強(qiáng)骨寶對(duì)去勢(shì)大鼠原發(fā)性膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨影響的實(shí)驗(yàn)研究

王文勝 陳偉 沈保磊 許波 張俐

【摘 要】目的：建立去勢(shì)后原發(fā)性膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型，觀察強(qiáng)骨寶對(duì)模型鼠關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)學(xué)及軟骨基質(zhì)的影響，為進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)。方法：①去勢(shì)后原發(fā)性膝骨關(guān)節(jié)炎模型建立：麻醉下摘除雙側(cè)卵巢1周后行疲勞性跑步訓(xùn)練，跑臺(tái)坡度-15°，頻率28 m·min-1，60 min·d-1，每周6 d，建立膝骨關(guān)節(jié)炎模型。分別于2，4，6周后檢測(cè)尿液中Ⅱ型膠原羧基端肽（CTX-Ⅱ），制作股骨髁病理切片鑒定模型。②動(dòng)物分組與給藥：將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組、強(qiáng)骨寶組、陽(yáng)性對(duì)照組，分別給予相應(yīng)處理。③取材與檢測(cè)：給藥4周后，取尿液、血清、雙側(cè)股骨髁，檢測(cè)尿液中CTX-Ⅱ含量，股骨髁軟骨經(jīng)HE染色處理后行Mankin評(píng)分。結(jié)果：①模型鑒定：根據(jù)尿液CTX-Ⅱ含量及軟骨Mankin評(píng)分結(jié)果，造模

4周后關(guān)節(jié)軟骨開(kāi)始退變，6周后退變明顯，模型成功。②給藥治療：Mankin評(píng)分及CTX-Ⅱ含量測(cè)定結(jié)果，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組、強(qiáng)骨寶組、陽(yáng)性對(duì)照組均增高（P < 0.01或P < 0.05）；與模型對(duì)照組比較，強(qiáng)骨寶組、陽(yáng)性對(duì)照組均降低（P < 0.05）；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，強(qiáng)骨寶組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。結(jié)論：強(qiáng)骨寶可減緩原發(fā)性膝骨關(guān)節(jié)炎模型鼠的軟骨損傷進(jìn)程。

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎，膝；強(qiáng)骨寶；動(dòng)物模型；大鼠；實(shí)驗(yàn)研究

doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2016.04.002

Experimental Study on the Effect of Qianggu Bao （強(qiáng)骨寶） on the Articular Cartilage of Primary Knee Osteoarthritis in Ovariectomized Rats

WANG Wen-sheng，CHEN Wei，SHEN Bao-lei，XU Bo，ZHANG Li

【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of Qianggu Bao（強(qiáng)骨寶）on the articular cartilage of primary

knee osteoarthritis in ovariectomized rats.Methods：①Establishing models of ovariectomized rats with primary knee osteoarthritis：After anesthesia，bilateral ovariectomy was performed for the experimental rats.After one week，they were forced to do fatigued running training on 15-degree treadmill with frequency of 28 m·min-1，60 min·d-1，for 6 days a week to establish knee osteoarthritis models.CTX-Ⅱin urine was detected respectively after 2，4 and 6 weeks，making pathological identification model of femoral condyle.②Grouping and administration：Successfully modeled rats were randomly divided into a model group，a Qianggu Bao group and a positive control group，and each group was given corresponding treatment.③Sanjmpling and detection：After 4 weeks of administration，urine，serum and bilateral femoral condyle were sampled to detect the content of CTX-Ⅱin urine and make Mankin scores to femoral condyle cartilage after HE staining.Results：①M(fèi)odel identification：According to the content of

CTX-Ⅱin urine and Mankin scores of femoral condyle cartilage，articular cartilage degeneration began after 4 weeks of modeling，which was obvious after 6 weeks，so the models were successfully established.

② Administration for treatment：Compared with the blank control group，Mankin score and CTX-Ⅱcontent of the model control group，the Qianggu Bao group and the positive control group all increased （P < 0.01 or P < 0.05）；compared with the model control group，those of the Qianggu Bao group and the positive control group decreased （P < 0.05）；and the difference between the positive control group and the Qianggu Bao group had no statistical significance （P > 0.05）.Conclusion：Qianggu Bao can slow down the process of cartilage damage in model rats with primary knee osteoarthritis.

