黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶培養(yǎng)基的優(yōu)化

錢 偉，黃元杰，王先鋒，高乾坤，孟 娜，魏勝華，2＊（．安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖 24000；2．安徽工程大學(xué)微生物發(fā)酵安徽省工程研究中心，安徽蕪湖 24000）

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黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶培養(yǎng)基的優(yōu)化

錢 偉1，黃元杰1，王先鋒1，高乾坤1，孟 娜1，魏勝華1，2＊
（1．安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽蕪湖 241000；2．安徽工程大學(xué)微生物發(fā)酵安徽省工程研究中心，安徽蕪湖 241000）

摘要：以黑曲霉（Aspergillus niger）為柚苷酶生產(chǎn)菌株，進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)柚苷酶．首先采用單因素實驗對發(fā)酵培養(yǎng)基的固液比、氮源、無機(jī)鹽及誘導(dǎo)底物柚皮粉的加入量進(jìn)行初步優(yōu)化，再通過正交試驗確定了黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶最優(yōu)培養(yǎng)基的組成．實驗結(jié)果表明：在500mL三角瓶中，麩皮與柚皮粉加入總質(zhì)量為5．5g，其中，柚皮粉的加入量為2．0g，培養(yǎng)基固液比為1∶2．5，（NH4）2SO4加入量為0．5g，MgSO4加入量為0．03g．通過優(yōu)化后的培養(yǎng)基進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶的研究，發(fā)酵144h酶活達(dá)到最大為1248．0U／g，比優(yōu)化前的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（377．6U／g）提高了2．3倍．

關(guān) 鍵 詞：黑曲霉；柚苷酶；固態(tài)發(fā)酵；培養(yǎng)基優(yōu)化

通迅作者：魏勝華（1972－），男，安徽無為人，副教授，碩導(dǎo)．

柚苷酶是一種通常由黑曲霉或青霉產(chǎn)生的可水解柚皮苷的糖苷酶［1－2］．柚皮苷是多數(shù)柑橘類水果中的主要苦味物質(zhì)，其存在影響了此類果汁飲料的口感，采用柚苷酶脫苦是一種簡便而高效的方法［3］．研究表明，柚苷酶是由α－L－鼠李糖苷酶（E．C．3．2．1．40）和β－D－葡萄糖苷酶（E．C．3．2．1．21）組成的多酶復(fù)合體［4］，該酶水解柚皮苷主要是通過α－L－鼠李糖苷酶將柚皮苷先水解成鼠李糖和普魯寧，而后利用β－D－葡萄糖苷酶將普魯寧進(jìn)一步水解成柚皮素和D－葡萄糖［5］．柚苷酶不僅在食品行業(yè)中應(yīng)用于果汁脫苦、葡萄酒增香，而且在α－L－鼠李糖和普魯寧的制備、黃酮類中藥加工及甾體轉(zhuǎn)化［6－8］等方面具有重要的應(yīng)用價值．柚苷酶的廣泛用途引發(fā)了人們對它的興趣．

在酶制劑的制備過程中，通常采用深層液態(tài)發(fā)酵（Submerged Fermentation，SMF）和固態(tài)發(fā)酵（Solid State Fermentation，SSF）兩種方法．在柚苷酶的制備過程中，多數(shù)研究涉及液態(tài)發(fā)酵．固態(tài)發(fā)酵是指在培養(yǎng)基呈固態(tài)，盡管含水豐富，但是沒有或者幾乎沒有自由流動水的狀態(tài)下進(jìn)行的一種或者多種微生物發(fā)酵過程．相比較液態(tài)發(fā)酵，固態(tài)發(fā)酵具有培養(yǎng)基自由水含量少，廢水、廢渣少，容易處理；培養(yǎng)基原料多為天然基質(zhì)或廢渣，來源廣泛，價格低廉；可以減少農(nóng)副產(chǎn)品廢棄物對環(huán)境的污染；產(chǎn)物濃度較高，后處理方便等優(yōu)點［9］．目前，在固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶方面的研究不多，蔣樹海［10］等以豆粉、米糠、甘蔗渣、麥麩和橘皮等作為原料，培養(yǎng)黑曲霉產(chǎn)柚苷酶．倪輝［11］等應(yīng)用棘孢曲霉以柚皮粉和豆餅粉為培養(yǎng)基，采用生料發(fā)酵，柚苷酶活力達(dá)到5．81IU／gds．由于具有以上優(yōu)點，固態(tài)發(fā)酵在發(fā)酵生產(chǎn)酶制劑方面受到廣泛關(guān)注，在纖維素酶［12］、單寧酶［13］、鼠李糖苷酶［14］等酶的制備方面都有成功應(yīng)用．盡管柚苷酶用途較廣，但國內(nèi)在工業(yè)生產(chǎn)中卻鮮有利用柚苷酶的報道，其主要原因是商品柚苷酶制劑價格高昂，限制了柚苷酶的開發(fā)應(yīng)用．因此，探索并建立高產(chǎn)柚苷酶的發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)具有重要的實用價值，采用黑曲霉固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)柚苷酶，對發(fā)酵生產(chǎn)柚苷酶的固態(tài)基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以獲得最佳產(chǎn)柚苷酶固態(tài)培養(yǎng)基，為固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶提供了依據(jù)．

