轉(zhuǎn)雙Bt基因巨霸楊外源基因表達(dá)及抗蟲(chóng)性檢測(cè)1)

趙潔　杜沙沙　邱彤　楊敏生　王進(jìn)茂

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，保定，071000)

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轉(zhuǎn)雙Bt基因巨霸楊外源基因表達(dá)及抗蟲(chóng)性檢測(cè)1)

趙潔杜沙沙邱彤楊敏生王進(jìn)茂

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，保定，071000)

摘要為提高轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)中Bt基因的表達(dá)效率并擴(kuò)大抗蟲(chóng)譜，以同時(shí)轉(zhuǎn)入Cry1Ac和Cry3A基因的轉(zhuǎn)雙Bt基因巨霸楊(Populus deltocdes ‘55/56’×P. deltocdes ‘2KEN8’)株系1年生苗為材料，對(duì)外源基因的表達(dá)和抗蟲(chóng)性進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)PCR檢測(cè)，證明目的基因已被整合到巨霸楊基因組中。利用熒光定量PCR和ELISA技術(shù)檢測(cè)了4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系葉片中Bt基因的轉(zhuǎn)錄豐度和毒蛋白表達(dá)量。結(jié)果表明：不同株系間Bt基因的轉(zhuǎn)錄豐度存在顯著差異，Cry3A基因的轉(zhuǎn)錄豐度顯著高于Cry1Ac基因的轉(zhuǎn)錄豐度；2種Bt毒蛋白表達(dá)量在各株系間存在顯著差異，Cry3A毒蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著高于Cry1Ac毒蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)。各株系對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)美國(guó)白蛾(Hyphantria cunea)幼蟲(chóng)抗蟲(chóng)效果不明顯，且無(wú)顯著差異；對(duì)鞘翅目害蟲(chóng)柳藍(lán)葉甲(Plagiodera versicolora)表現(xiàn)出極高抗蟲(chóng)效果，且均顯著高于轉(zhuǎn)單基因Cry3A 741楊高抗株系CC84，不同株系間存在顯著差異。

關(guān)鍵詞巨霸楊；雙Bt基因；轉(zhuǎn)錄豐度；毒蛋白；抗蟲(chóng)性

分類(lèi)號(hào)S718.43；Q965.9

Exogenous Gene Expression and Insect Resistance Detection of TransgenicPopulusdeltocdes‘55/56’×P.deltocdescv‘2KEN8’ with DoubleBtGene

Zhao Jie, Du Shasha, Qiu Tong, Yang Minsheng, Wang Jinmao

(Agricultural University of Hebei, Baoding 071000, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(3)：47-51.

To improve the efficiency of genetically modified (gm) polar Bt gene expression and expand the insect-resistant spectrum, we chose thePopulusdeltocdes‘55/56’×P.deltocdescv‘2KEN8’ with doubleBtgene ofCry1AcandCry3Aof one-year seedlings as materials, and tested the expression of exogenous genes and insect resistance. The purpose gene was integrated into the genome in theP.deltocdes‘55/56’×P.deltocdescv‘2KEN8’ by PCR identification. We used the fluorescent quantitative PCR technique and ELISA to detect the four gm strains transcription abundanceBttoxic protein gene expression content in the leaves. The difference existed between the twoBtgene transcription abundance in different strains:Cry3Agene transcription abundance was significantly higher thanCry1Ac. Two kinds of Bt toxic protein expression quantity were significantly different between each strain.Cry3Atoxic protein levels in each strain were significantly higher thanCry1Ac. Each strains’ insect-resistant effect to lepidoptera pests, larvae (Hyphantriacunea) was not obvious with no significant difference between different strains. The strains showed very high insect-resistant effect to coleoptera pests (Plagioderaversicolora), and were significantly higher than that of single geneCry3Apoplars high strain CC84, and there was significant difference between different strains.

