頭花蓼對幽門螺桿菌生長及代謝相關(guān)基因的影響*＊?

任艷君，莫　非，張　姝，何　蕓，吳　瓊，謝小琴，趙書琴

(貴州醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗教研室，貴州貴陽　550004)

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頭花蓼對幽門螺桿菌生長及代謝相關(guān)基因的影響*＊?

任艷君，莫非＊＊，張姝，何蕓，吳瓊，謝小琴，趙書琴

(貴州醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗教研室，貴州貴陽550004)

［摘要］目的:觀察苗藥頭花蓼對幽門螺桿菌(H.pylori)生長代謝及其相關(guān)基因的表達的影響。方法:將H.pylori菌接種于不同濃度的頭花蓼培養(yǎng)基(頭花蓼終濃度分別為64、32、16、8、4、2、1及0.5 g/L)，測定無H.pylori菌生長時頭花蓼的最小抑菌濃度(MIC) ;將H.pylori菌接種于無頭花蓼培養(yǎng)基(對照組)和頭花蓼MIC培養(yǎng)基(頭花蓼組)培養(yǎng)36 h，每隔4 h采用用酶標儀檢測590 nm處的吸光度值，繪制H.pylori生長曲線;用實時熒光定量PCR(Real-Time PCR)檢測2組H.pylori菌液生長代謝相關(guān)基因FrdA、FrdB、HyuA及Pfr的表達水平。結(jié)果:頭花蓼對H.pylori最低抑菌濃度MIC為4 g/L，頭花蓼組H.pylori生長曲線位于對照組之下，Real－time PCR結(jié)果顯示頭花蓼作用后，頭花蓼組生長代謝相關(guān)基因FrdA、FrdB、HyuA及Pfr基因mRNA均呈減弱趨勢，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論:頭花蓼在體外對H.pylori具有明顯抑制作用，可通過影響細菌生長代謝相關(guān)基因的表達來抑制H.pylori的生長。

［關(guān)鍵詞］螺桿菌，幽門;生長;頭花蓼;代謝;基因

＊＊通信作者E-mail: 354406804@ qq.com

網(wǎng)絡(luò)出版時間: 2016－02－23網(wǎng)絡(luò)出版地址: http: / /www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160223.2009.032.html

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori.H.pylori)是革蘭陰性的微需氧細菌，能定植在人胃黏膜表面，可誘發(fā)多種胃部疾病［1］。95 %～100 %的十二指腸潰瘍患者及80 %的慢性胃炎患者與H.pylori感染有密切的關(guān)系，其感染程度與癥狀嚴重程度成正相關(guān)［2］。在抗H.pylori治療中，由于抗生素的濫用，耐藥問題日益突出［3］，尋找新的治療藥物尤為重要。苗藥頭花蓼為貴州特有，研究表明頭花蓼對多種細菌具有良好的抗菌效果［4］。本課題以頭花蓼為研究對象，觀察其對H.pylori生長代謝相關(guān)基因延胡索酸還原酶鐵硫亞基(FrdB)、延胡索酸還原酶黃素蛋白亞基(FrdA)、非血紅素鐵蛋白(Pfr)及乙酰脲利用蛋白A(HyuA)表達水平的影響，觀察苗藥頭花蓼是否可影響H.pylori的生長周期，探討頭花蓼對H.pylori的抑菌機制。

1　材料與方法

1.1主要材料

H.pylori(ATCC700392)國際標準測序株購自美國菌種保藏中心，哥倫比亞瓊脂粉(CM0331B)和腦心浸液粉(CM0225)購自O(shè)XOID，無菌脫纖維羊血購于廣州蕊特生物科技有限公司。苗藥頭花蓼浸膏(13143)由原國家藥檢局新藥審評中心研究員王子厚教授提供。

1.2培養(yǎng)基的制備

1.2.1配制哥倫比亞血瓊脂稱取稱取哥倫比亞血瓊脂粉3.8 g，加入蒸餾水89 mL，121℃高壓滅菌15 min，待瓊脂冷卻至50～55℃時加入無菌脫纖維羊血10 mL、混合抗生素溶液(萬古霉素30 mg、多黏菌素B 20 mg、兩性霉素20 mg及TMP 25 mg，混合溶解于無菌雙蒸水100 mL。) 1 mL，充分混勻，傾倒于直徑為90 mm的無菌平皿中，使瓊脂厚度為3～4 mm，隨機取一板置于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h做無菌試驗，其余放入4℃冰箱備用。

1.2.2配制液體培養(yǎng)基稱取腦心浸液粉3.8 g，用無菌雙蒸水90 mL將其溶解，121℃高壓滅菌15 min，冷卻后加入胎牛血清10 mL，分裝于無菌離心管中，置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3配制含藥培養(yǎng)基稱取頭花蓼64 g于無菌蒸餾水100 mL中，配成濃度為640 g/L的頭花蓼溶液。于哥倫比亞血瓊脂中加入遞減體積的頭花蓼溶液，輕搖混勻，制備成不同濃度的含藥培養(yǎng)基，使其終濃度分別為64、32、16、8、4、2、1及0.5 g/L。

