大腸桿菌嗜鹽α-淀粉酶基因的分子改造及其酶學(xué)特性*

?

大腸桿菌嗜鹽α-淀粉酶基因的分子改造及其酶學(xué)特性*

0引言

【研究意義】α-淀粉酶作為一種重要的工業(yè)用酶[1]，目前已廣泛應(yīng)用于焙烤、啤酒釀造、紡織退漿、制藥等行業(yè)中[2-5]。普通的淀粉酶作為生物催化劑，效率高但所需條件溫和，在強酸、強堿、高鹽等極端環(huán)境下耐受性差,易變性失活；而極端酶卻能在這種殘酷的環(huán)境下依然保持高效的催化能力。因此，研究、挖掘極端酶，開發(fā)其潛在的應(yīng)用價值就具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M展】目前對于嗜鹽α-淀粉酶的嗜鹽機理，主要存在兩種理論：一是在高濃度的離子環(huán)境中，通過特定位置上的一些關(guān)鍵離子相互作用及其與水形成的巨大水網(wǎng)絡(luò)來穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)[6]；二是通過弱疏水的內(nèi)核與酸性的、高離子化的蛋白表面作為其在環(huán)境中的平衡因子來維持它們在高鹽環(huán)境下的正確折疊等[7]，這與Alteemark[8]、Madern[9]、Kastritis[10]、Nonaka[11]等在嗜鹽酶方面的研究結(jié)果基本吻合?！颈狙芯壳腥朦c】本文研究的嗜鹽α-淀粉酶基因來自于非嗜鹽菌Escherichia coli JM109，在高鹽環(huán)境下依然能保持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和高效的生物催化能力，這在食品腌制、調(diào)味劑等的工業(yè)生產(chǎn)及鹽堿地的改造等多方面都具有開發(fā)利用價值[12]。因此，我們參照上述的研究結(jié)果，通過同源建模，選定嗜鹽α-淀粉酶定點突變的位置及替換氨基酸k6-P368G,并研究其相關(guān)的酶學(xué)特性?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究嗜鹽α-淀粉酶基因k6的嗜鹽特性是否與Na+結(jié)合位點具有直接的聯(lián)系，探索嗜鹽α-淀粉酶嗜鹽的分子機理。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑

PrimeSTAR HS DNA聚合酶(TaKaRa公司)，DpN Ⅰ(TaKaRa公司)，金屬鎳親和層析介質(zhì)(phamacia公司)，IPTG(CALBIOCHEM公司)，麥芽糖及其麥芽三糖為色譜純，Lysis buffer(50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑)，其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.2菌種和質(zhì)粒

宿主大腸桿菌E.coli JM109及其表達載體pSE380均為實驗室保藏菌種。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計

根據(jù)已有的大腸桿菌JM109嗜鹽淀粉酶基因序列，再參照前面所述的嗜鹽淀粉酶定點突變位點的選擇，設(shè)計引物(P1：5′-TTCTATGGCGACCTCTACGGTGCGCAT-3′；P2：5′-GAGGTCGCCATAGAATACCGAAGGAAC-3′)，反向定點擴增目的基因。

1.2.2定點突變基因的擴增

從含有嗜鹽α-淀粉酶基因k6的pSE380-K6菌株中提取重組質(zhì)粒作模板，以P1、P2為引物，擴增點突變目的基因k6-P368G，其擴增體系為50 μL，擴增條件為：98℃預(yù)變性3 min，98℃變性10 s，60℃退火15 s，72℃延伸90 s，循環(huán)29次，最后72℃延伸10 min。

1.2.3重組表達載體的構(gòu)建及其目的蛋白的表達純化

將驗證后的PCR擴增產(chǎn)物膠回收，DpNⅠ酶消除模板。利用化學(xué)轉(zhuǎn)化法，將純化的點突變產(chǎn)物轉(zhuǎn)入到宿主細(xì)胞JM109中并測序驗證。將點突變成功的菌種接種到LB(含100 mg/L的Amp)培養(yǎng)基中，37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)，當(dāng)OD600達到0.6～0.8時，加入終濃度為0.5 mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG，在30℃恒溫?fù)u床中繼續(xù)培養(yǎng)10 h，進行目的蛋白的誘導(dǎo)表達。離心已培養(yǎng)好的發(fā)酵液，收集菌體，用中性磷酸-檸檬酸緩沖液重懸菌體，清洗兩次，然后再用10 mmol/L的Lysis buffer(缺少NaCl成分)重懸菌體，在冰浴條件下超聲波破胞。最后離心破胞液，收集上清，利用金屬鎳親和層析純化目的蛋白，并進行SDS-PAGE凝膠電泳檢測目的蛋白的純化效果。

