兒童華法林藥動(dòng)和藥效相關(guān)基因型頻率和通路富集研究

楊　琳董　辰王慧君　盧宇藍(lán)　周文浩

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兒童華法林藥動(dòng)和藥效相關(guān)基因型頻率和通路富集研究

楊琳1董辰1王慧君盧宇藍(lán)周文浩

摘要目的探討華法林藥動(dòng)和藥效相關(guān)基因位點(diǎn)的人群頻率差異，為華法林藥物基因組學(xué)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。方法利用復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院(我院) 620例全外顯子測(cè)序(WES)數(shù)據(jù)，對(duì)公共數(shù)據(jù)庫中已報(bào)道的華法林藥物相關(guān)位點(diǎn)計(jì)算等位基因頻率。與千人基因組東亞人和歐洲人的等位基因頻率進(jìn)行比較。結(jié)果我院620例WES數(shù)據(jù)共檢測(cè)到27個(gè)藥物相關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)，涉及12個(gè)基因。27個(gè)華法林藥物相關(guān)位點(diǎn)中，3個(gè)位點(diǎn)在這3組人群間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≥0.01) ; 10個(gè)位點(diǎn)在我院WES數(shù)據(jù)與千人基因組東亞人等位基因頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≥0.01)、與千人基因組歐洲人等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01) ; 1個(gè)位點(diǎn)我院WES數(shù)據(jù)與千人基因組東亞人等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)、與千人基因組歐洲人等位基因頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≥0.01) ; 13個(gè)位點(diǎn)在我院WES數(shù)據(jù)與千人基因組東亞人、歐洲人等位基因頻率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論華法林已報(bào)道的藥物相關(guān)位點(diǎn)存在明顯種族差異性，明確其變異為制定華法林個(gè)體化給藥的精準(zhǔn)醫(yī)療提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞藥物基因組學(xué);全外顯子組測(cè)序;千人基因組;種族差異;華法林

作者單位復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院分子診斷中心上海，201102; 1共同第一作者

藥物基因組學(xué)是在藥物遺傳學(xué)基礎(chǔ)上，將分子藥理學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合，研究人群對(duì)藥物產(chǎn)生差異反應(yīng)的學(xué)科［1］。從基因水平揭示個(gè)體間遺傳特征的差異，將基因測(cè)序、遺傳學(xué)統(tǒng)計(jì)和基因表達(dá)分析等方法，運(yùn)用于個(gè)體化用藥和藥物不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)。華法林屬于香豆素類口服抗凝藥物，通過特異性抑制維生素K環(huán)氧化物還原酶(VKOR)的催化反應(yīng)而發(fā)揮抗凝作用［2］。其治療窗狹窄且劑量個(gè)體差異大［3］。華法林的劑量受多重因素(如年齡、性別、藥物、飲食、藥動(dòng)和藥效相關(guān)基因)的影響［4］。目前細(xì)胞色素P450 2C9(CYP2C9)和維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體1 (VKORC1)基因多態(tài)性為華法林藥物基因組學(xué)的研究重點(diǎn)［5，6］。多個(gè)成年人華法林劑量預(yù)測(cè)公式涉及這2個(gè)基因的多態(tài)性位點(diǎn)［3，7，8］。相比于成人，兒科臨床實(shí)踐中對(duì)于個(gè)體化用藥的需求和藥物不良反應(yīng)的預(yù)警更為迫切。

本研究針對(duì)華法林已知藥動(dòng)和藥效相關(guān)基因位點(diǎn)，基于復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院(我院)全外顯子組測(cè)序(WES)數(shù)據(jù)，對(duì)比千人基因組歐洲人數(shù)據(jù)和東亞人數(shù)據(jù)［9］，進(jìn)行相關(guān)基因型頻率比較，并通過藥物相關(guān)基因所屬通路的富集分析，為華法林藥物基因組學(xué)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1　方法