KeywordsPopulus deltocdes ‘55/56’×P. deltocdescv ‘2KEN8’; Double Bt gene; Transcript abundance; Toxic protein; Insect resistance

楊樹(shù)栽培歷史悠久，用途廣泛，但是近年來(lái)蟲(chóng)害嚴(yán)重，給農(nóng)林業(yè)造成巨大損失，使用傳統(tǒng)的化學(xué)防治消滅害蟲(chóng)，雖可一時(shí)緩解蟲(chóng)害，但是會(huì)造成環(huán)境污染。利用植物基因工程可以將殺蟲(chóng)蛋白基因轉(zhuǎn)入植物，使植物獲得抗蟲(chóng)性。甄志先等將BtCry3A基因轉(zhuǎn)入741楊，獲得的轉(zhuǎn)基因株系對(duì)鞘翅目害蟲(chóng)的致死率很低，但是對(duì)幼蟲(chóng)的發(fā)育起到了明顯的抑制作用[1]。王穎等將部分改造的Cry1Ac基因與慈菇蛋白酶抑制劑(API)基因構(gòu)建的載體導(dǎo)入三倍體毛白楊，獲得的轉(zhuǎn)基因植株明顯抑制了鱗翅目幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育，且不同轉(zhuǎn)基因株系飼養(yǎng)的幼蟲(chóng)，其生長(zhǎng)發(fā)育存在顯著差異[2]。隨著害蟲(chóng)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)生耐受性及抗性有了越來(lái)越多報(bào)道之后，科研工作者將2個(gè)或多個(gè)不同的抗性基因?qū)胪恢参镏?，通過(guò)基因疊加的方法使昆蟲(chóng)難以對(duì)2種或2種以上的抗蟲(chóng)物質(zhì)同時(shí)產(chǎn)生抗性，以延緩抗性的產(chǎn)生[3-6]。王桂英等在田穎川的基礎(chǔ)上將Cry3A基因?qū)胍艳D(zhuǎn)Cry1Ac+API基因的741毛白楊高抗蟲(chóng)株系Pb29中，成功獲得轉(zhuǎn)雙Bt基因的741楊，有效地發(fā)揮了基因的疊加效應(yīng)，使高抗株系具有了更高的抗蟲(chóng)能力[7-9]。

多基因轉(zhuǎn)化克服了單個(gè)目的基因逐個(gè)重復(fù)導(dǎo)入受體植株的問(wèn)題，大大減少了組織培養(yǎng)、遺傳轉(zhuǎn)化和DNA提取的工作量，縮短了轉(zhuǎn)化周期[10]。本試驗(yàn)將Cry1Ac和Cry3A兩種Bt基因構(gòu)建在植物轉(zhuǎn)化載體上，轉(zhuǎn)化美洲黑楊雜交品種巨霸楊(Populusdeltocdes‘55/56’×P.deltocdes‘2KEN8’)，獲得轉(zhuǎn)基因株系，比較分析獲得的轉(zhuǎn)基因株系Bt基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)差異，探索影響雙Bt基因表達(dá)的因素，為楊樹(shù)多基因遺傳轉(zhuǎn)化提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

轉(zhuǎn)雙Bt基因巨霸楊株系。植物表達(dá)載體為p71A68Y71，結(jié)構(gòu)如圖1，攜帶2個(gè)抗蟲(chóng)Bt基因Cry1Ac(GenBank accession:AF148644)和Cry3A(GenBank accession:M84650)，選擇標(biāo)記基因?yàn)閷?duì)卡那霉素具有抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(nptII)，目的基因Cry1Ac在Cry3A前端，Cry1Ac基因啟動(dòng)子為CaMV35S啟動(dòng)子，Cry3A基因啟動(dòng)子為CoYMV。且在目的基因兩側(cè)加入了來(lái)自煙草的MAR結(jié)構(gòu)，MAR結(jié)構(gòu)為一段環(huán)狀堿基序列，可以增強(qiáng)基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)基因受體巨霸楊雜交組合為Populusdeltocdes‘55/56’×P.deltocdes‘2KEN8’，是由中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院培育的優(yōu)良楊樹(shù)雜交新品種。試驗(yàn)的對(duì)照材料為未轉(zhuǎn)基因巨霸楊和轉(zhuǎn)Cry3A基因741楊高抗蟲(chóng)性株系CC84[11]。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將雙Bt基因一次性轉(zhuǎn)入巨霸楊楊葉盤(pán)中，通過(guò)卡那霉素篩選獲得轉(zhuǎn)化植株。

圖1　p71A68Y711(8 400 bp)的結(jié)構(gòu)

1.2測(cè)試?yán)ハx(chóng)

參試?yán)ハx(chóng)為柳藍(lán)葉甲(Plagioderaversicolora)幼蟲(chóng)和美國(guó)白蛾(Hyphantriacunea)幼蟲(chóng)。

1.3轉(zhuǎn)基因株系的PCR檢測(cè)