1.2.4酶活的測定

淀粉酶酶活的測定參考Bernfeld[13]的方法并結(jié)合自己的標(biāo)準(zhǔn)曲線體系：取190 μL 1%(W/V)的可溶性淀粉為底物，加入到1.5 mL的Eppendorf管中，加入稀釋一定倍數(shù)的純酶液10 μL，而空白對照組中加入相同體積的經(jīng)煮沸滅活的稀釋純酶液，在最適條件下反應(yīng)10 min，反應(yīng)結(jié)束后加入400 μL的3，5-二硝基水楊酸溶液(DNS)終止反應(yīng)。沸水浴5 min顯色，再迅速置于冰水混合液中快速冷卻，混勻后取200 μL混合液于96孔板中，測定其吸光值OD540。酶活力單位定義為在最適條件下，按照上述的反應(yīng)體系，每1 min生成1 μmol還原糖所需要的酶量為一個酶活單位(U)。根據(jù)國際酶學(xué)會的規(guī)定計算比活力，即比活力=酶活(U)/蛋白含量(mg)，重組酶蛋白含量按照《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊》中的Bradford方法[14]來測定。

1.2.5突變酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

(1)最適pH值

取稀釋一定倍數(shù)的純酶液10 μL加入到含1%(W/V)可溶性淀粉、2 mol/L NaCl(野生型嗜鹽淀粉酶K6的最適NaCl濃度)的不同pH值的磷酸-檸檬酸緩沖液中，在37℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)10 min后測定其酶活，以最高酶活力為1繪制pH值對酶活力的影響曲線。

(2)最適溫度

取稀釋一定倍數(shù)的純酶液10 μL加入到含1%可溶性淀粉、2 mol/L NaCl的pH值為7.0的磷酸-檸檬酸緩沖液中,分別在25～65℃水浴條件下反應(yīng)10 min，然后測定其酶活，以最高酶活力為1繪制溫度對酶活力的影響曲線。

(3)最適NaCl濃度

取稀釋一定倍數(shù)的純酶液10 μL加入到含1%可溶性淀粉、pH值為7.0、不同NaCl濃度的磷酸-檸檬酸緩沖液中，在50℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)10 min后測定其酶活，以最高酶活為1繪制NaCl濃度對酶活力的影響曲線。

(4)Ca2+對酶活性的影響

用不同濃度的Ca2+溶液同時處理稀釋酶液(在4℃低溫條件下處理12 h)，取10 μL經(jīng)處理的酶液與1%可溶性淀粉在最適條件下反應(yīng)10 min后測定其酶活,以未經(jīng)處理的酶液在同等條件下測得的酶活力為1，繪制Ca2+對酶活力影響曲線。

(5)EDTA對酶活力的影響

參照Ca2+對酶穩(wěn)定性影響的測定方法，繪制EDTA對酶活力影響的柱狀圖。

(6)金屬離子對酶活力的影響

將終濃度為5 mmol/L的不同金屬離子分別與1%可溶性淀粉混勻，取10 μL稀釋后的純酶液分別與上述混合物作用，在最適條件下反應(yīng)10 min后測定其殘余酶活；以未加金屬離子的底物為空白對照組，在同等條件下測得的酶活力為1，繪制金屬離子對突變酶活力影響的柱狀圖。

(7)有機溶劑對酶活力的影響

將終濃度為5%(V/V)的不同有機溶劑分別與1%可溶性淀粉混勻，取10 μL稀釋一定倍數(shù)的純酶液，在最適條件下反應(yīng)10 min后測定其酶活，以未加有機溶劑的為空白對照，在同等條件下測得的酶活力為1，繪制有機溶劑對酶活力影響柱狀圖。