1.1納入標(biāo)準(zhǔn)同意并在我院行WES檢測(cè)的病例。

1.2DNA提取及全外顯子組捕獲采用QIAGEN公司mini blood全血試劑盒及其標(biāo)準(zhǔn)DNA抽提方法提取基因組DNA(gDNA)，用美國(guó)Thermofisher公司生產(chǎn)的NanoDrop紫外分光光度儀測(cè)定樣本的濃度及定量。參照SureSelct Human All Exon試劑盒說明書，基因組DNA經(jīng)過超聲打斷、末端修復(fù)、接頭連接和雜交捕獲。捕獲文庫采用Illumina HiSeq 2000平臺(tái)進(jìn)行序列檢測(cè)。

1.3測(cè)序數(shù)據(jù)初步分析原始圖像文件經(jīng)Illumina base calling Software 1.7進(jìn)行圖像識(shí)別(Base calling)，去除污染及接頭序列處理后。Clean reads采用Burrows-Wheeler Aligner (BWA)軟件v.0.5.9-r16，以人類基因組hg19 (GRCh37)為參考序列進(jìn)行比對(duì)。采用SAMtools軟件v.0.1.16，對(duì)生成的BAM文件進(jìn)行排序、合并和去除重復(fù)。生成初步分析數(shù)據(jù)，包括: reads長(zhǎng)度分析、數(shù)量及總產(chǎn)量、reads比對(duì)到參考序列的總序列在基因組中的覆蓋度(Coverage)與測(cè)序深度(Depth)等。采用GATK軟件v.3.2.2進(jìn)行SNV分析。排除低可信度SNPs:①測(cè)序深度＜4;②對(duì)于一致性的質(zhì)量評(píng)分＜20;③鄰近區(qū)域平均拷貝數(shù)＞2;④與前1個(gè)SNV距離＜5 bp。

1.4已知藥物敏感位點(diǎn)華法林遺傳多態(tài)性位點(diǎn)和藥物不良反應(yīng)的關(guān)聯(lián)注釋來自PharmGKB數(shù)據(jù)庫，來源為數(shù)據(jù)庫人工整理的具有臨床顯著意義的變異-藥物關(guān)聯(lián)對(duì)(Clinical Annotation)。共涉及的變異包括27個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，關(guān)聯(lián)到12個(gè)基因。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法等位基因頻率的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異檢驗(yàn)由R軟件(版本3.2.1)完成。我院WES數(shù)據(jù)和千人基因組數(shù)據(jù)庫東亞人和歐洲人等位基因頻率的比較采用比率檢驗(yàn)(proportion test，對(duì)應(yīng)函數(shù)prop.test() )來獲取P值。所有檢驗(yàn)的P值行Bonferroni矯正(對(duì)應(yīng)函數(shù)p.adjust() )，P＜0.01為2組位點(diǎn)等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

我院620例行WES檢測(cè)病例，男325例，女295例。

2.2華法林藥物相關(guān)位點(diǎn)與千人基因組的比較結(jié)果將華法林藥物相關(guān)位點(diǎn)在我院WES數(shù)據(jù)分別與千人基因組東亞人、歐洲人等位基因頻率進(jìn)行比較。圖1顯示，在27個(gè)位點(diǎn)中，3個(gè)(rs1057910、rs2592551、rs2108622)在這3組人群間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≥0.01) ; 10個(gè)位點(diǎn)(rs1131873、rs1799853、rs699664、rs10509680、rs11150606、rs1800566、rs7196161、rs7294、rs339097、rs8050894)在我院WES數(shù)據(jù)與千人基因組中東亞人等位基因頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≥0.01)、與千人基因組歐洲人等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01) ; 1個(gè)位點(diǎn)(rs7900194)在我院WES數(shù)據(jù)與千人基因組東亞人等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)、與千人基因組歐洲人等位基因頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≥0.01) ; 13個(gè)位點(diǎn)(rs9923231、rs12777823、rs1042580、rs10871454、rs10517、rs61162043、rs1877724、rs12714145、rs2359612、rs2189784、rs2501873、rs3212198、rs4917639)在我院WES數(shù)據(jù)與千人基因組東亞人、歐洲人等位基因頻率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