1.3測定頭花蓼最小抑菌濃度

采用三氣培養(yǎng)箱，微需氧環(huán)境(37℃、5% CO2、10% O2、85% N2)培養(yǎng)H.pylori 48～72 h，陽性且無其它菌污染者進行傳代增菌，并通過觀察其菌落形態(tài)，尿素酶、觸酶、氧化酶試驗以及革蘭染色進行菌株鑒定［5］;參照NCCLS標準，采用二倍瓊脂稀釋法［6］，刮取培養(yǎng)48～72 h的H.pylori接種于液體培養(yǎng)基中，將其稀釋至1×1011cfu/L，用無菌棉簽蘸取菌液均勻接種于不同終濃度的含藥培養(yǎng)基上，于37℃三氣培養(yǎng)箱中微需氧環(huán)境中培養(yǎng)72 h后觀察結(jié)果，以無H.pylori菌生長的最小的頭花蓼藥物濃度為最小抑菌濃度(MIC)。

1.4繪制H.pylori生長曲線

取生長于哥倫比亞血瓊脂上的H.pylori菌接種于液體培養(yǎng)基，用液體培養(yǎng)基稀釋至含菌量為1011～1012cfu/ L的菌懸液。參照文獻［7］方法，取10個無菌24孔板，每個板設(shè)置頭花蓼組及對照組，頭花蓼組依次加入液體培養(yǎng)基、5% H.pylori菌懸液、相應(yīng)體積的頭花蓼溶液至其終濃度為MIC，對照組加入等體積的5% H.pylori菌懸液，用液體培養(yǎng)基定容至300 μL，每個組設(shè)置3個重復(fù)孔。瞬時離心混勻后置于37℃微需氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h。以液體培養(yǎng)基調(diào)零，每隔4 h取出一個24孔板用酶標儀測其各個孔在590 nm處的吸光度值。根據(jù)3次重復(fù)實驗數(shù)據(jù)求得OD590平均值，繪制H.pylori的生長曲線。

1.5檢測生長代謝相關(guān)基因mRNA

采用Trizol法分別提取頭花蓼組及對照組H.pylori的mRNA，用酶標儀對提取的mRNA進行測定，計算OD260/OD280比值和mRNA濃度。將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將gryB設(shè)為內(nèi)參基因，F(xiàn)rdA、FrdB、HyuA、Pfr為目的基因。探針和序列由NCBI檢索，根據(jù)GenBank上已發(fā)表的序列，采用primer 5設(shè)計引物(表1)。反應(yīng)條件為95℃30 s，95℃5 s，60℃30 s，重復(fù)40個循環(huán)，每組做3個生物重復(fù)。采用2－ΔΔCT法，對目標基因的表達差異進行分析。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.5軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較用q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1　PCR的引物信息Tab.1 Primer information of PCR

2　結(jié)果

2.1 H.pylori生長曲線

頭花蓼組H.pylori生長曲線有明顯變化，細菌在對數(shù)期不能進入正常的生長高峰。頭花蓼組的生長曲線位于對照組之下，表明頭花蓼對H.pylori的生長有抑制作用，且主要抑制其對數(shù)生長期的細菌分裂。見圖1。

圖1　頭花蓼對H.pylori生長的影響Fig.1 Effect of Polygonum capitatum on the growth curve of H.pylori

2.2 mRNA的提取

提取的H.pylori RNA電泳圖譜顯示16sRNA，23sRNA條帶較清晰，亮度為1∶2，且OD260/OD280的比率均在1.8～2.0，表明提取的mRNA完整且無DNA與蛋白污染。

2.3 H.pylori生長代謝相關(guān)基因檢測

熒光定量PCR儀檢測頭花蓼組及對照組中H.pylori生長代謝相關(guān)基因FrdA、FrdB、HyuA、Pfr及內(nèi)參基因gryB的熒光信號Ct值，通過融解曲線分析，結(jié)果顯示FrdA、FrdB、HyuA及Pfr的溶點溫度分別為81.5℃、82.5℃、80.0℃及80.5℃，融解曲線均為單峰，表明PCR擴增為特異性擴增，頭花蓼組H.pylori生長代謝相關(guān)基因FrdA、FrdB、HyuA、Pfr的mRNA表達均低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見圖2。

圖2　頭花蓼組和對照組H.pylori生長代謝相關(guān)基因FrdB、FrdA、HyuA及Pfr表達Fig.2 The expression of FrdB，F(xiàn)rdA，HyuA and Pfr gene in the control group and experiment group