(8)pH穩(wěn)定性

用不同pH值緩沖液稀釋純酶液(pH值為5～8的磷酸-檸檬酸緩沖液)，于4℃處理12 h，在最適條件下與1%可溶性淀粉反應(yīng)10 min，然后測定其殘余酶活，以未經(jīng)處理的酶液為空白對照，在相同條件下測得的酶活力為1，繪制酶的pH值穩(wěn)定曲線。

(9)突變酶溫度穩(wěn)定性

在各溫度梯度下，將稀釋一定倍數(shù)的純酶液恒溫處理1 h，再在最適條件下與1%可溶性淀粉反應(yīng)10 min，然后測試其殘留酶活，以未經(jīng)處理的酶液為空白對照，在相同條件下測得的酶活力為1，繪制酶的溫度穩(wěn)定性曲線。

(10)NaCl對非嗜鹽淀粉酶的活力影響

選定非嗜鹽的淀粉酶作為對照，對比分析不同濃度的NaCl對其活力的影響。在其最適條件下，以1%可溶性淀粉為底物，反應(yīng)10 min，測定其殘余酶活，以未加NaCl的為空白對照，相同條件測定其酶活，繪制不同濃度的NaCl對非嗜鹽淀粉酶的影響曲線。

1.2.6HPLC對重組嗜鹽α-淀粉酶水解產(chǎn)物的檢測分析

取過量的純酶與1 mL 2%可溶性淀粉在最適條件下反應(yīng)12 h，其產(chǎn)物經(jīng)處理后用HPLC檢測，HPLC分析條件如下：色譜柱：Iltima Amino 100A 5u柱(4.6 mm×250 mm)；檢測器：Alltech 2000ES型蒸發(fā)光散射檢測器；流動相：80%乙腈，20% H2O；流速：1 mL/min；柱溫：28℃。

2結(jié)果與分析

2.1目的基因在大腸桿菌中的表達及純化

點突變后的目的基因在大腸桿菌JM109中表達，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳得到一條相對分子質(zhì)量(Mr)約為56 kDa的目的條帶(泳道3)(圖1)，經(jīng)鎳柱純化得到突變的目的蛋白(泳道4)。結(jié)果表明目的基因在大腸桿菌JM109中成功表達，而且經(jīng)鎳柱純化后的目的蛋白條帶單一，可以進行酶學(xué)性質(zhì)的研究分析。

1：蛋白Marker；2：誘導(dǎo)空載體pSE380/JM109可溶性蛋白；3：誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化子pSE380-K6-P368G/JM109可溶性蛋白；

4：純化的目的蛋白K6-P368G

1:Protein marker;2:Protein from soluble fractions of pSE380/JM109 with induction;3:Protein from soluble fractions of pSE380-K6-P368G/JM109 with induction;4:Purified K6-P368G from soluble fractions of pSE380-K6-P368G/JM109

圖1嗜鹽淀粉酶的SDS-PAGE

Fig.1SDS-PAGE of the halophilic amylase

2.2酶學(xué)性質(zhì)分析

2.2.1最適pH值

如圖2所示，突變酶與野生酶的最適pH值均為7.0；在pH值 6.0以下，兩者的相對酶活力幾乎為零；在pH值8.0以上，兩者的相對酶活力僅為最高酶活力的40%左右。在同等條件下，突變酶具有更高的相對活力，使其在單位酶量下具有更高的生物催化能力。

圖2酶的最適pH值

Fig.2Optimal pH of enzymes

2.2.2最適溫度

如圖3，野生酶的最適溫度是55℃，而突變酶的最適溫度是50℃，略低于野生酶的最適溫度，但是兩者非?？拷囟仍?0～60℃時，野生酶與突變酶的酶活較高，相對活力維持在70%以上。當(dāng)溫度超過55℃后酶活力急劇下降，可知高溫對該酶的抑制作用遠(yuǎn)大于低溫的影響。

圖3酶的最適溫度

Fig.3Optimal temperature of enzymes

2.2.3最適NaCl濃度

由圖4可知，野生酶的的最適NaCl濃度為2 mol/L，而突變酶的最適NaCl濃度為3 mol/L，最適NaCl濃度提高50%，使突變酶在更苛刻的反應(yīng)條件下依然具有較高的生物催化能力，并且在NaCl濃度達到飽和狀態(tài)時，其相對活力仍接近50%。

