金釵石斛保健酒增強機體免疫力的篩選研究

趙明德，肖順漢，孫　琴，羅　穎，覃雪峰，劉明華(.西南醫(yī)科大學實驗動物中心，四川瀘州646000；.西南醫(yī)科大學藥學院，四川瀘州646000)

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金釵石斛保健酒增強機體免疫力的篩選研究

趙明德1，肖順漢2，孫琴2，羅穎2，覃雪峰2，劉明華2
(1.西南醫(yī)科大學實驗動物中心，四川瀘州646000；2.西南醫(yī)科大學藥學院，四川瀘州646000)

摘要：優(yōu)選金釵石斛保健酒的最佳制備工藝，篩選增強機體免疫力的最佳配制樣品。以3種制備工藝配制金釵石斛酒樣品A、B、C，考察收膏率、指標成分含量和感官3個指標，優(yōu)選其最佳制備工藝。通過測定小鼠體重、免疫器官重量和血清溶血素，篩選增強機體免疫力的最佳配制樣品。結果表明，3種方法制得的A、B和C保健酒收膏率分別為32.3 %、34.4 %和32.1 %，石斛堿含量分別為0.018 mg/mL、0.069 mg/mL和0.076 mg/mL，總皂苷含量分別為0.39 mg/mL、0.33 mg/mL和0.23 mg/mL。樣品A、B、C低劑量(1.16 g生藥/kg)、高劑量(2.32 g生藥/kg)組均能升高免疫器官脾與胸腺指數(shù)，提高血清溶血素水平，對小鼠的免疫功能具有顯著的調節(jié)作用(P＜0.05)，其中以樣品B作用最強(P＜0.01)。金釵石斛保健酒能增強機體免疫力，樣品B為其最佳配制樣品。

關鍵詞：金釵石斛；保健酒；增強免疫力

金釵石斛為蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium Sw.)植物金釵石斛(D.nobile Lindl.)的新鮮或干燥莖?！侗静菥V目》記載金釵石斛有“強陰益精、厚腸胃、壯筋骨、暖水脹、補腎益力、輕身延年”之功效，因其特殊的生存環(huán)境和卓越的滋補功效而名列“中華九大仙草”之首，具有極高的藥用價值。金釵石斛中主要含有生物堿、酚類、多糖、黃酮、菲聯(lián)、芐、芴酮等成分，對心腦血管、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和眼科等疾病有明顯治療作用，具有抗腫瘤、抗衰老、調節(jié)機體免疫力、抗疲勞、有效減輕肝損傷、抗白內障等多重功效[1-3]。人參被人們稱為“百草之王”，現(xiàn)代研究表明，人參的藥理作用極為廣泛，涉及人體中樞神經(jīng)、心血管、免疫和消化等系統(tǒng)以及機體合成代謝、性腺等方面[4-6]。枸杞子為茄科植物寧夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果實，具有增強機體免疫力，調節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)，提高機體造血功能、生殖功能，降血糖和血脂，保護肝臟，抗疲勞，抗腫瘤，抗氧化等多重功效[7]。龍眼肉是無患子科龍眼屬龍眼Dimocarrus Longan Lour.的假種皮，又叫桂圓、益智，主要有抗應激、抗焦慮、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、調節(jié)內分泌及增強免疫力等作用[8]。因其具有較高的食療和藥用價值，自古有“南方人參”之稱。大棗具有補虛益氣、養(yǎng)血安神、健脾和胃等作用，對慢性肝炎、肝硬化、貧血、過敏性紫癜等病癥有較好療效；其中大棗中含有三萜類化合物及環(huán)磷酸腺苷，有較強的抗癌、抗過敏作用[9]。

本課題組在中醫(yī)藥理論指導下，以瀘州地道藥材金釵石斛為主，配伍用人參、枸杞、龍眼肉、大棗，采用現(xiàn)制備工藝調配成30 %vol養(yǎng)生保健酒。以功效成分為指標，優(yōu)選出最佳金釵石斛原料和制備方法，按《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》(2003年版)開展功能性實驗研究，為開發(fā)調節(jié)免疫力保健酒提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料及儀器

動物：昆明種小白鼠，清潔級，18～22 g，雌雄各半，均由瀘州醫(yī)學院實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號SCXK(川)2013—17，使用許可證號SCXK(川)2013—065。實驗動物飼養(yǎng)于瀘州醫(yī)學院實驗動物中心，室溫：22～24℃，濕度：65 %～80 %。給藥期間，動物分籠以全價顆粒飼養(yǎng)，自由飲水。

受試物和實驗試劑：金釵石斛藥材，采自貴州赤水紅花村金釵石斛種植基地(經(jīng)瀘州醫(yī)學院生藥教研室稅丕先教授鑒定)；人參、大棗、枸杞和龍眼藥材均購自瀘州百草堂中藥飲片有限公司，石斛堿對照品購于中國食品藥品檢定研究院，純度≥99.8 %，批號YPE7-L608；清香型糧食酒和濃香型糧食酒均由瀘州老窖酒業(yè)有限公司提供。Amberlite-XAD-2大孔樹脂；中性氧化鋁；甲醇為色譜純；高氯酸、乙醇、冰乙酸、甲酸為分析純；實驗用水均為雙蒸水；香草醛溶液：稱取5 g香草醛于100 mL容量瓶中，加冰乙酸溶解定容至刻度。綿羊紅細胞(SRBC)，瀘州衛(wèi)生防疫站提供。豚鼠血清，瀘州醫(yī)學院藥理教研室制備。