從苗圃中采集1年生轉(zhuǎn)基因苗木葉片，采用改良的CTAB法提取巨霸楊株系及對(duì)照植株嫩葉的基因組DNA[12]。以基因組DNA為模板，分別用Cry1Ac和Cry3A基因的正反引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。以農(nóng)桿菌中含雙Bt基因的質(zhì)粒做陽(yáng)性對(duì)照(菌落PCR)，陰性對(duì)照為未經(jīng)轉(zhuǎn)化的普通巨霸楊。檢測(cè)Cry1Ac基因的引物為5′-ATGGATAACAATCCGAACATCA-3′(F1)；5′-CCACCTTTGTCCAAACACTGAA-3′(R1)，擴(kuò)增片段大小為546 bp。檢測(cè)Cry3A基因的引物為5′-CACTGTTCCCACTGTACGATGT-3′(F2)；5′-ATGTTGAAGAAGTCCACGCTCT-3′(R2)，擴(kuò)增片段大小為667 bp。Cry1Ac基因的PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性50 s，50 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min；25 ℃ 1 min。Cry3A基因的PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性50 s，50 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR儀購(gòu)于Bio-RAD Chromo4公司。

1.4轉(zhuǎn)基因株系的熒光定量PCR檢測(cè)

2013年8月從苗圃中栽植的1年苗木中，隨機(jī)選擇各轉(zhuǎn)基因株系和對(duì)照各3株，采集苗木上部完全展開(kāi)的葉片，立即放入液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室。取葉片100 mg放入研缽中，加液氮迅速研成粉末，采用賽勒生物公司超純RNA提取試劑盒EASYEx PLUS Plant RNA Kit，按照說(shuō)明書(shū)流程提取葉片總RNA。之后，采用北京艾德萊公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒TUREscript 1st Strand cDNA Synthsis Kit 進(jìn)行cDNA第1鏈的反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)從NCBI中查找的目的基因的全序列信息設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物。以上述反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，采用2×Sybr Green qPCR Mix進(jìn)行熒光定量PCR。Cry1Ac基因熒光定量PCR引物為5′-GAATTTTTGGTCCCTCTCAAT-3′(F1)；5′-AGGATCTGCTTCCCACTCTCT-3′(R1)。Cry3A基因熒光定量PCR引物為5′-TGGGGATACGAGAAGGAGGAT-3′(F2)；5′-AGTGGGAACAGTGCGATGAGA-3′(R2)。用已知片段大小的含Cry1Ac和Cry3A的質(zhì)粒DNA為標(biāo)準(zhǔn)品，按照10倍梯度稀釋，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)每個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(Ct值)，以及利用已知表達(dá)量的標(biāo)準(zhǔn)品做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出以mRNA為轉(zhuǎn)錄本合成的cDNA中Bt基因的豐度。

1.5轉(zhuǎn)基因株系的ELISA檢測(cè)

8月份從苗圃中栽植的1年苗木中，隨機(jī)選擇各轉(zhuǎn)基因株系和對(duì)照各3株，采集苗木上部完全展開(kāi)的葉片，用于Bt蛋白檢測(cè)。檢測(cè)Cry1Ac蛋白用美國(guó)Agdia公司的Bt-Cry1Ab/1AcELISA蛋白檢測(cè)試劑盒；檢測(cè)Cry3A蛋白用Agdia公司的Bt-Cry3AELISA蛋白檢測(cè)試劑盒，陽(yáng)性對(duì)照為試劑盒自帶，陰性對(duì)照為非轉(zhuǎn)基因巨霸楊。檢測(cè)過(guò)程參照試劑盒的說(shuō)明及牛小云等的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行，用BioRad 550型酶標(biāo)儀測(cè)定結(jié)果[13]。以每克新鮮葉片所含毒蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)算毒蛋白含量。

1.6轉(zhuǎn)基因株系的飼蟲(chóng)試驗(yàn)

檢測(cè)Cry1Ac毒蛋白抗蟲(chóng)性所用昆蟲(chóng)為美國(guó)白蛾初孵的1齡幼蟲(chóng)。2013年7月初從河北農(nóng)業(yè)大學(xué)苗圃采集美國(guó)白蛾卵塊，在溫室內(nèi)孵化的1齡幼蟲(chóng)直接用于飼蟲(chóng)試驗(yàn)。