2.2.4Ca2+對突變酶活性的影響

如圖5所示，Ca2+濃度對突變酶的活性影響不大，殘留的相對酶活力均保持在80%以上。

圖4　酶的最適NaCl濃度

圖5Ca2+對酶活力的影響

Fig.5Effect of Ca2+on enzyme acivity

2.2.5EDTA對突變酶活性的影響

圖6結(jié)果表明，EDTA的濃度對突變酶活性的影響不大，殘留的相對酶活力均超過85%，且各濃度之間的差異性很小。

圖6EDTA對酶活力的影響

Fig.6Effect of EDTA on enzyme activity

2.2.6金屬離子對突變酶活性的影響

由圖7可見,Cu2+的抑制現(xiàn)象最為明顯，幾乎完全抑制了突變酶的酶活力。Mg2+、Ca2+和Ba2+的抑制作用最為微弱，殘留的相對酶活力均超過80%。Zn2+和Mn2+的影響近似一致，其抑制率約為60%。

2.2.7有機溶劑對突變酶活性的影響

如圖8所示，正丙醇、異丙醇、正丁醇、吡啶和四氫呋喃對酶的抑制作用最為明顯，酶的相對酶活力損失均超過70%，而乙二醇、乙酸乙酯、1,2-丙二醇、丙三醇及二甲基亞砜的影響基本一致，其抑制率為30%左右。

圖7　金屬離子對酶活力的影響

圖8有機溶劑對酶活力的影響

Fig.8Effect of organic solvents on enzyme activity

2.2.8突變酶的pH穩(wěn)定性

如圖9所示，該酶在pH值為5.0～8.0環(huán)境中比較穩(wěn)定，相對活力均保持在70%以上，證明突變酶的pH穩(wěn)定性良好，該性質(zhì)對酶的儲存保藏及其在生產(chǎn)生活中的應(yīng)用等都有積極作用。

圖9酶的pH穩(wěn)定性

Fig.9pH stability of enzyme

2.2.9突變酶的溫度穩(wěn)定性

該酶在40℃以下時，具有較好的熱穩(wěn)定性，其相對酶活力殘留達70%以上；超過45℃后，熱穩(wěn)定性急速降低，50℃恒溫處理1 h后突變酶的生化催化能力幾乎完全喪失(圖10)。

圖10酶的熱穩(wěn)定性

Fig.10Thermal stability of enzyme

2.2.10NaCl對非嗜鹽α-淀粉酶的活性的影響

從圖11可以看出，超過一定濃度的NaCl對非嗜鹽α-淀粉酶具有明顯抑制作用，而對嗜鹽α-淀粉酶就沒有相似的作用(圖4)，說明不是所有的蛋白酶都需要高濃度的氯化鈉。

圖11NaCl對非嗜鹽淀粉酶活力影響

Fig.11Effect of NaCl on nonhalophilic enzyme activity

2.2.11HPLC對突變酶水解產(chǎn)物的檢測分析

檢測結(jié)果表明(圖12)，該酶水解可溶性淀粉后的產(chǎn)物以葡萄糖為主，并含有少量的麥芽糖和麥芽三糖。

圖12酶水解淀粉產(chǎn)物HPLC分析色譜圖

Fig.12HPLC chromatogram of the products from starch by enzyme

3討論

嗜鹽α-淀粉酶能在極端環(huán)境下維持空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和生物催化活性，因而在食品腌制、發(fā)酵、調(diào)味劑的生產(chǎn)，海洋食品的開發(fā)，烘焙等多行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景。本實驗組另辟蹊徑，從非嗜鹽的大腸桿菌JM109中克隆擴增到一個嗜鹽α-淀粉酶基因并成功表達，并非從傳統(tǒng)途徑嗜極菌Halorhabdus utahensis[15]、Haloacrula hispanica[16]、Pseudoal-

teromonsa sp.strain CP76[17]等中獲得嗜鹽α-淀粉酶基因,這為擴展嗜鹽α-淀粉酶的來源，尋找適合人類需求的生物催化酶類提供多種選擇途徑。通過定點突變，本實驗所研究的嗜鹽淀粉酶的酶學(xué)特性相對于野生型發(fā)生明顯變化，尤其是其嗜鹽程度，最適NaCl濃度由野生酶的2 mol/L提高到3 mol/L,其比活力也增加近4倍，達到4 831 U/mg，這為該酶的分子改造打下堅實的基礎(chǔ)，也為進一步研究探索其嗜鹽機理提供新的信息和依據(jù)。

參考文獻:

[1]覃曉麗，李劍龍，吳昊，等.嗜鹽淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選鑒定及其酶學(xué)性質(zhì)研究[J].廣西科學(xué)，2014，21(2):129-134.