圖1　華法林藥物相關(guān)位點(diǎn)在我院620例WES、千人基因組亞洲人、歐洲人等位基因頻率比較注　1)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01

2.3華法林藥物相關(guān)位點(diǎn)涉及基因分析與華法林相關(guān)的變異位點(diǎn)分布在12個(gè)基因上，進(jìn)一步研究這些基因在功能上的聯(lián)系。String通路富集分析(http: / /string.embl.de)顯示，共有9個(gè)基因顯著地集中到了5個(gè)生物通路中。其中主要涉及凝血、出血、體液調(diào)節(jié)、創(chuàng)傷及外源性物質(zhì)的代謝(圖2)。

圖2　華法林藥物相關(guān)基因的通路富集示意圖

3　討論

臨床使用的華法林是兩種不同活性的消旋異構(gòu)體的混合物，S型較R型效能強(qiáng)，占全部效應(yīng)的60%～70%［10］。圖3顯示，華法林經(jīng)口服后，在腸道吸收，肝臟代謝。S型由CYP2C9代謝，R型由CYP1A1、CYP1A2和CYP3A4代謝。由于S型華法林的藥理活性更強(qiáng)，且代謝僅依靠CYP2C9通路，所以該基因?qū)τ谌A法林劑量影響較大。CYP2C9基因的多態(tài)性主要取決于編碼區(qū)的SNPs。人類細(xì)胞色素P450等位基因命名委員會(huì)(http: / /www.cypalleles.ki.se/cyp2c9.htm)已經(jīng)命名58種SNPs，分別為CYP2C9* 1～CYP2C9* 58。VKORC1基因編碼的維生素K環(huán)氧化物還原酶(VKOR)是華法林的作用靶點(diǎn)。VKOR催化維生素K從環(huán)氧化物到還原型，還原型維生素K是谷氨?；然?GGCX)的輔助因子，共同作用下可以激活維生素K依賴的凝血因子及蛋白，通過一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)啟動(dòng)血液凝固［5，11］。華法林藥物劑量計(jì)算公式中，主要涉及CYP2C9基因和VKORC1基因。

圖3　華法林代謝示意圖

將華法林藥物相關(guān)位點(diǎn)在我院WES數(shù)據(jù)分別與千人基因組東亞人和歐洲人等位基因頻率進(jìn)行比較。在27個(gè)位點(diǎn)中，3個(gè)位點(diǎn)在這3組人群間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明在不同種族中，這3個(gè)位點(diǎn)的基因頻率較為一致，其中包括rs1057910，該位點(diǎn)即CYP2C9* 3。這3個(gè)位點(diǎn)可能具重要功能而相對(duì)保守性較高。

10個(gè)位點(diǎn)在我院WES數(shù)據(jù)與千人基因組東亞人等位基因頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與千人基因組歐洲人數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明在10個(gè)位點(diǎn)中，東亞人與歐洲人可能存在種族差異。其中包括rs1799853(即CYP2C9* 2)，說明該位點(diǎn)東亞人與歐洲人存在明顯頻率差異。該位點(diǎn)在千人基因組中T等位基因頻率為東亞人群0.001、歐洲人群0.124、我院WES為0; HapMap數(shù)據(jù)庫中亞洲人群HCB及JPT均為0; AoD數(shù)據(jù)庫中高加索人0.17，HapMap數(shù)據(jù)庫中歐洲人0.104。均提示亞洲人T等位基因頻率低于其他人群。因?yàn)樵撐稽c(diǎn)TT基因型提示需要較低的華法林劑量，而東亞人群T等位基因低頻，所以較歐洲人群而言，具有該位點(diǎn)的東亞人群需要較高的華法林劑量。該位點(diǎn)為目前華法林劑量預(yù)測(cè)公式中的常用位點(diǎn)，但該位點(diǎn)頻率在我院WES數(shù)據(jù)及多個(gè)東亞人數(shù)據(jù)中均為0，該位點(diǎn)作為劑量計(jì)算位點(diǎn)對(duì)于亞洲人意義不大，故而，目前的華法林公式在進(jìn)行跨種族人群推廣中應(yīng)特別注意。

