緩釋處理茉莉酸類化合物對(duì)興安落葉松葉內(nèi)防御蛋白活性的誘導(dǎo)效果1)

林健　嚴(yán)善春

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

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緩釋處理茉莉酸類化合物對(duì)興安落葉松葉內(nèi)防御蛋白活性的誘導(dǎo)效果1)

林健嚴(yán)善春

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

摘要外源茉莉酸類化合物能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗蟲性，為了延長(zhǎng)其作用時(shí)間，選取茉莉酸甲酯(MJA)和茉莉酮(ZJ)，將2種化合物倒入緩釋瓶中作為緩釋處理，掛于2年生興安落葉松(Larix gmelinii)苗木中下部；以用2種化合物直接噴施落葉松苗為對(duì)照。測(cè)定落葉松針葉內(nèi)與抗蟲相關(guān)的幾種主要防御蛋白的活力。噴施及用緩釋處理MJA和ZJ后，興安落葉松針葉內(nèi)防御蛋白活性都有顯著地增加(P<0.01)，并且呈現(xiàn)先升高后降低的波動(dòng)變化。緩釋處理的MJA和ZJ對(duì)興安落葉松針葉內(nèi)防御蛋白誘導(dǎo)作用沒有直接噴施處理反應(yīng)迅速，表現(xiàn)為前期誘導(dǎo)效果低于噴施處理，但后期誘導(dǎo)效果好于噴施處理，且緩釋處理誘導(dǎo)效果可以延長(zhǎng)5～15 d。MJA誘導(dǎo)效果強(qiáng)于ZJ。說明外源茉莉酸類化合物對(duì)落葉松抗蟲性的誘導(dǎo)作用，經(jīng)過緩釋處理可以得到延長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞興安落葉松；茉莉酸甲酯；茉莉酮；誘導(dǎo)抗性；緩釋效果；防御蛋白

分類號(hào)S769；S791.222

Induction Effect of Slow-release Exogenous Jasmonic on the Activities of Defense Protein inLarixgmeliniiNeedles

Lin Jian, Yan Shanchun

(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(3)：82-85.

In order to control release of active exogenous jasmonic acid compounds and maintain a certain active duration, exogenous methyl jasmonate signal substances and jasmone were poured into the slow-release bottles, spayed onto 2-year-old larch trees, and the activities of several major defense protein in larch needles were measured to maintain a certain active duration of induced resistance of larch. The activities of defense proteins were increased significantly in the needles ofL.gmeliniiinduced by exogenous jasmonates and slow-release treatments. The variation of their activity was waved in the period of the experimentation. Slow-release bottles with these jasmonates may provide a feasible control release formulation to extend their effective life-span (duration) of enhancing induced resistance of larch for at least five days.

KeywordsLarix gmelinii; Methyl jasmonate; Cis-jasmone; Induced resistance; Slow-release; Defensive protein

茉莉酸(JA)首先是從真菌中分離得到的，人們把具有JA基本結(jié)構(gòu)的一類衍生物統(tǒng)稱為茉莉酸鹽或茉莉酸類化合物(JAs)。JAs在植物界中普遍存在[1]，包括茉莉酸、茉莉酸甲酯(MJA)、茉莉酮(ZJ)、二氫茉莉酸(DHJA)和南瓜子酸(CA)等多種JAs相關(guān)化合物[2-4]。大量的研究表明，JAs是衰老啟動(dòng)物質(zhì)，并在誘導(dǎo)、脅迫、創(chuàng)傷、病蟲害防御等信號(hào)傳導(dǎo)中起著重要的作用[5-7]。

誘導(dǎo)抗性作為一種新的植物抗性類型，在防御植食者的取食和產(chǎn)卵方面具有很大的潛力[8]。由于茉莉酸類化合物有一定的揮發(fā)性，因而應(yīng)用外源茉莉酸類化合物誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗蟲性的方法有2種[9-10]：一種是噴霧法；另一種是暴露法。在植物生長(zhǎng)季節(jié)必要時(shí)間段內(nèi)，要實(shí)現(xiàn)對(duì)植物化學(xué)防御能力的持續(xù)誘導(dǎo)，保持植物抗蟲性，需要對(duì)揮發(fā)性誘導(dǎo)劑茉莉酸類化合物進(jìn)行緩釋處理，以保證在害蟲活躍期誘導(dǎo)劑的持續(xù)有效釋放。