檢測(cè)Cry3A毒蛋白抗蟲(chóng)性所用昆蟲(chóng)為柳藍(lán)葉甲的1齡、2齡、3齡幼蟲(chóng)。2013年4月底從河北農(nóng)業(yè)大學(xué)苗圃采集柳藍(lán)葉甲成蟲(chóng)，置于室溫下培養(yǎng)，每天換取新鮮幼嫩的非轉(zhuǎn)基因巨霸楊葉片。每天收集蟲(chóng)卵進(jìn)行培養(yǎng)，用非轉(zhuǎn)基因?qū)φ诊曃褂紫x(chóng)，3d后得到柳藍(lán)葉甲初孵的1齡幼蟲(chóng)，并培養(yǎng)至2齡、3齡用于試驗(yàn)。

從苗圃中采集各轉(zhuǎn)基因株系和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ债?dāng)年生苗木新鮮葉片，將葉柄插入濕潤(rùn)的花泥塊中，以保持葉片新鮮。將測(cè)試?yán)ハx(chóng)輕輕均勻地放到葉片上，然后放置于小燒杯中，杯口用雙層濕潤(rùn)紗布覆蓋并綁好。再將小燒杯放置于塑料袋中，輕松綁縛，保持濕度和透氣。每個(gè)株系設(shè)置3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1瓶，放置30頭幼蟲(chóng)。每天換取新鮮葉片，記錄測(cè)試幼蟲(chóng)的死亡數(shù)，及存活幼蟲(chóng)的平均體質(zhì)量、體長(zhǎng)，至幼蟲(chóng)的數(shù)量穩(wěn)定或是全部死亡，停止試驗(yàn)。

校正死亡率公式為：校正死亡率=(轉(zhuǎn)基因株系死亡率-對(duì)照死亡率)/(1-對(duì)照死亡率)

1.7數(shù)據(jù)分析

采用Excel軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，利用SPSS 13.0軟件進(jìn)行方差分析及多重比較。

2結(jié)果與分析

2.1轉(zhuǎn)基因株系的PCR檢測(cè)

采用2個(gè)Bt基因的特異性引物，對(duì)初步獲得的4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以含有雙Bt基因質(zhì)粒和非轉(zhuǎn)基因巨霸楊植株為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，在獲得的4株轉(zhuǎn)基因巨霸楊中均檢測(cè)到Cry1Ac和Cry3A基因，如圖2所示。PCR擴(kuò)增結(jié)果初步確定目的基因已整合到巨霸楊基因組中。

圖2　外源基因的PCR檢測(cè)

2.2轉(zhuǎn)基因株系熒光定量PCR擴(kuò)增

利用熒光信號(hào)積累對(duì)整個(gè)PCR進(jìn)程實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)表明，4個(gè)株系均檢測(cè)到了Cry1Ac和Cry3A熒光信號(hào)的表達(dá)。對(duì)照沒(méi)有雙Bt基因的熒光擴(kuò)增信號(hào)，轉(zhuǎn)單Cry3A株系CC84只檢測(cè)到Cry3A基因的熒光信號(hào)表達(dá)。由表1可以看出，Cry1Ac基因的轉(zhuǎn)錄豐度為7.50×103～8.38×103，Cry3A基因的轉(zhuǎn)錄豐度為3.80×105～5.15×106。Cry3A基因的轉(zhuǎn)錄豐度顯著高于Cry1Ac基因的轉(zhuǎn)錄豐度。統(tǒng)計(jì)分析表明，Cry1Ac基因的轉(zhuǎn)錄豐度均很低，且不同株系之間無(wú)顯著差異；Cry3A基因轉(zhuǎn)錄豐度在不同株系之間存在顯著差異，No.1株系轉(zhuǎn)錄豐度最高。

表1　熒光定量PCR檢測(cè)Cry1Ac和Cry3A基因的轉(zhuǎn)錄豐度

注：同列數(shù)據(jù)后字母不同表示差異顯著(P<0.05)；轉(zhuǎn)錄豐度指每微克RNA中所含拷貝數(shù)。

2.3轉(zhuǎn)基因株系Bt毒蛋白的ELISA檢測(cè)

ELISA檢測(cè)2種Bt毒蛋白結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，Cry1Ac毒蛋白在各轉(zhuǎn)基因株系中均表達(dá)量極低，僅為0.13～0.33 ng·g-1。各轉(zhuǎn)基因株系之間存在顯著差異，No.3和No.2株系毒蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高。Cry3A毒蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)均極顯著高于Cry1Ac毒蛋白，為35.78～236.91 μg·g-1。各轉(zhuǎn)基因株系之間存在顯著差異，No.1株系毒蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高。

表2　各株系的Cry1Ac和Cry3A毒蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，同列數(shù)據(jù)后字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.4轉(zhuǎn)基因株系對(duì)美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)抗性檢測(cè)

用轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株葉片飼喂美國(guó)白蛾1齡幼蟲(chóng)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因葉片對(duì)幼蟲(chóng)的致死率很低，與對(duì)照無(wú)顯著差異。對(duì)各株系葉片飼養(yǎng)4 d的美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)分別稱量蟲(chóng)體長(zhǎng)和蟲(chóng)體質(zhì)量如表3所示。統(tǒng)計(jì)分析表明，不同株系之間及與對(duì)照之間，在蟲(chóng)體質(zhì)量和蟲(chóng)體長(zhǎng)性狀上均無(wú)顯著差異，表明轉(zhuǎn)基因植株Cry1Ac毒蛋白表達(dá)量低，抗蟲(chóng)效果不明顯。

表3　轉(zhuǎn)基因株系對(duì)美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)發(fā)育的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2.5轉(zhuǎn)基因株系對(duì)柳藍(lán)葉甲抗性檢測(cè)

2.5.1對(duì)柳藍(lán)葉甲幼蟲(chóng)致死效果

表4結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株對(duì)柳藍(lán)葉甲幼蟲(chóng)的致死效果非常顯著，幾乎所有株系對(duì)1齡幼蟲(chóng)的致死率均達(dá)到100%。隨著幼蟲(chóng)的發(fā)育，轉(zhuǎn)基因植株的致死率逐漸下降，各株系對(duì)2齡幼蟲(chóng)的致死率為93.3%～100.0%，對(duì)3齡幼蟲(chóng)致死率下降為52.22%～94.44%。不同轉(zhuǎn)基因株系間對(duì)柳藍(lán)葉甲幼蟲(chóng)致死率存在顯著差異，主要表現(xiàn)在對(duì)3齡幼蟲(chóng)的致死效果上。No.1和No.4株系的致死效果最好，這2個(gè)株系對(duì)3齡幼蟲(chóng)致死率仍保持在90%以上。各株系對(duì)柳藍(lán)葉甲幼蟲(chóng)的致死效果與Cry3A毒蛋白的表達(dá)量基本一致，毒蛋白表達(dá)量高的抗蟲(chóng)效果好。各轉(zhuǎn)基因株系的抗蟲(chóng)效果均顯著高于單轉(zhuǎn)Cry3A基因的陽(yáng)性對(duì)照株系CC84。

2.5.2對(duì)柳藍(lán)葉甲成蟲(chóng)致死效果

柳藍(lán)葉甲的成蟲(chóng)對(duì)轉(zhuǎn)基因巨霸楊的抗性高于幼

蟲(chóng)，且不同轉(zhuǎn)基因株系間抗蟲(chóng)性間存在差異。隨著蟲(chóng)試時(shí)間的推移，成蟲(chóng)死亡率逐漸增加(圖3)。飼養(yǎng)第2天，各株系死亡率最高，為40.5%；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各轉(zhuǎn)基因株系死亡率也逐漸延長(zhǎng)，No.3的成蟲(chóng)死亡率一直較低，蟲(chóng)試第8天，死亡率只有15.4%，其余株系在蟲(chóng)試第8天的死亡率均達(dá)到80%；其中No.1的死亡率最高，在蟲(chóng)試第6天死亡率為80%，第8天死亡率達(dá)到95.8%。蟲(chóng)試第2天開(kāi)始，用非轉(zhuǎn)基因巨霸楊葉片飼喂的柳藍(lán)葉甲開(kāi)始產(chǎn)卵，而用轉(zhuǎn)基因巨霸楊葉片飼喂的柳藍(lán)葉甲均未產(chǎn)卵，且死亡率逐漸增大(圖4)。

表4不同轉(zhuǎn)基因株系對(duì)柳藍(lán)葉甲幼蟲(chóng)致死效果

%

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，同列數(shù)據(jù)后字母不同表示顯著差異(P<0.05)。

