:e21396.

[12]Dominici M,Blanc K L,Mueller I,et al.Minimal criteria for defining multipotent mesenchymals stomal cells.International society cellular therapy position statement[J].Cytotherapy,2006,8(4):315-317.

[13]Lian C J,Sun B X,Niu S L,et al.A comparative profile of the microRNA transcriptome in immature and mature porcine testes using solexa deep sequencing[J].FEBS J,2012,279(6):964-975.

[14]趙偉,李傳民,高峰,等.熒光定量分析豬睪丸組織中miR-34b的表達(dá)規(guī)律[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2013,33(5):785-787,794.

[15]Erika V G,Wu R M,Wood M,et al.Protocol: a highly sensitive RT-PCR method for detection and quantification of microRNAs[J].Plant Meth,2007,3(1):12.

[16]Chen C F,Ridzon D A,Broomer A J,et al.Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR[J].Nucleic Acids Res,2005,33(20):e179.

[17]Ing N H,Laughlin A M,Varner D D,et al.Gene expression in the spermatogenically inactive "Dark" and maturing "Light" testicular tissues of the prepubertal colt[J].J Androl,2004,24:535-544.

[18]Shields J E,Kochan K J,Jeong J,et al.Initial characterization of a gene abundantly expressed in stallion testis[J].J Equine Vet Sci,2009,29(5):324-325.

[19]Dutta K K,Zhong Y,Liu Y T,et al.Association of microRNA-34a overexpression with proliferation is cell type-dependent[J].Cancer Sci,2007,98:1845-1852.

[20]Bommer G T,Gerin I,Ying F,et al.P53-mediated activation of miRNA34 candidate tumor-suppressor genes[J].Cur Biol,2007,17:1298-1307.

[21]Bao J Q,Li D,Wang L,et al.MicroRNA-449 and microRNA-34b/c function redundantly in murine testes by targeting E2F transcription factor-retinoblastoma protein(E2F-pRb) pathway[J].J Biol Chem,2012,287(26):21686-21698.

[22]Yan N H,Lu Y L,Sun H Q,et al.A microarray for microRNA profiling in mouse testis tissues[J].Reproduction,2007,134:73-79.

[23]Yan N H,Lu Y L,Sun H Q,et al.Microarray profiling of microRNAs expressed in testis tissues of developing primates[J].J Assist Reprod Gene,2009,26(4): 179-186.

[24]Bouhallier F,Allioli N,Lavial F,et al.Role of miR-34c microRNA in the late steps of spermatogenesis[J].RNA,2010,16:720-731.

[25]Xuan L X,Zhou D D,Chao W,et al.MicroRNA-34c enhances murine male germ cell apoptosis through targeting ATF1[J].PLoS One,2012,7(3):e33861.

[26]羅蘭,張彥,楊芳,等.小鼠睪丸發(fā)育全過(guò)程的組織學(xué)觀察[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué),2010,27(3):10-13.

[27]徐海明,劉德培.成簇基因的時(shí)空表達(dá)調(diào)控[J].生命科學(xué),1999,11(3):98-100.

[28]Ebner O A,Selbach M.Quantitative proteomic analysis of gene regulation by miR-34a and miR-34c[J].PLoS One,2014,9(3):e92166.

[29]Shin C,Nam J W,Farh K K H,et al.Expanding the microRNA targeting code: functional sites with centered pairing[J].Mole Cell,2010,38(6):789-802.

Content Changs of miRNA-34 Family in Testis Tissues of Different Age Horses

HE Liang-jun1, WANG Shi-wei2, DENG Hai-feng3, DONG Hong1,4,TIAN Fang1,CHEN Jing-bo4

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShiheziUniversity,Shihezi,Xinjiang,832000,China;2.CollegeofAnimalScience,TarimUniversity,Alar,Xinjiang,843300,China;3.ZhaosuHorseFarm,YiliKazakAutonomousPrefecture,Zhaosu,Xinjiang,835602,China;4.XinjiangAcademyofAnimalHusbandry，Urumqi,Xinjiang,830000,China)

Abstract:In order to study miRNA-34 family expression patterns in horse testes,the present study employed real-time PCR and used GAPDH as a reference gene to determine miRNA-34a，miRNA-34b and miRNA-34c expression patterns in Kazakh horse testes of three development stages.The results showed that miRNA-34a has relative stable expression in horse testicular development and shows no significant difference in expression of three testicular developmental stages(P>0.05);miRNA-34b and miRNA-34c have low expressions in foal and yearling testes and show no significant differences in expression(P>0.05);miRNA-34b and miRNA-34c have significantly higher expression in stallions and significantly higher expressions than that in foals and yearlings(P<0.01).miRNA-34b and miRNA-34c,forming one miRNA gene cluster,have very similar temporal expression patterns and RNA structures,suggesting function redundancy of miRNA-34b and miRNA-34c.

Key words:Kazakh horse；miRNA-34 family；real-time PCR

文章編號(hào):1007-5038(2016)04-0040-05

中圖分類號(hào):S852.165

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

作者簡(jiǎn)介：何良軍(1974-)，男，湖北鈞縣人，博士研究生，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究。*通訊作者

基金項(xiàng)目：新疆維吾爾族自治區(qū)重大專項(xiàng)( 201130101-2)；國(guó)家科技支撐項(xiàng)目(2012BAD44B02)

收稿日期：2015-04-07