高分辨率熔解曲線分析技術檢測血清游離DNA的EGFR基因突變

王 卓， 井昶雯， 吳建中， 馬 蓉

臨床與基礎研究

高分辨率熔解曲線分析技術檢測血清游離DNA的EGFR基因突變

王 卓， 井昶雯， 吳建中， 馬 蓉

目的 利用高分辨率熔解曲線分析技術 (high resolution melting，HRM)檢測石蠟包埋組織和血清游離DNA的表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)基因突變，分析兩者之間的關系，并探討其臨床應用價值。方法 利用HRM技術檢測EGFR基因突變的方法，檢測200例非小細胞肺癌患者石蠟包埋標本和200例相應的血清游離DNA，并將二者結果進行比較分析。結果 HRM法檢測非小細胞肺癌患者石蠟包埋組織DNA的EGFR基因突變總檢出率為43.5%，血清游離DNA的EGFR基因突變總檢出率為25.0%，HRM法檢測血清游離DNA的EGFR基因突變與檢測石蠟包埋組織DNA的EGFR基因突變相比，敏感性為57.5%，特異性為100%。結論 HRM法檢測血清游離DNA的EGFR基因突變?yōu)闊o法獲取腫瘤組織標本的患者提供了新的檢測機會。

高分辨率熔解曲線分析技術； EGFR基因突變； 血清游離DNA

肺癌是全球?qū)е滤劳龅闹饕獝盒阅[瘤之一，現(xiàn)已成為我國首位惡性腫瘤死亡原因。其中非小細胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌的80%左右[1]。臨床上大部分NSCLC患者首診時已處于中、晚期，大都失去了手術治療的機會，通常釆用放、化療治療手段，但治療效果往往并不理想。分子靶向治療是近些年來NSCLC治療的重大進展。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR) 突變在NSCLC分子靶向治療中的作用也越來越受到人們的重視。EGFR 突變是NSCLC患者是否對分子靶向治療酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor, TKI)敏感的強預測因子[2]。因此，EGFR 基因突變的檢測能為NSCLC分子靶向治療提供重要依據(jù)。本研究采用高分辨率熔解曲線分析技術 (high resolution melting，HRM)分別對NSCLC患者石蠟包埋組織和血清游離DNA進行EGFR 基因突變的檢測，檢測EGFR 基因18～21外顯子突變。分析兩者之間的關系，并探討其臨床應用價值。

1 材料和方法

1.1 標本來源 標本采自2012年1月至2014年12月我院收治的NSCLC患者石蠟包埋組織200例及相對應的血清標本200例。用DNA FFPE tissue kit (Qiagen)提取試劑盒提取石蠟組織DNA，并保存于-20 ℃?zhèn)溆?。用DNA Blood mini kit(Qiagen)提取試劑盒提取血清游離DNA，也保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗方法 設計適用于HRM技術的引物[3]，引物如表1所示。

表1 HRM法引物

HRM反應體系與反應條件：HRM檢測采用Roche LightCycler 480 system。反應體系為LightCycler HRM Master Reaction Mix (Roche), 3 mM MgCl2, and 200 nM primers和DNA模板，總體積為20 μl。擴增反應條件為：95 ℃預變性10 min，然后95 ℃變性10 s，65 ℃退火10 s，72℃延伸20 s，45個循環(huán)(采用touchdown技術，前10個循環(huán)退火溫度從65 ℃降到55 ℃，每個循環(huán)降1 ℃)。擴增結束后直接進行HRM分析，反應條件為95 ℃ 1 min，40 ℃ 1 min，熔解曲線數(shù)據(jù)收集從70～95 ℃，溫度上升速率為1 ℃/s。40 ℃冷卻[4]。

2 結果

2.1 HRM法檢測NSCLC患者石蠟包埋組織和血清游離DNA的EGFR基因突變結果統(tǒng)計與分析 檢測結果顯示HRM法檢測NSCLC患者石蠟包埋組織DNA的EGFR基因突變總檢出率為43.5%，18～21外顯子突變的檢出例數(shù)分別為4、38、3和42例。

而血清游離DNA的EGFR基因突變總檢出率為25%，18～21外顯子突變的檢出例數(shù)分別為2、22、2和24例。血清游離DNA的EGFR基因突變總檢出率低于石蠟包埋組織DNA的EGFR基因突變總檢出率。具體結果如表2所示。

圖1～圖4為HRM法檢測EGFR基因突變實驗中選取的18、19、20和21外顯子的突變示意圖。

表2 HRM法檢測NSCLC患者石蠟包埋組織和

2.2 血清游離DNA的EGFR基因突變檢測的特異性和敏感性 以HRM法檢測NSCLC患者石蠟包埋組織DNA的結果為參照，HRM法檢測血清游離DNA的EGFR基因突變的敏感性與特異性結果如表3所示。