本研究選取2種可以誘導(dǎo)興安落葉松(Larixgmelinii)產(chǎn)生抗蟲性的外源茉莉酸類物質(zhì)茉莉酸甲酯和茉莉酮[11]，為了延長(zhǎng)其作用時(shí)間對(duì)這2種物質(zhì)進(jìn)行緩釋處理，之后施用于興安落葉松，通過比較分析落葉松針葉內(nèi)防御蛋白的時(shí)序變化，測(cè)定其緩釋效果。為利用林木的誘導(dǎo)抗性控制害蟲提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試落葉松苗

2012年4月末，于黑龍江平山森林植物試種苗圃，將2年生的興安落葉松苗1 000株單株栽于塑料桶內(nèi)，自然光照條件下生長(zhǎng)，及時(shí)澆水、施肥、除草，避免人為機(jī)械損傷和病蟲危害。恢復(fù)生長(zhǎng)40 d后，備用。

1.2供試試劑及緩釋處理

將茉莉酸甲酯和茉莉酮各配制成不同濃度，分別裝入緩釋瓶(北京中捷生物公司)中，掛于落葉松苗中下部，分別于1、3、5、10 d后取樣測(cè)定落葉松針葉內(nèi)防御蛋白活性作為預(yù)試驗(yàn)，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，確定每種化合物的合適濃度(表1)，裝瓶緩釋備用。

表1　緩釋茉莉酸類化合物對(duì)興安落葉松苗的處理

1.3興安落葉松苗處理

將裝瓶緩釋的茉莉酸甲酯和茉莉酮懸掛于健康、長(zhǎng)勢(shì)相似的苗木中下部，以瓶裝等量溶劑或在苗木上直接噴施化合物的等量溶劑為對(duì)照，以未做任何處理的苗木作為空白對(duì)照。每組處理100株，詳見表1。每組處理的幼苗之間間隔15 m以上。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)及正式試驗(yàn)結(jié)果，2組溶劑對(duì)照及空白對(duì)照的防御蛋白活性均無顯著差異，因此結(jié)果分析中的對(duì)照均選用空白對(duì)照的數(shù)據(jù)。

1.4落葉松針葉內(nèi)主要防御蛋白活力的測(cè)定

1.4.1樣品的采集

分別于處理后1、3、5、10、15、20、25、30 d采集落葉松針葉。采樣時(shí)，在每樣株自上至下每個(gè)輪枝的不同方位上摘取健康針葉，每處理采集9株，每3株為一個(gè)重復(fù)，重復(fù)3次。每個(gè)重復(fù)摘取針葉鮮質(zhì)量約20 g。將每重復(fù)所采針葉充分混均，放置于夾鏈袋內(nèi)，低溫密封保存，帶回實(shí)驗(yàn)室，冰箱冷凍保存待用。

1.4.2POD、CAT活性

過氧化物酶(POD)活性測(cè)定參照李合生[12]的愈創(chuàng)木酚法，以1 min內(nèi)OD470變化0.01的酶量為1個(gè)酶活力單位(U·g-1·min-1)。過氧化氫酶(CAT)活性測(cè)定參照王晶英等[13]的過氧化氫氧化法，以1 min內(nèi)OD240減少0.1的酶量為1個(gè)酶活力單位(U·g-1·min-1)。

1.4.3PAL、PPO活性

苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性測(cè)定采用苯丙氨酸比色法[14]，以1 min內(nèi)OD290變化0.01為1個(gè)酶活力單位(U·g-1·min-1)。多酚氧化酶(PPO)活性測(cè)定采用咖啡酸比色法[15]，以1 min內(nèi)OD470變化0.01為1個(gè)酶活力單位(U·g-1·min-1)。

1.4.4TI、CI活性

胰蛋白酶抑制劑(TI)、胰凝乳蛋白酶抑制劑(CI)活力測(cè)定參照徐偉[16]的方法，以1 min內(nèi)蛋白酶抑制劑活力降低0.001為1個(gè)酶活力單位(U·g-1·min-1)。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析，差異顯著性檢驗(yàn)采用LSD方法。