1 材料與方法

1．1 菌株、試劑與儀器

黑曲霉（Aspergillus niger），由微生物發(fā)酵安徽省工程研究中心提供；柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司，純度≥99%；蔗糖、硝酸鈉、氯化鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、乙酸、乙酸鈉、葡萄糖、氯化鈣、氫氧化鈉、一縮二乙二醇均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司．

HH－6恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；HYG－3恒溫?fù)u床（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；TD5Z臺式低速離心機(jī)（昆明諾金科技有限公司）；SW－GJ－2FD凈化工作臺（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；723型可見光分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）．

1．2 培養(yǎng)基

PDA斜面培養(yǎng)基（g／L）：馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂20g，水1000mL，自然pH值．固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基：麩皮5．0g，柚皮粉0．5g，水適量，pH 6．0．

1．3 單孢子菌懸液的制備

將在4℃貯藏的斜面菌種接種于斜面培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)4～6d后得到成熟孢子．用無菌生理鹽水清洗孢子，并放入裝有無菌玻璃珠和50mL無菌生理鹽水的錐形瓶中，充分振蕩打散孢子，即得到單孢子菌懸液．

1．4 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶

在500mL的三角瓶中加入配好的固態(tài)培養(yǎng)基，121℃，1．01×105Pa滅菌30min．冷卻后接入孢子懸液，在恒溫箱中培養(yǎng)6d．

1．5 粗酶液的制備

發(fā)酵結(jié)束以后，在三角瓶中加入120mL、pH 4．0的乙酸－乙酸鈉的緩沖溶液，30℃、200r／min恒溫?fù)u床震蕩2h后，用4層紗布過濾得粗酶液．將粗酶液于4 000r／min離心10min，取上清液置于4℃冰箱中保存待測．

1．6 酶活測定方法

酶活的測定釆用改良Davis法［15］，將粗酶液用pH 4．0醋酸緩沖液稀釋，在試管中依次加入0．4g／L柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)液2mL，0．2mol／L的pH 4．0醋酸緩沖液2mL，置于40℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱5min后，加入已稀釋的發(fā)酵液1mL，在40℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30min．反應(yīng)結(jié)束后，取1mL酶解液依次加入90%的一縮二乙二醇5mL、4mol／L NaOH溶液0．1mL及蒸餾水3．9mL，并以1mL蒸餾水做空白對照，于40℃恒溫水浴10min，在420nm處測吸光度值．酶活力單位定義為：在40℃、pH 4．0條件下，每毫升酶液每分鐘水解1μg柚皮苷所需的酶量定義為1個酶活力單位（U）．

1．7 實驗設(shè)計

首先采用單因素實驗優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，即在初始培養(yǎng)條件下對影響黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶過程中的培養(yǎng)基固液比、氮源、無機(jī)鹽、誘導(dǎo)物加入量進(jìn)行單因素優(yōu)化試驗．在單因素的基礎(chǔ)上，以培養(yǎng)基固液比、氮源加入量、無機(jī)鹽加入量、誘導(dǎo)物柚皮粉的加入量為影響因素，以柚苷酶酶活為指標(biāo)，設(shè)計4因素3水平L9（34）正交試驗．

2 結(jié)果與討論

2．1 固液比對黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶的影響

由于固態(tài)發(fā)酵最大特點就是沒有游離水，因而底物含水量的變化對微生物生長代謝及產(chǎn)酶都有著重要的影響．以固態(tài)基礎(chǔ)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，保持其他發(fā)酵條件不變，按不同固液比配制不同的培養(yǎng)基，其中固液比分別為1∶1、1∶1．5、1∶2、1∶2．5、1∶3和1∶3．5，將滅過菌后冷卻到室溫的培養(yǎng)基接入制備好的黑曲霉孢子懸液，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6d，測定柚苷酶酶活，比較不同固液比對黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶的影響，結(jié)果如圖1所示．從圖1可以看出，培養(yǎng)基的固液比對黑曲霉產(chǎn)柚苷酶有很大影響，當(dāng)固液比為1∶2．5時，黑曲霉表現(xiàn)出最高的酶活，最高酶活力為1021．5U／g．在固液比較高時，隨著固液比的降低，黑曲霉產(chǎn)柚苷酶的能力逐漸增強(qiáng)．當(dāng)固液比達(dá)到1∶2．5時，此時繼續(xù)減小固液比，黑曲霉產(chǎn)柚苷酶的酶活開始有所降低．這是由于固液比的大小影響著菌種的生長，固液比較高時，黑曲霉的生長過程中缺乏水分，過早的產(chǎn)生孢子使菌體產(chǎn)酶較少，從而總體酶活較低．固液比過低則會使得黑曲霉與空氣之間的傳質(zhì)能力降低，導(dǎo)致菌種的生長較慢從而不利于產(chǎn)酶．因此，黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶的最佳固液比為1∶2．5．