QIN X L，LI J L，WU H，et al.Isolation，identification and enzymatic characteristics of a halophilic-amylase-producing strain[J].Guangxi Sciences，2014，21(2):129-134.

[2]MALHOTRA R，NOORWEZ S，SATYANARAYANA T.Production and partial characterization of thermostable and calcium-independent α-amylase of an extreme thermophile Bacillus thermooleovorans NP54[J].Letters Applled Microbiology，2000，31:378-384.

[3]MURAKAMI S，NISHIMOTO H，TOYAMA Y，et al.Purification and characterization of two alkaline，thermotolerant α-amylases from Bacillus halodurans 38C-2-1 and expression of the cloned gene in Escherichia coli[J].Biosci Biotechnol Biochem，2007，71:2393-2401.

[4]HASHIM S O，DELGADO O，HATTI-KAUL R，et al.Starch hydrolysing Bacillus halodurans isolates from a Kenyan soda lake[J].Biotechnol Lett，2004，26:823-828.

[5]MURAKAMI S，NAGASAKI K，NISHIMOTO H，et

al.Purifivcation and characterization of five alkaline，thermotolerant，and maltotetraoseproducing alpha-amylases from Bacillus halodurans MS-2-5，and production of recombinant enzymes in Escherichia coli[J].Enzyme Microb Technol，2008，43:321-328.

[6]RICHARD S B，MADERN D，GARCIN E，et al.Halophilic adaptation:Novel solvent protein interactions observed in the 2.9 and 2.6 a resolution structures of the wild type and a mutant of malate dehydrogenase from Haloarcula marismortui[J].Biochemistry，2000，39(5):992-1000.

[7]MEVARECH M，F(xiàn)ROLOW F，GLOSS L M.Halophilic enzymes:Proteins with a grain of salt[J].Biophys Chem，2000，86(2/3):155-164.

[8]ALTERMARK B，THORVALDSEN S，MOE E，et al.Sequence comparison and environmental adaptation of a bacterial endonuclease[J].Comput Biol Chem，2007，31(3):163-172.

[9]MADERN D，EBEL C.Influence of an anion-binding site in the stabilization of halophilic malate dehydrogenase from Haloarcula marismortui[J].Biochimie，2007，89(8):981-987.

[10]KASTRITIS P L，PAPANDREOU N C，HAMODR-

AKAS S J.Haloadaptation:Insights from comparative modeling studies of halophilic archaeal DHFRs[J].International Journal of Biological Macromolecules，2007，41(4):447-453.

[11]NONAKA T，F(xiàn)UJIHASHI M，KITA A，et al.Crystal structure of calcium-free α-amylase from Bacillus sp.strain KSM-38(AmyK38) and its sodium ion binding sites[J].Biochemistry and Molecular Biology，2003，4(28):818-824.

[12]龍彪，饒國華，彭志英，等.食品應(yīng)用新酶源-極端酶[J].中國食品添加劑，2005，3：47-50.

LONG B，RAO G H，PENG Z Y，et al.Extremozymes as a source of novel enzymes for application in food industry[J].China Food Additives，2005，3：47-50.

[13]BERNFELD P.Amylase，α and β[M]// Methods in

Enzymology (vol.1).COLOVICK S P，KAPLAN N O，eds.New York:Academic Press，1955：149-158.

[14]汪家政，范明.蛋白質(zhì)技術(shù)手冊[M].北京:科學(xué)出版社，2000：42-46.

WANG J Z，F(xiàn)AN M.Protein Technical Manual[M].Beijing:Science Press，2000：42-46.

[15]WAIN M，INGVORSEN K.Production of beta-xylana-

se and beta-xylosidase by the extremely halophilic archaeon Halorhabdus utahensis[J].Extremophiles,2003，7(2):87-93.