2結(jié)果與分析

2.1各處理落葉松針葉內(nèi)保護(hù)性酶活性

由表2可見，噴施MJA誘導(dǎo)后，POD和CAT活性在1～5 d大量增加，5 d時(shí)最大；從第10天開始呈下降的趨勢(shì)，25 d時(shí)與對(duì)照相比無差異，誘導(dǎo)效果可達(dá)20 d以上。用緩釋處理的MJA誘導(dǎo)后，POD活性在1～5 d、CAT活性在1～3 d大量增加，隨后POD、CAT活性維持穩(wěn)定，直到25 d時(shí)與對(duì)照相比差異極顯著(P<0.01)，到30 d時(shí)與對(duì)照相比仍有明顯差異(P<0.05或P<0.01)，誘導(dǎo)效果至少維持30 d。誘導(dǎo)效果，1～5 d噴施處理好于緩釋處理，從15～25 d，緩釋處理好于較噴施處理。噴施ZJ誘導(dǎo)后，POD活性變化與噴施MJA有相似的趨勢(shì)，5 d時(shí)達(dá)到最大，15 d時(shí)與對(duì)照相比無顯著差異，誘導(dǎo)效果可達(dá)10 d以上。CAT活性3 d時(shí)達(dá)到最大，20 d時(shí)與對(duì)照相比無差異，誘導(dǎo)效果可達(dá)15 d以上。用緩釋處理ZJ誘導(dǎo)后，POD活性在1～10 d大量增加，隨后POD活性維持穩(wěn)定，直到20 d時(shí)與對(duì)照相比還有極顯著差異(P<0.01)，誘導(dǎo)效果至少維持20 d；CAT活性在1～15 d大量增加，隨后CAT活性維持穩(wěn)定，直到30 d時(shí)與對(duì)照相比還有顯著差異(P<0.01)，誘導(dǎo)效果至少維持30 d。誘導(dǎo)效果，1～5 d噴施處理好于緩釋處理，15～30 d緩釋處理好于噴施處理。

2.2各處理落葉松針葉內(nèi)防御性酶活性

由表3所見，MJA噴施誘導(dǎo)后，PPO活性在1～10 d大量增加，10 d時(shí)PPO活性達(dá)到最大。從第10天開始PPO活性呈下降的趨勢(shì)，30 d時(shí)與對(duì)照相比無差異，誘導(dǎo)效果可達(dá)25 d以上。PAL活性在1～5 d大量增加，5 d時(shí)PAL活性達(dá)到最大。從第10天開始PAL活性呈下降的趨勢(shì)，25 d時(shí)與對(duì)照相比無差異，誘導(dǎo)效果可達(dá)20 d以上。用MJA緩釋處理誘導(dǎo)后，PPO活性在1～5 d大量增加，隨后PPO活性維持穩(wěn)定，直到30 d時(shí)與對(duì)照相比還有明顯差異(P<0.05)，緩釋誘導(dǎo)效果至少維持30 d；PAL活性在1～10 d大量增加，直到30 d時(shí)與對(duì)照相比還有顯著差異(P<0.01)，誘導(dǎo)效果至少維持30 d。15～30 d，緩釋誘導(dǎo)效果好于噴施處理。噴施ZJ誘導(dǎo)后，PPO活性變化與噴施MJA有相似的趨勢(shì)，3 d時(shí)達(dá)到最大，30 d時(shí)與對(duì)照相比無差異，誘導(dǎo)效果可達(dá)25 d以上。PAL活性10 d時(shí)達(dá)到最大，25 d時(shí)與對(duì)照相比無差異，誘導(dǎo)效果可達(dá)20 d以上。ZJ緩釋處理誘導(dǎo)后，PPO活性在1～5 d大量增加，隨后PPO活性維持穩(wěn)定，直到30 d時(shí)與對(duì)照相比還有明顯差異(P<0.05)，誘導(dǎo)效果至少維持30 d；PAL活性在1～10 d大量增加，隨后PAL活性維持穩(wěn)定，直到30 d時(shí)與對(duì)照相比還有顯著差異(P<0.01)，誘導(dǎo)效果至少維持30 d。5～30 d，緩釋處理誘導(dǎo)效果好于噴施處理。

表2　興安落葉松針葉內(nèi)保護(hù)性酶活性的時(shí)序變化

處理CAT活性/U·g-1·min-11d3d5d10d15d20d25d30dCK2.0hF 1.8hF 2.0hF 1.8hF 2.0hF 1.7hF 1.7hF 2.0hFMJA4.4bcBC5.2abA5.6aA4.8abAB4.0cdCD2.4ghEF2.0hF2.4ghEFZJ3.6deDE4.4bcBC3.2efDE3.2efDE2.8fgEF1.6hF2.0hF2.8ghEFMJAB2.8fgEF4.4bcBC4.4bcBC4.0cdCD4.8abAB4.0cdCD3.2efDE2.8ghEFZJB2.4ghEF3.6deDE3.2efDE2.8fgEF4.0cdCD3.2efDE4.0cdCD3.6deDE

注：表中同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在P=0.05水平差異顯著，不同大寫字母表示在P=0.01水平差異顯著。