【Keywords】 osteoarthritis，knee；Qianggu Bao（強(qiáng)骨寶）；animal model；rats；experimental study

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）屬于退行性病變，致殘率高達(dá)53%，全國(guó)40歲以上人群患病率為46.3%，其中女性患病率為50.4%[1]。本病的病理改變以關(guān)節(jié)軟骨損害為主，累及整個(gè)關(guān)節(jié)，出現(xiàn)關(guān)節(jié)及其周?chē)浗M織疼痛、腫脹、功能障礙、畸形等臨床表現(xiàn)[2]，嚴(yán)重影響患者的身心健康。強(qiáng)骨寶是我國(guó)骨傷泰斗張安楨教授的經(jīng)驗(yàn)方，由骨碎補(bǔ)、補(bǔ)骨脂、木瓜、當(dāng)歸、川芎、三七、甘草7味藥組成，臨床治療骨關(guān)節(jié)疾病效果顯著。本方藥性以辛、溫為主，辛以活血行氣，溫以祛寒除濕；歸經(jīng)以肝、脾、腎三經(jīng)為主。骨碎補(bǔ)苦溫入腎，入腎而治骨，補(bǔ)骨脂苦辛溫燥，善壯腎陽(yáng)，二藥相須而用，為本方君藥，共奏強(qiáng)筋壯骨之功。當(dāng)歸長(zhǎng)于補(bǔ)血，兼散寒活血止痛；川芎為“血中之氣藥”，善活血行氣，兼祛風(fēng)通絡(luò)止痛；三七專于活血化瘀止痛，兼補(bǔ)虛強(qiáng)壯之功；木瓜味酸入肝，溫香入脾，舒筋活絡(luò)化濕除痹之力俱強(qiáng)；此4味共為臣藥，輔助君藥補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，并兼顧氣虛血瘀、風(fēng)寒濕阻等標(biāo)證。甘草為佐使，調(diào)和諸藥，防止溫?zé)崽^(guò)而傷陰，減輕長(zhǎng)期服用骨碎補(bǔ)產(chǎn)生的毒性，又可增強(qiáng)緩急止痛的功效。前期研究表明，強(qiáng)骨寶可降低模型鼠血清及關(guān)節(jié)軟骨一氧化氮合成酶（induced nitric oxide synthase，iNOS）含量，降低血清中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達(dá)，提高血清超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）表達(dá)[3]，本研究進(jìn)一步觀察強(qiáng)骨寶對(duì)關(guān)節(jié)軟骨退變的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6月齡SPF級(jí)SD大鼠，78只，雌性，體質(zhì)量（360±20） g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證書(shū)號(hào)SCXK（滬）2012-0002。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物房，合格證號(hào)2009-0001。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 8萬(wàn)單位硫酸慶大霉素注射液（福州海生福王制藥有限公司）；0.9%生理鹽水（福州海生福王制藥有限公司）；強(qiáng)骨寶顆粒劑（福建省中醫(yī)藥科技開(kāi)發(fā)總公司）；筋骨痛消丸（河南省洛正制藥廠，國(guó)藥準(zhǔn)字Z10970117）。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 ZH-PT動(dòng)物跑臺(tái)（淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司）； ELX800型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Biotek公司）；DMI 6000+型生物倒置顯微鏡（德國(guó)Leica儀器有限公司）；大鼠血清、尿液CTX-Ⅱ ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

2 方 法

2.1 造模方法 隨機(jī)選取24只為空白對(duì)照組，

18只為去勢(shì)組，36只為模型組。去勢(shì)組僅摘除卵巢，模型組摘除卵巢并造模，造模方法參照文獻(xiàn)[4]中去卵巢后聯(lián)合疲勞損傷誘導(dǎo)法：麻醉下摘除雙側(cè)卵巢，1周后運(yùn)用小動(dòng)物跑步臺(tái)行疲勞性跑步訓(xùn)練，跑臺(tái)坡度-15°，頻率28 m·min-1，60 min·d-1，每周6 d。

2.2 模型鑒定方法 分別于造模2，4，6周時(shí)，各組隨機(jī)選取6只處死，鑒定模型，共用54只。取材：代謝籠收集24 h尿液后實(shí)施安樂(lè)死，取雙側(cè)股骨髁。經(jīng)腹主動(dòng)脈采集動(dòng)脈血，靜置1 h后離心機(jī)3000 r·min-1離心10 min，取上層血清，

-80 ℃凍存。檢測(cè)：截取雙側(cè)膝關(guān)節(jié)，4%多聚甲醛固定48 h，股骨髁經(jīng)10%EDTA脫鈣6周，石蠟包埋，切片蘇木素-伊紅（HE）染色后對(duì)比形態(tài)學(xué)改變，記錄Mankin評(píng)分；采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法，檢測(cè)尿液中CTX-Ⅱ濃度。

2.3 分組方法 將造模成功后剩余的18只模型組大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、強(qiáng)骨寶組，每組6只，給予相應(yīng)治療。