表3 HRM法檢測血清游離DNA的EGFR基因

HRM法檢測血清游離DNA的EGFR基因突變與檢測石蠟包埋組織DNA的EGFR基因突變相比，敏感性為57.5%，敏感性一般，特異性為100%，特異性很好。

3 討論

表皮生長因子受體(EGFR)是一種跨膜蛋白，屬于HER家族中的一員。其主要分布在細胞膜的表面，結構由三部分組成：細胞外配體結合域、跨膜區(qū)與細胞內(nèi)酪氨酸激酶域[5]。有資料表明EGFR基因是肺癌生長的重要調(diào)控基因[6]。EGFR突變是癌癥患者是否對TKI敏感的強預測因子[2]。因此，EGFR 基因突變的檢測能為腫瘤患者尤其是非小細胞肺癌患者分子靶向治療提供重要依據(jù)。

目前，臨床上EGFR基因突變的檢測多是采用測序法和ARMS法。測序法相對而言過程繁瑣復雜、耗時長，并且對取材和操作技術要求比較高，更重要的是由于測序方法本身的靈敏度不高，原則上只能對含量大于30%的突變基因進行檢測，很多穿刺、石蠟等標本的檢測受限制。ARMS法簡便，靈敏度高，但價格昂貴，且只能檢測已知突變，無法檢測未知突變。本實驗采用的HRM法靈敏度較高，研究報道其靈敏度可達5%腫瘤細胞突變[3]，其價格便宜，操作簡便，檢出率較傳統(tǒng)方法高。

現(xiàn)有的EGFR基因突變檢測的標本來源基本上是手術切除或穿刺活檢的腫瘤組織，屬于有創(chuàng)檢查。但是在實際臨床診斷和治療過程中，有相當一部分的患者已失去了手術或穿刺活檢獲取腫瘤組織的機會。因此近年來有學者提出了無創(chuàng)檢查——血清游離DNA的EGFR基因突變檢測[7-9]。

血清游離DNA的EGFR基因突變檢測的關鍵問題是血清游離DNA的富集提取以及高靈敏度的檢測方法。本實驗采用了均一性和重復性較好的DNA Blood mini kit(Qiagen)提取試劑盒富集提取血清游離DNA，并采用了高靈敏度的HRM法。結果顯示，血清游離DNA進行EGFR基因突變檢測檢出率只有25%，低于石蠟包埋組織DNA基因突變檢出率的43.5%，敏感性只有57.5%，檢出率和敏感性有待提高。我們推斷這可能是由于本身血清游離DNA含量就少，此次試驗富集提取的方法仍然有局限，提取的DNA含量有限，從而對后續(xù)的檢測產(chǎn)生了影響，導致檢出率和敏感性不高。但考慮到為無法獲取腫瘤組織標本的患者提供了新的檢測機會，且檢測無創(chuàng)、價格便宜、操作簡便，因而此方法仍具有一定臨床應用價值。相信隨著技術的發(fā)展，血清游離DNA富集提取方法的改進，EGFR基因突變檢測的檢出率和敏感性得到提高，HRM法檢測血清游離DNA的EGFR基因突變終能得到廣泛應用并造福于廣大患者。

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High resolution melting analysis for EGFR mutations in plasma free DNA

WANGZhuo,JINGChangwen,WUJianzhong,MARong.

(ExperimentCenterofClinicalOncology,JiangsuCancerHospical,Nanjing210009,China)

Corresponding author:MARong,E-mail：965092958@qq.com

Objective To detect EGFR mutations using FFPE tissues and plasma free DNA by HRM analysis and to evaluate its clinical application value. Methods Formalin-fixed paraffin-embedded tissues and plasma free DNA of 200 NSCLC patients were detected by HRM analysis, the results were analyzed and compared accordingly. Results For FFPE tissues, the total EGFR mutation rate was 43.5% detected by HRM, and for plasma free DNA, the EGFR mutation rate was 25.0%. The sensitivity of HRM assays in plasma free DNA samples was 57.5%, the specificity of HRM assays in plasma free DNA samples was 100%. Conclusions HRM for EGFR mutations in plasma free DNA could be accepted as an option for patients who are unable to obtain tumor tissue specimens in the diagnostic or screening setting.

High resolution melting analysis; EGFR mutation; Plasma free DNA

江蘇省腫瘤醫(yī)院院內(nèi)基金(ZQ201205，ZQ201206，ZM201203)

210009 江蘇 南京，江蘇省腫瘤醫(yī)院 臨床腫瘤實驗中心

王 卓，男，助理研究員，研究方向：分子生物學，E-mail：wangzhuo14@sohu.com

井昶雯，女，實習研究員，研究方向：分子生物學，E-mail：jcw223200@163.com

馬 蓉，女，副研究員，研究方向：腫瘤的基礎研究，E-mail：965092958@qq.com

10.3969/j.issn.1674-4136.2016.01.011

1674-4136(2016)01-0036-04

2015-10-19][本文編輯：文 心]