3　討論

目前H.pylori對抗生素的耐藥性日趨嚴重，探索新的理想的抗H.pylori藥物具有重要的現(xiàn)實意義。頭花蓼是一種傳統(tǒng)苗藥，含有沒食子酸、原兒茶酸乙酯、沒食子酸乙酯等11個化合物［8］，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，頭花蓼具有抗炎抗菌的效果，但其相關(guān)機制尚不清楚。本試驗證明，頭花蓼對H.pylori標準株的MIC為4 mg/L，通過與其它抗H.pylori中藥進行比較，H.pylori對頭花蓼的敏感性明顯高于其它中藥(黃芩苷25～200 mg/mL;黃連素12.5 mg/mL)［9］，表明頭花蓼在抗H.pylori方面具有應(yīng)用研究價值。生長曲線可反映微生物的群體生長規(guī)律［10］，通過生長曲線的變化可揭示藥物的抑菌效果，本研究發(fā)現(xiàn)，加入頭花蓼后H.pylori生長曲線發(fā)生了變化，說明頭花蓼中可能某些成份不利于H.pylori生長。

延胡索酸還原酶(FRD)是可將延胡索酸鹽轉(zhuǎn)為琥珀鹽酸的一種酶，是重要的微生物代謝為無氧呼吸的一部分，為H.pylori的無氧呼吸提供能量ATP，革蘭陰性菌及多數(shù)兼性厭氧革蘭陽性菌，都具有這種特性。這種酶含有四個亞基: FrdA、FrdB 、FrdC、FrdD，其中親水性的FrdA和FrdB亞基形成酶催化域，參與能量代謝。本實驗中，藥物作用后的FrdA、FrdB基因表達均下調(diào)，該結(jié)果與國外學(xué)者Haraguchi等［11］研究一致，再次驗證頭花蓼通過影響H.pylori的呼吸鏈而阻止細菌的能量代謝，抑制細菌的生長。此外，非血紅素鐵蛋白(Pfr)［12］、乙酰脲利用蛋白A(HyuA)在細菌的能量代謝中也有重要作用。Pfr是一類不含血紅素但含鐵的蛋白，保證H.pylori在缺乏鐵離子的惡劣環(huán)境中，維持H.pylori的氧化還原代謝和能量代謝。本研究結(jié)果顯示，頭花蓼作用H.pylori后，Pfr基因表達量下調(diào)，提示頭花蓼可通過影響H.pylori對鐵的利用，干擾H.pylori的氧化還原代謝和能量代謝功能，從而抑制了H.pylori的生長; HyuA可水解焦谷氨酸，而亮氨酰胺肽酶(LAP)則由于變構(gòu)作用，具有廣泛的底物特異性，可水解多種氨基酸。這兩種蛋白酶可確保足夠的氨基酸從多肽中釋放。有文獻顯示，抑氨肽酶素b可通過抑制LAP的活性抑制H.pylori的生長［13］。本研究顯示，H.pylori經(jīng)頭花蓼作用后，HyuA基因表達量下調(diào)，提示了頭花蓼通過影響H.pylori氨基酸的代謝，影響了其生長代謝過程。

4　參考文獻

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(2015－08－22收稿，2015－12－31修回)

中文編輯:戚璐;英文編輯:趙毅

Effect of Polygomun capitutam on Helicobacter Pylori Growth Metabolism Associated Gene

REN Yanjun，MO Fei，ZHANG Shu，HE Yun，WU qiong，XIE Xiaoqin，ZHAO Shuqin
(Department of Laboratory Science，Guizhou Medical University，Guiyang 550004，Guizhou，China)

［Abstract］Objective: To observe the effect of Polygonum capitatum on growth metabolism associated genes expression of H.pylori.Methods: H.pylori fungus was inoculated in varied Polygonum capitatum concentration medium (final concentration as 64，32，16，8，4，2，1 and 0.5 g/L) ; testing minimal inhibitory concentration (MIC) of Polygonum capitatum when no H.pylori grows; H.pylori fungus was inoculated in no-Polygonum capitatum (control group) and Polygonum capitatum MIC (Polygonum capitatum group) to cultivate for 36 h，and test Absorbance value of 590 nm in every 4 h by ELIASA; then draw the H.pylori growth curve; real-time fluorescence quantitative PCR was adopted to test expression level of growth metabolism associated genes FrdA，F(xiàn)rdB，HyuA and Pfr both groups H.pylori fungus solution.Results: the min MIC concentration of Polygomun capitutam on H.pylori was 4 g/L，growth curve of Polygomun capitutam H.pylori was below control group; Real-time PCR results showed that after Polygomun capitutam taking effect，growth metabolism associated genes of Polygomun capitutam group，mRNA of FrdA，F(xiàn)rdB，HyuA and Pfr gene were decreasing，differences had statistical significance (P＜0.05).Conclusion: Polygonum capitatum has obvious inhibitory effect on H.pylori in vitro，Polygonum capitatum can inhibit the growth of H.pylori by affecting the growth of growth metabolism related genes.

［Key words］Helicobacter pylori; growth; Polygonum capitatum; metabolism; gene

*［基金項目］貴州省科學(xué)技術(shù)基金［黔科合J字(2014) 2027號］;貴州省科技合作計劃［黔科合LH字(2015) 7417號］;貴州省衛(wèi)生計生委科學(xué)技術(shù)基金(gzwjkj2015－1－1003) ;貴陽市科技局計劃項目［筑科合同(20141001)］

［中圖分類號］R961.1

［文獻標識碼］A

［文章編號］1000-2707(2016) 02-0175-04