表3　興安落葉松針葉內(nèi)防御性酶活性的時(shí)序變化

處理PAL/U·mg-1·min-11d3d5d10d15d20d25d30dCK4.26fD 4.36fD 4.19fD 4.44fD 4.92fD 4.24fD 4.69fD 4.36fD MJA7.19cdBC7.34cdBC9.16aA8.24abAB7.59bcAB5.96efCD4.41fD4.59fDZJ7.44cdBC7.66bcAB7.39cdBC7.84abAB6.54efCD6.17efCD4.60fD4.39fDMJAB7.01cdBC7.13cdBC7.54cdBC7.70bcAB7.43cdBC7.77bcAB7.67bcAB7.73bcABZJB7.23cdBC7.30cdBC7.50cdBC7.67bcAB7.73bcAB6.79deCD6.69deCD6.39deCD

注：表中同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在P=0.05水平差異顯著，不同大寫字母表示在P=0.01水平差異顯著。

2.3各處理落葉松針葉內(nèi)蛋白酶抑制劑活性

由表4可以看出，MJA噴施誘導(dǎo)后，TI和CI活性在1～3 d大量增加，3 d時(shí)TI活性達(dá)到最大，并維持穩(wěn)定。從第15天開始TI開始下降，TI活性在30 d時(shí)、CI活性在25 d與對(duì)照相比無差異，誘導(dǎo)效果可達(dá)25 d或20 d以上。用MJA緩釋處理誘導(dǎo)后，TI和CI活性在1～3 d大量增加，隨后維持穩(wěn)定，直到25 d時(shí)與對(duì)照相比還有顯著差異(P<0.01)，誘導(dǎo)效果至少維持25 d。誘導(dǎo)效果，在1～10 d噴施處理好于緩釋處理;15～30 d，緩釋處理好于噴施處理。噴施ZJ誘導(dǎo)后，TI活性在5 d時(shí)達(dá)到最大，20 d時(shí)與對(duì)照相比無差異，誘導(dǎo)效果可達(dá)15 d以上。CI活性變化與噴施MJA有相似的趨勢(shì)，3 d時(shí)達(dá)到最大，10 d時(shí)與對(duì)照相比無差異，誘導(dǎo)效果可達(dá)5 d以上。用ZJ緩釋處理誘導(dǎo)后，TI活性在1～3 d大量增加，隨后TI活性維持穩(wěn)定，直到25 d時(shí)與對(duì)照相比還有顯著差異(P<0.01)，誘導(dǎo)效果至少維持25 d；CI活性在1～5 d大量增加，隨后CI活性維持穩(wěn)定，直到15 d時(shí)與對(duì)照相比還有顯著差異(P<0.01)，誘導(dǎo)效果至少維持15 d。TI活性在1～5 d、CI活性在1～3 d，噴施處理好于緩釋處理；TI活性在15～30 d、CI活性在5～20 d，緩釋處理好于噴施處理。

表4　興安落葉松針葉內(nèi)蛋白酶抑制劑活性的時(shí)序變化

處理CI活性/U·mg-1·min-11d3d5d10d15d20d25d30dCK67.29fgFG76.63fgFG76.63fgFG80.37fgFG72.89fgFG76.63fgFG84.11fgFG87.85fgFGMJA181.30bcBC241.11aA244.85aA237.37aA138.31cdD117.75cdDE80.37fgFG91.59efFZJ115.88cdDE138.31cdD106.54cdDE80.37fgFG72.89fgFG69.16fgFG78.50fgFG65.42fgFGMJAB136.44cdD205.60abB199.99abB201.86abB194.39abB211.21abB128.97cdD95.32efFZJB87.85efF102.80efEF114.01cdDE110.28cdDE100.93efEF74.76fgFG71.03fgFG61.68fgFG

注：表中同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在P=0.05水平差異顯著，不同大寫字母表示在P=0.01水平差異顯著。

3結(jié)論

本研究結(jié)果表明，經(jīng)過緩釋處理的2種外源茉莉酸類化合物，可以使得興安落葉松針葉內(nèi)的防御蛋白POD、CAT、PPO、PAL、TI、CI活性顯著提高(P<0.01)，其變化規(guī)律呈現(xiàn)先升高后降低的波動(dòng)變化，與噴施外源茉莉酸類化合物誘導(dǎo)的變化規(guī)律相近。緩釋處理的茉莉酸類化合物對(duì)興安落葉松針葉內(nèi)防御蛋白誘導(dǎo)作用沒有直接噴施處理反應(yīng)迅速，表現(xiàn)為前期誘導(dǎo)效果低于噴施處理，但后期誘導(dǎo)效果好于噴施處理，且緩釋處理誘導(dǎo)效果可以維持更長(zhǎng)的一段時(shí)間。MJA緩釋處理后，對(duì)POD、CAT、PAL活性的誘導(dǎo)至少可延長(zhǎng)10 d，對(duì)PPO、TI、CI活性的誘導(dǎo)至少可延長(zhǎng)5 d。ZJ緩釋處理后，對(duì)CAT活性的誘導(dǎo)至少可延長(zhǎng)15 d，對(duì)POD、PAL、TI、CI活性的誘導(dǎo)至少可延長(zhǎng)10 d，對(duì)PPO活性的誘導(dǎo)至少可延長(zhǎng)5 d。無論緩釋與否，施用MJA產(chǎn)生的誘導(dǎo)強(qiáng)度均好于ZJ。