僅1個(gè)位點(diǎn)(rs7900194)在我院WES數(shù)據(jù)與千人基因組中東亞人等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與千人基因組歐洲人數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該位點(diǎn)位于基因CYP2C9。該位點(diǎn)在我院WES數(shù)據(jù)中頻率偏低，接近于千人基因組中歐洲人群數(shù)據(jù)，可能是由于樣本量及位點(diǎn)位置有關(guān)。

13個(gè)位點(diǎn)在我院WES數(shù)據(jù)與千人基因組東亞人、歐洲人等位基因頻率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中包括VKORC1基因的rs9923231和rs2359612。rs9923231位點(diǎn)T等位基因頻率在千人基因組東亞人群0.88、歐洲人群0.39、我院WES數(shù)據(jù)為0.66; HapMap數(shù)據(jù)庫東亞人群數(shù)據(jù)HCB為0.94，JPT為0.90，歐洲人為0.40。均提示東亞人T等位基因頻率高于歐洲人群。因?yàn)樵撐稽c(diǎn)AA基因型提示需要較低的華法林劑量，而東亞人群T等位基因高頻，所以較歐洲人群而言，具有該位點(diǎn)的東亞人群需要較低的華法林劑量。rs2359612位點(diǎn)G等位基因頻率千人基因組東亞人群為0.12、歐洲人群0.61、我院WES數(shù)據(jù)為0.026; HapMap數(shù)據(jù)庫中東亞人群HCB為0.058，JPT為0.099，歐洲人為0.60。均提示東亞人G等位基因頻率低于歐洲人群。因?yàn)樵撐稽c(diǎn)AA基因型提示需要較低的華法林劑量，而東亞人群G等位基因低頻，所以較歐洲人群而言，具有該位點(diǎn)的東亞人群需要較低的華法林劑量。但需要注意的是，該位點(diǎn)位置為NM_024006.5: c.283 + 837T＞C，為內(nèi)含子區(qū)域，WES數(shù)據(jù)可能會(huì)受到捕獲區(qū)域設(shè)定的影響，而影響最終的基因型確定。

華法林藥動(dòng)及藥效相關(guān)基因富集分析發(fā)現(xiàn)(圖2)，其中7個(gè)基因富集到了血液凝固和出血生理過程，包括VKORC1、GGCX、HNF4A、STX4、THBD、CYP4F2和CALU; 7個(gè)基因富集到了循環(huán)復(fù)合物形成的生理過程，包括NR1I3、HNF4A、THBO、EPHX1、VKORC1、CALU和NQO1; 3個(gè)基因富集到了藥物代謝生理過程，包括CYP4F2、VKORC1 和CYP2C9; 4個(gè)基因富集到了對(duì)外源刺激反應(yīng)的生理過程，包括CYP4F2、HNF4A、NQO1和CYP2C9。既往的華法林藥物劑量計(jì)算公式中，多涉及CYP2C9和VKORC1基因。但從通路富集中可以發(fā)現(xiàn)，涉及藥物代謝生理過程中，除VKORC1和CYP2C9外，還包括CYP4F2。rs2108622位于CYP4F2基因，該位點(diǎn)等位基因頻率在我院WES數(shù)據(jù)，千人基因組東亞人和歐洲人差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，為高度保守位點(diǎn)。已有研究發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)與華法林劑量存在相關(guān)性［12］。是否應(yīng)該將該位點(diǎn)納入到華法林劑量公式中，有待進(jìn)一步研究。已有多個(gè)研究報(bào)道GGCX基因多態(tài)性與華法林劑量相關(guān)。GGCX涉及參與血液凝固的維生素K依賴蛋白的活性，為參與凝血及華法林作用機(jī)制的重要基因［13］。rs699664位于GGCX基因，該位點(diǎn)我院WES數(shù)據(jù)與千人基因組中東亞人數(shù)據(jù)相似，同歐洲人存在顯著差異。但該位點(diǎn)與華法林劑量相關(guān)文獻(xiàn)多來自東亞，在進(jìn)行劑量相關(guān)公式研究中，應(yīng)考慮到該位點(diǎn)的種族差異性［14，15］。