2.4 給藥方法 空白對(duì)照組予以常規(guī)飼養(yǎng)；模型對(duì)照組于造模成功后常規(guī)飼養(yǎng)；陽(yáng)性對(duì)照組選用筋骨痛消丸灌胃，藥物濃度為0.5 g·mL-1；強(qiáng)骨寶組給予強(qiáng)骨寶灌胃，藥物濃度為0.7 g·mL-1。給藥劑量均定為0.5 mL·（100 g）-1，每日2次，共給藥4周。給藥治療4周后全部處死，取材，檢測(cè)（方法同2.2中取材與檢測(cè)），統(tǒng)計(jì)分析強(qiáng)骨寶作用。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)性分布以表示，各組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)前后比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

意義。

3 結(jié) 果

3.1 模型的鑒定 根據(jù)尿液CTX-Ⅱ含量及軟骨Mankin評(píng)分結(jié)果，造模4周后關(guān)節(jié)軟骨開(kāi)始退變，6周后退變明顯，模型成功。見(jiàn)表1、圖1。

3.2 治療后各組軟骨CTX-Ⅱ和Mankin評(píng)分含量觀察 與空白對(duì)照組比較，其余3組均顯著增高

（P < 0.01或P < 0.05），與模型對(duì)照組比較，強(qiáng)骨寶組與陽(yáng)性對(duì)照組均降低（P < 0.01），強(qiáng)骨寶組與陽(yáng)性對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)表2、圖2。

4 討 論

中醫(yī)學(xué)從整體觀的角度認(rèn)知KOA的發(fā)病與防治，本病之病變雖在關(guān)節(jié)局部筋骨，但究其病根在肝脾腎三臟虛衰；另外，工作生活帶來(lái)的慢性損傷及風(fēng)寒濕邪的入侵是發(fā)病的重要條件?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》有云：“肝主筋?！薄澳I主骨?！薄捌⒅骷∪??！薄帮L(fēng)寒濕三氣雜至合而為痹?！薄芭悠咂呷蚊}虛，太沖脈衰少，天癸竭，地道不通；男子七八肝氣衰，筋不能動(dòng)。”《景岳全書(shū)》云：“蓋痹者閉也，以氣血為邪所閉，不得通行而病也?！比说街心?，尤其是女性，進(jìn)入圍絕經(jīng)期后，正氣日衰，肝脾腎漸虧，精氣血瘀滯，復(fù)感外邪或外傷勞損，極易罹患本病，其病機(jī)特點(diǎn)可概括為“本虛標(biāo)實(shí)，本痿標(biāo)痹，痹痿并存”[5-6]。

《內(nèi)經(jīng)》有云：“上工治未病?！盞OA屬于慢性退行性疾病，早期治療對(duì)減輕患者病痛，延緩疾病的發(fā)展進(jìn)程均具有積極的意義。KOA發(fā)病初期以關(guān)節(jié)軟骨變性損傷為主要病理改變，關(guān)節(jié)軟骨屬中醫(yī)學(xué)“筋骨”范疇，CTX-Ⅱ是Ⅱ型膠原最主要的降解產(chǎn)物，屬于非新合成產(chǎn)物，全部以小肽的形式經(jīng)過(guò)血液循環(huán)進(jìn)入尿液，與其他軟骨代謝產(chǎn)物相比具有較長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定性和可靠性，可作為骨關(guān)節(jié)炎早期診斷的有效指標(biāo)[7]。有學(xué)者研究表明，軟骨潮線漂移是骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變進(jìn)程中必經(jīng)的病理變化[8]。

補(bǔ)腎祛瘀法是中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)治療骨關(guān)節(jié)炎的經(jīng)典治法之一，可有效降低多種細(xì)胞因子水平，從而實(shí)現(xiàn)改善慢性滑膜炎癥，控制或減輕關(guān)節(jié)軟骨的損傷進(jìn)程，減輕疼痛，增強(qiáng)肌肉耐力及關(guān)節(jié)活動(dòng)能力等效果[9]。強(qiáng)骨寶是在補(bǔ)腎祛瘀的思路下組方，以補(bǔ)腎祛瘀藥為君，此類中藥是歷代醫(yī)家治療KOA的方藥中應(yīng)用較多，研究較深入的一類[10]，整方立意攻補(bǔ)兼施，祛瘀而不傷正，補(bǔ)虛而不留邪，可獲正盛而邪去，實(shí)現(xiàn)防治KOA的目的，這與婁多峰的“虛邪瘀”思想有異曲同工之妙[11]。本研究結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組比較，強(qiáng)骨寶組關(guān)節(jié)軟骨Mankin評(píng)分及尿液CTX-Ⅱ濃度明顯降低，與陽(yáng)性對(duì)照組比較無(wú)明顯差異，說(shuō)明該方可降低大鼠早期膝關(guān)節(jié)軟骨的損傷程度，可在KOA的預(yù)防與治療中發(fā)揮積極作用，值得進(jìn)一步研究運(yùn)用。

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收稿日期：2015-11-23；修回日期：2016-01-04