對(duì)外源茉莉酸類化合物經(jīng)過簡(jiǎn)單的緩釋處理后，使其對(duì)落葉松抗蟲性的誘導(dǎo)增強(qiáng)作用可以得到延長(zhǎng)，對(duì)于在生產(chǎn)中可持續(xù)控制害蟲危害具有實(shí)踐意義。

參考文獻(xiàn)

[1]MEYER A, MIERSCH O, BüTTNER C, et al. Occurrence of the plant growth regulator jasmonic acid in plants[J]. J Plant Growth Regul,1984,3(1):1-8.

[2]CHOI D, BOSTOCK R M, AVDIUSHKO S, et al. Lipid-derived signals that discriminate wound-and pathogen-responsive isoprenoid pathways in plants: Methyl jasmonate and the fungel elicitor arachidonic acid in-duce different 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme a reductase genes and antimicrobial isoprenoids inSolanumtuberosumL.[J]. Proc Natl Acad Sci,1994,91(6):2329-2333.

[3]RICKAUER M, BRODSCHELM W, BOTTIN A, et al. The jasmonate pathway is involved differentially in the regulation of different defence responses in tobacco cells[J]. Planta,1997,202(2):155-162.

[4]MASON H S, DEWALD D B, CREELMAN R A, et al. Coregulation of soybean vegetative storage protein gene expression by methyl jasmonate and soluble sugars[J]. Plant Physiol,1992,98(3):859-867.

[5]SEMBDER G, PARTHIER B. The biochemistry and the physiological and molecular action of jasmonates[J]. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology,1993,44(4):569-589.

[6]KAWAZU K, MOCHIZUKI A, SUGENO W, et al. Differences in the susceptibility of five herbivore species and developmental stages to tomato resistance induced by methyl jasmonate treatment[J]. Arthropod-Plant Interactions,2013,7(4):415-422.

[7]ZAHEER M, GIRI C C. Multiple shoot induction and jasmonic versus salicylic acid driven elicitation for enhanced andrographolide production inAndrographispaniculata[J]. Plant Cell Tiss Organ Cult,2015,122:553-563.

[8]WAR A R, PAULRAJ M G, IGNACIMUTHU S, et al. Defensive responses in groundnut against chewing and sap-sucking insects[J]. Journal of Plant Growth Regulation,2013,32(2):259-272.

[9]AVDIUSHKO S A, BROWN G C, DAHLMAN D L, et al. Methyl jasmonate exposure induces insect resistance in cabbage and tobacco[J]. Environ Entomol,1997,26(3):642-654.

[10]THALER J S. Jasmonate_inducible plant defences cause increased parasitism of herbivores[J]. Nature,1999,399:686-688.

[11]孟昭軍.外源茉莉酸類化合物對(duì)兩種落葉松的誘導(dǎo)抗蟲性研究[D].哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué),2008.

[12]李合生.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M].北京:高等教育出版社,2000:166-168.

[13]王晶英,敖紅,張杰,等.植物生理生化實(shí)驗(yàn)技術(shù)與原理[M].哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué)出版社,2003:169-180.

[14]ZONG N, WANG C Z. Larval feeding induced defensive responses in tobacco: comparison of two sibling species ofHelicoverpawith different diet breadths[J]. Planta,2007,226(1):215-224.

[15]FELTON G W, DONATO K K, BROADWAY R M, et al. Impact of oxidized plant phenolics on the nutritional quality of dietary protein to a noctuid herbivore,Spodopteraexigua[J]. Journal of Insect Physiology,1992,38(4):277-285.

[16]徐偉.興安落葉松誘導(dǎo)抗蟲性研究[D].哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué),2006.

收稿日期：2015年10月9日。

第一作者簡(jiǎn)介：林健，男，1982年10月生，東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，博士研究生；現(xiàn)工作于湖北民族學(xué)院，講師。E-mail:113431577@qq.com。通信作者：嚴(yán)善春，東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，教授。E-mail:yanshanchun@126.com。

1)黑龍江省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(GA09B203-5)。

責(zé)任編輯：程紅。