2．2 不同氮源對黑曲霉產(chǎn)柚苷酶的影響

為研究不同氮源對黑曲霉產(chǎn)柚苷酶的影響，以固態(tài)基礎(chǔ)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，保持其他發(fā)酵條件不變，分別以0．5g（NH4）2SO4、0．5g NaNO3、0．5g NH4Cl、0．5g NH4NO3以及0．5g蛋白胨為氮源配制不同的培養(yǎng)基．將配好的培養(yǎng)基接入制備好的黑曲霉孢子懸液，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6d，測定柚苷酶酶活，結(jié)果如圖2所示．從圖2可以看出，氮源的選擇對菌株的生長有很大的影響，其中以（NH4）2SO4為氮源時菌株產(chǎn)柚苷酶的酶活達(dá)到最大值，最大酶活為1047．0U／g．微生物的培養(yǎng)過程中理想的氮源一般為蛋白類物質(zhì)，例如牛肉膏、蛋白胨，但以蛋白胨為氮源獲得柚苷酶的酶活只有756．7U／g，其主要是因為固體培養(yǎng)時水的加入量非常少，在水分濕潤固體基質(zhì)的過程中，極易使蛋白胨發(fā)生粘結(jié)成團(tuán)從而導(dǎo)致黑曲霉與蛋白胨的接觸面降低，造成黑曲霉對蛋白胨的利用率下降，黑曲霉的生長受到相對抑制，從而導(dǎo)致黑曲霉產(chǎn)柚苷酶的酶活降低．因此，實驗過程中選擇無機(jī)氮源（NH4）2SO4作為固態(tài)發(fā)酵氮源更為適合．

圖1　固液比對黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶的影響　

圖2　不同氮源對黑曲霉產(chǎn)柚苷酶的影響

2．3 不同無機(jī)鹽對黑曲霉產(chǎn)柚苷酶的影響

無機(jī)鹽在細(xì)胞組成及酶的激活方面有著重要的作用．以固態(tài)基礎(chǔ)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，保持其他發(fā)酵條件不變，分別以0．02g FeSO4、0．02g K2HPO4、0．02g NaCl、0．02g MgSO4以及0．02g CaCl2為無機(jī)鹽配制不同的培養(yǎng)基．將配好的培養(yǎng)基接入制備好的黑曲霉孢子懸液，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6d，測定柚苷酶酶活，比較不同無機(jī)鹽對黑曲霉產(chǎn)柚苷酶的影響，結(jié)果如圖3所示．由圖3可以看出，無機(jī)鹽對黑曲霉的生長有著不可或缺的作用，在培養(yǎng)基中添加一些必要的無機(jī)鹽可促進(jìn)黑曲霉的生長，而且一些無機(jī)鹽的加入還可起到緩沖作用，特別是像Mg2＋、PO3－4、Na＋這類離子，在細(xì)胞代謝以及某些酶的合成中也起著重要作用．實驗中選取的各種無機(jī)鹽對黑曲霉產(chǎn)柚苷酶作用大小依次為MgSO4＞K2HPO4＞CaCl2＞FeSO4＞NaCl，其中以MgSO4作為固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的無機(jī)鹽時，所產(chǎn)柚苷酶酶活可達(dá)到1 080．5U／g．因此，選擇MgSO4作為黑曲霉固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的無機(jī)鹽可明顯提高黑曲霉的產(chǎn)酶能力．

2．4 誘導(dǎo)物加入量對黑曲霉產(chǎn)柚苷酶的影響

保持麩皮與誘導(dǎo)物柚皮粉總質(zhì)量為5．5g，其他發(fā)酵條件不變，研究了誘導(dǎo)物柚皮粉的加入量對黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶的影響，結(jié)果如圖4所示．從圖4可以看出，黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶過程中，培養(yǎng)基中誘導(dǎo)物柚皮粉的加入量對柚苷酶產(chǎn)生有重要的影響，當(dāng)柚皮粉的加入量為2．0g時，黑曲霉產(chǎn)柚苷酶酶活力最高，達(dá)到1146．3U／g．可能是柚苷酶作為一種誘導(dǎo)酶，柚皮粉中的柚皮苷是其作用底物，一定量柚皮粉的加入不僅可以誘導(dǎo)黑曲霉產(chǎn)柚苷酶，而且可以作為黑曲霉生長的碳源，提高產(chǎn)柚苷酶的能力．但是，當(dāng)柚皮粉加入量過多時，導(dǎo)致麩皮加入量過少不利于固體培養(yǎng)基的透氣，從而影響菌體的生長；而柚皮粉加入量過少時，導(dǎo)致麩皮加入量過多，麩皮中易被黑曲霉利用的碳源含量較低，也不利于菌體生長．因此，選擇柚皮粉加入量為2．0g時，黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶的效果最優(yōu)．