[16]HUTCHEON G W，VASISHT N，BOLHUIS A.Characterization of a highly stable α-amylase from the halophilic archaeon Haloarcula hispanica[J].Extremophiles，2005，9(6)：487-495.

C，et al.Screening and characterization of the protease CP1 produced by the moderately halophilic bacterium Pseudoalteromonas sp.strain CP76[J].Extremophiles Life Under Extreme Conditions，2003，7(3):221-228.

(責(zé)任編輯：米慧芝)

Escherichia coli Halophilic alpha Amylase Gene Molecular Modification and Enzymology Characteristics

李劍龍1,2，楊媛1,2，吳昊1,2，湯宏赤1,2，韋宇拓1,2**

LI Jianlong1,2，YANG Yuan1,2，WU Hao1,2，TANG Hongchi1,2，WEI Yutuo1,2

(1.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530005；2.亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西南寧530005)

(1.College of Life Science and Technology,Guangxi University,Nanning,Guangxi,530005,China;2.State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources,Nanning,Guangxi,530005,China)

摘要：【目的】對大腸桿菌Escherichia coli嗜鹽α-淀粉酶基因進行改造，并探索嗜鹽α-淀粉酶的嗜鹽特性?！痉椒ā繌姆鞘塞}的大腸桿菌JM109中克隆到一個嗜鹽α-淀粉酶基因k6并進行重組表達。通過同源建模，確定Na+結(jié)合位點上的氨基酸殘基，并對相應(yīng)位點進行定點突變。最后對突變酶的酶學(xué)性質(zhì)進行研究?！窘Y(jié)果】相對于野生酶，突變酶更加嗜鹽，其最適NaCl濃度由2 mol/L增加到3 mol/L,最適pH值為7,最適溫度為50℃，酶活力為4 831 U/mg,提高近4倍。經(jīng)HPLC檢測，突變酶與2%(W/V)可溶性淀粉反應(yīng)后的產(chǎn)物為葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖的混合物?！窘Y(jié)論】嗜鹽α-淀粉酶基因k6的嗜鹽特性與Na+結(jié)合位點具有直接聯(lián)系。

關(guān)鍵詞：非嗜鹽菌嗜鹽淀粉酶同源建模定點突變

Abstract：【Objective】The modification of halophilic α-amylase gene -was conducted in Escherichia coli to explore halophilic properties of halophilic α-amylase.【Methods】Firstly, a halophilic amylase gene was cloned from the non-halophilic bacteria E.coli JM109, and the recombinant gene was successfully expressed.Secondly,the amino acid binding site of Na+ was determined by homology modeling, and site-directed mutagenesis was conducted at the corresponding sites.Finally,the enzymatic properties of the mutant enzymes were studied.【Results】The mutant enzyme was characterized by higher halophilic property than wild type,and the optimum concentration of NaCl increased from 2 mol/L added to 3 mol/L. The halophilic amylase had the optimum pH at 7 and the optimum temperature at 50℃,under which its specific activity was 4 831 U/mg,revealing nearly fourfold increase than the original enzyme.HPLC testing showed that the products were mixed with glucose，maltose and maltotriose after the reaction with 2%(W/V) of soluble starch.【Conclusion】Halophilic characteristics of halophilic amylase gene k6 has direct relationship with Na+ binding site.

Key words：non-halophilic bacteria，halophilic amylase，homology modeling，site-directed mutagenesis

中圖分類號：Q93

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1005-9164(2016)01-0025-06

作者簡介：李劍龍(1988-)，男，碩士研究生，主要從事微生物生物技術(shù)研究。

收稿日期：2015-11-20

修回日期：2016-01-31

*國家自然基金項目(31460437)和廣西研究生教育創(chuàng)新計劃項目(YCSZ2014050)資助。

**通訊作者：韋宇拓(1971-)，男，教授，主要從事發(fā)酵與酶工程研究,E-mail:weiyutuo@gxu.edu.cn。

廣西科學(xué)Guangxi Sciences 2016,23(1):25～30

網(wǎng)絡(luò)優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-03-15

網(wǎng)絡(luò)優(yōu)先數(shù)字出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/45.1206.G3.20160315.1510.010.html