圖3　轉(zhuǎn)基因不同株系上柳藍(lán)葉甲成蟲(chóng)的死亡率

圖4　柳藍(lán)葉甲成蟲(chóng)取食葉片2d的情況

3討論

Bt毒蛋白基因是楊樹(shù)轉(zhuǎn)基因中應(yīng)用最廣也是最有潛力的抗蟲(chóng)基因，目前已構(gòu)建了多種攜帶不同類(lèi)型Bt基因的轉(zhuǎn)化載體[14]。Cry1Ac基因和Cry3A基因是楊樹(shù)抗蟲(chóng)基因工程研究中常用的Bt基因，已成功導(dǎo)入不同楊樹(shù)品種，并且各轉(zhuǎn)基因株系表達(dá)出抗蟲(chóng)性[15-17]。轉(zhuǎn)Cry1Ac基因楊樹(shù)對(duì)美國(guó)白蛾等鱗翅目害蟲(chóng)具有高抗蟲(chóng)性，而轉(zhuǎn)Cry3A基因楊樹(shù)對(duì)柳藍(lán)葉甲等鞘翅目害蟲(chóng)也具有高抗蟲(chóng)性，對(duì)1齡幼蟲(chóng)致死率分別達(dá)到85%、100%以上[18-19]，并能明顯抑制楊樹(shù)重要蛀干害蟲(chóng)桑天牛(Aprionagermari)幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育[11]。王彥平等以轉(zhuǎn)Cry3A基因741楊株系和轉(zhuǎn)CrylAc+API雙抗蟲(chóng)基因741楊株系為材料，比較研究了轉(zhuǎn)不同抗蟲(chóng)基因楊樹(shù)對(duì)不同類(lèi)型害蟲(chóng)的抗蟲(chóng)性，證明了轉(zhuǎn)CrylAc+API741楊對(duì)鞘翅目害蟲(chóng)沒(méi)有抗蟲(chóng)性，僅對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)具有抗蟲(chóng)效果，轉(zhuǎn)Cry3A基因741楊也得到了類(lèi)似的結(jié)論[18]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，Cry3A基因毒蛋白表達(dá)量高于CrylAc基因毒蛋白表達(dá)量達(dá)10倍以上。

本研究中，將2個(gè)Bt基因構(gòu)建在一個(gè)載體上，導(dǎo)入楊樹(shù)基因組中，得到的轉(zhuǎn)基因株系中2個(gè)基因的毒蛋白表達(dá)量也存在顯著差異，Cry3A毒蛋白的表達(dá)量比Cry1Ac的毒蛋白表達(dá)量高104～105倍。在抗蟲(chóng)性檢測(cè)中，對(duì)柳藍(lán)葉甲致死率極高，且高于轉(zhuǎn)Cry3A單基因的高抗株系CC84，而對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)無(wú)抗蟲(chóng)效果，與對(duì)照無(wú)差異，說(shuō)明Cry1Ac基因基本未表達(dá)。在過(guò)去的研究中，通過(guò)二次轉(zhuǎn)化法將這2個(gè)Bt基因分別插入到植物基因組不同位置，均能高效表達(dá)[8]。本研究中，2個(gè)基因的表達(dá)量存在顯著差異，可能原因是：2個(gè)基因具有較高的同源性，出現(xiàn)干擾引起了基因間互作，使得其中一個(gè)基因抑制了另一個(gè)基因。另外，目的基因的排列順序也影響了基因的表達(dá)量。在轉(zhuǎn)化載體中，Cry3A基因靠近T-DNA左邊界(LB)，Cry1Ac基因位于右邊界(RB)。根據(jù)在煙草上的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將這2個(gè)Bt基因同時(shí)構(gòu)建在1個(gè)轉(zhuǎn)化載體上時(shí)，無(wú)論是Cry3A基因還是Cry1Ac基因，靠近T-DNA左邊界的Bt基因表達(dá)效率均高，而靠近右邊界的基因被抑制，這還需要進(jìn)一步深入研究和驗(yàn)證。

在獲得的4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系間Bt基因的毒蛋白表達(dá)量和抗蟲(chóng)性存在明顯差異。No.1株系的Bt基因表達(dá)量較高，其Cry3A毒蛋白表達(dá)量要高出其他株系將近兩倍，抗蟲(chóng)效果也更為顯著。李寶健等的研究證明，在同一轉(zhuǎn)化事件中，不同轉(zhuǎn)基因株系間外源基因的表達(dá)存在差異[4]。這與本試驗(yàn)結(jié)論一致，因此，對(duì)大量轉(zhuǎn)基因株系的篩選，可獲得表達(dá)水平更高的轉(zhuǎn)基因株系。

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收稿日期：2015年3月27日。

第一作者簡(jiǎn)介：趙潔，女，1990年7月生，河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，碩士研究生。E-mail：308801987@qq.com。通信作者：王進(jìn)茂，河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，教授。E-mail：lxwjm@hebau.edu.cn。

1)國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2013AA102703)。

責(zé)任編輯：程紅。