2．5 最佳培養(yǎng)基的篩選

在以上單因素實驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計了L9（34）正交試驗因素水平表，考察黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶的最佳條件，正交試驗因素與水平如表1所示，正交試驗結(jié)果與分析如表2所示．由表2可以看出，對黑曲霉產(chǎn)柚苷酶酶活的影響由極差大小確定：D＞A＞B＞C，即對固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶酶活影響大小的因素依次為：柚皮粉的加入量＞固液比＞氮源（NH4）2SO4加入量＞無機(jī)鹽MgSO4加入量．因此，培養(yǎng)基的最優(yōu)因素水平組合為：A2B2C3D2，即培養(yǎng)基固液比為1∶2．5，（NH4）2SO4加入量為0．5g，MgSO4加入量為0．03g，柚皮粉的加入量為2．0g．

圖3　不同無機(jī)鹽對黑曲霉產(chǎn)柚苷酶的影響　

圖4　柚皮粉的加入量對黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶的影響

表1 正交試驗因素水平表

表2　試驗結(jié)果分析

2．6 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶曲線

采用上述優(yōu)化的固態(tài)培養(yǎng)基進(jìn)行黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶的研究，測定不同發(fā)酵時間黑曲霉產(chǎn)柚苷酶的酶活，得到了黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶曲線，結(jié)果如圖5所示．從圖5可以看出，黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶在發(fā)酵開始階段隨著菌體的不斷生長，柚苷酶酶活不斷增加，在144h達(dá)到最高，且最高酶活為1248．0U／g．達(dá)到最高酶活之后，隨著發(fā)酵過程中營養(yǎng)物質(zhì)的消耗及代謝產(chǎn)物的積累，菌體生長受到抑制以及部分酶被降解，導(dǎo)致了柚苷酶酶活性的下降．

圖5　黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶曲線

3 結(jié)論

實驗以固態(tài)基礎(chǔ)培養(yǎng)基為發(fā)酵初始培養(yǎng)基，采用黑曲霉固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)柚苷酶．首先，通過單因素實驗確定了影響黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶的主要培養(yǎng)基組成．再通過正交試驗初步確定了黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶最優(yōu)培養(yǎng)基組成為：在500mL三角瓶中，麩皮與柚皮粉的加入總質(zhì)量為5．5g，其中，柚皮粉的加入量為2．0g，培養(yǎng)基固液比為1∶2．5，（NH4）2SO4加入量為0．5g，MgSO4加入量為0．03g．通過優(yōu)化后的培養(yǎng)基進(jìn)行固態(tài)產(chǎn)柚苷酶發(fā)酵曲線的研究，在發(fā)酵144h時酶活達(dá)到最大為1248．0U／g，比優(yōu)化前的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（377．6U／g）提高了2．3倍．該結(jié)果為工業(yè)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶提供了依據(jù)．

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Medium optimization of naringinase production by Aspergillus niger in solid state fermentation

QIAN Wei1，HUANG Yuan－jie1，WANG Xian－feng1，GAO Qian－kun1，MENG Na1，2，WEI Sheng－h(huán)ua1，2＊
（1．College of Biological and Chemical Engineering，Anhui Polytechnic University，Wuhu 241000，China；2．Anhui Engineering Technology Research Center of Microbial Fermentation，Anhui Polytechnic University，Wuhu 241000，China）

Abstract：Naringinase was produced by solid fermentation of Aspergillus niger and the fermentation medium was optimized by single factor experiments and orthogonal test as follows：in 500mL erlenmeyer flask，total 5．5g of bran and pomelo peel powder was used，the amount of pomelo peel powder was 2．0g，the ratio of solid and liquid was 1∶2．5，0．5g of ammonium sulphate was used as the best nitrogen source，and 0．03g of magnesium sulphate was used as the best inorganic salt．Under the optimized conditions，the fermentation activity of naringinase reached maximum 1248．0U／g at 144h，which increased by 230%compared with the initial level（377．6U／g）．

Key words：Aspergillus niger；naringinase；solid－state fermentation；optimization of the fermentation medium

基金項目：國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃基金資助項目（201310363075）

作者簡介：錢 偉（1989－），男，安徽無為人，碩士研究生．

收稿日期：2016－01－10

文章編號：1672－2477（2016）01－0016－05

中圖分類號：Q815

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A