華法林其處方量可達(dá)人口數(shù)的0.5%～1.5%［10］。華法林的劑量個(gè)體差異性一直是臨床藥理學(xué)的研究熱點(diǎn)。多項(xiàng)研究做出了基于CYP2C9基因的多態(tài)性位點(diǎn)(rs1799853，rs1057910)和VKORC1基因的多態(tài)性位點(diǎn)(rs9923231，rs2359612)的華法林的劑量預(yù)測(cè)公式。但是目前研究多局限于成人，且由于藥物劑量預(yù)測(cè)公式的外推性差，使這些公式都不能直接用于兒科用藥指導(dǎo)。此外，各個(gè)劑量預(yù)測(cè)公式均僅能解釋部分的劑量差異，一方面，可能與華法林藥效影響因素的復(fù)雜性有關(guān)，沒有將主要的影響因素納入其中，如納入預(yù)測(cè)的位點(diǎn)不足等;另一方面，隨著遺傳學(xué)對(duì)種族差異性的深入認(rèn)識(shí)，不同種族中是否應(yīng)納入不同的藥物相關(guān)位點(diǎn)，使用不同的預(yù)測(cè)公式，也值得深入研究。

綜上，目前華法林在兒科的應(yīng)用缺乏可靠的劑量預(yù)測(cè)方法，①需要基于大樣本的華法林藥物位點(diǎn)與療效的相關(guān)性分析;②建立兒科華法林藥效評(píng)估的可行、可靠方法及相關(guān)指標(biāo)參考值范圍;③通過多元線性回歸方程對(duì)華法林抗凝治療的個(gè)體化精準(zhǔn)用藥提供預(yù)測(cè)方法。

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(本文編輯:張崇凡)

Study on the enrichment of warfarin genotype frequency and pathway associated with its pharmacokinetics and drug effect in children

YANG Lin1，DONG Chen1，WANG Hui-jun，LU Yu-lan，ZHOU Wen-hao(Children＇s Hospital of Fudan University，Shanghai 201102，China; 1 Co-first author)
Corresponding Author: LU Yu-lan，E-mail: yulanlu@ fudan.edu.cn; ZHOU Wen-hao，E-mail: zwhchfu@126.com

AbstractObjective The study of pharmacogenomics focused on how mutations of essential enzyme genes would lead to different drug response.It would be of great importance to identify warfarin-response-related variants of the patients before clinical treatment，especially for pediatrics.Methods In this study，the allele frequencies of reported clinically significant warfarinresponse-related variants were evaluated based on 620 WES data collected from Children Hospital of Fudan University.Then the local allele frequencies were compared with public population-based databases，including 1000 Genomes project.Results 27 warfarin-response-related variants that have clinical significance were detected in the 620 WES data that we used.These variants were distributed in 12 genes.There were 27 warfarin-related variants，and the frequency of 3 variants in our data showed no difference with European and East Asian population of 1000 Genome project(P≥0.01)，10 of them showed no difference with East Asian (P≥0.01) but were significantly different from European population (P＜0.01)，1 variant showed no difference with European and different fromh East Asian(P≥0.01)，and 13 variants were different from both population frequency data(P＜0.01).Conclusion Warfarin-response-related variants detected in our database also show population-specificity，which indicates that sufficient genome-wide data preparation are necessary for the personized drug usage and the practice of precise medicine.

Key wordsPharmacogenomics; Whole exome sequencing; 1000 Genome project; Population specificity; Warfarin

(收稿日期:2015-12-30修回日期: 2016-02-01)

通訊作者盧宇藍(lán)，E-mail: yulanlu@ fudan.edu.cn;周文浩，E-mail: zwhchfu@126.com

基金項(xiàng)目市科委/醫(yī)學(xué)領(lǐng)域重點(diǎn)項(xiàng)目子課題，14411950402;上海市衛(wèi)計(jì)委課題:滬衛(wèi)計(jì)科教(2013) 018號(hào)

DOI:10.3969/j.issn.1673-5501.2016.01.009