儀器設備：UV-1800型紫外可見分光光度計，河北潤聯(lián)機械設備有限公司；A2204B電子天平，上海精科天美科學儀器有限公司；低溫高速離心機，上?；偕锟萍加邢薰荆缓銣厮″?，北京國華醫(yī)療器械廠。

1.2實驗方法

1.2.1制備工藝研究

(1)藥材前處理、水提、濃縮：按一個組方用藥量分別稱取藥材金釵石斛(干燥后)120 g、人參60 g、大棗100 g、枸杞100 g、龍眼100 g，金釵石斛、人參粉碎(過三號篩)，大棗去核，枸杞、龍眼搗爛，常溫下加水浸泡2 h，分別以10倍、8倍、6倍水煎煮60 min、50 min、40 min，合并煎液，過濾，濃縮成1000 mL清膏(相當于0.48 g生藥/mL)，備用。

(2)配制30 %vol保健酒

A法制備：取上述方法制得的清膏400 mL，加入30 %vol的清香型糧食酒，混合溶解，冷藏靜置24 h，取上清液，加30 %vol清香型糧食酒稀釋至1000 mL，得樣品A。

B法制備：取上述方法制得的清膏400 mL，加入30 %vol的濃香型糧食酒，混合溶解，冷藏靜置24 h，取上清液，加30 %vol濃香型糧食酒稀釋至1000 mL，得樣品B。

C法制備：取上述方法制得的清膏400 mL，冷凍干燥成干膏，加30 %vol清香型糧食酒，溶解，過濾，取濾液，加30 %vol清香型糧食酒稀釋至1000 mL，得樣品C。

1.2.2功效成分檢測

1.2.2.1收膏率測定

(1)水提物收膏率測定：取上述清膏100 mL，冷凍干燥，得干膏，稱定重量，按公式(1)計算，計算水提物收膏率。

式中：m干膏為干膏重量，V總為投入總藥材所提取的清膏體積，V為干膏干燥前的清膏體積，m總為總藥材投入量。

(2)保健酒收膏率測定：分別取A、B、C樣品各100 mL,冷凍干燥，稱定重量，按公式(1)計算，得A、B、C收膏率。

1.2.2.2含量指標

(1)石斛堿含量測定。分別吸取樣品A、B、C各10 mL，冷凍干燥，用甲醇溶解，過濾。注入氣相色譜中，色譜柱：DB-1毛細管柱(100 %二甲基聚硅氧烷)；初始溫度為70℃；柱溫箱：以10℃/min升溫至250℃，保持5 min；進樣口溫度為250℃；檢測器溫度為250℃；進樣量0.2 μL；柱壓90 kPa；尾吹40 mL/min，測定石斛堿含量。

(2)人參總皂苷含量測定。參照《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》(2003年版)中人參總皂苷測定辦法進行如下操作：取人參皂苷Re標準溶液(2.0 mg/mL)100 μL作標準液和保健酒A、B、C各1 mL為待測液，分別水浴揮干后用水溶解殘渣，過層析柱(制作見附錄一)，用70 %vol乙醇和水洗柱，收集70 %vol乙醇洗脫液，置水浴中揮干。加香草醛溶液顯色反應，于560 nm波長下測定吸光度(A)，按公式(2)計算A、B、C保健酒中人參總皂苷含量。

式中：A待測液為待測酒吸光度；A標準液為標準液吸光度；m人參皂苷Re為標準管人參皂苷的質量；V標準品稀釋體積為標準品稀釋體積。

(3)感官指標：分別從樣品色澤、性狀、有無肉眼可見雜質和滋味氣味色澤等方面評價樣品A、B、C。

1.2.3增強機體免疫力的功效研究

(1)劑量和分組：參照《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》(2003版)保健酒增強機體免疫力實驗。將90只小鼠隨機分為9組，每組10只，雌雄各半，分別為樣品A、B、C高劑量組(HD-A、HD-B、HD-C)、低劑量組(LD-A、LDB、LD-C)，溶媒基酒組(BC)，陽性對照組(YC)，空白對照組(NC)。灌胃給藥，每天1次，連續(xù)30 d，實驗期間小鼠自由飲水、攝食，稱量體重。各組給藥如下：實驗組A、B、C高劑量小鼠灌胃給予劑量為2.32 g生藥/kg，低劑量小鼠灌胃給予劑量為1.16 g生藥/kg，溶媒對照組小鼠灌胃給予30 %vol濃香型糧食酒0.2 mL/10 g，陽性對照組小鼠灌胃給予轉移因子膠囊(0.1 mg/mL)0.2 mL/10 g，空白對照組小鼠灌胃給予生理鹽水0.2 mL/10 g。

(2)對免疫器官重量的影響：小鼠連續(xù)灌胃30 d，每日1次，末次給藥后1 h，稱量小鼠體重，取脾臟和胸腺，去盡筋膜，用濾紙吸干臟器表面血污，稱胸腺和脾重量，按公式(3)計算脾(胸腺)指數(shù)。

(3)血清溶血素形成的實驗：分組和給藥方法同上，給藥3 d后每只小鼠腹腔注射劑量為5 %的綿羊紅細胞0.5 mL進行免疫。連續(xù)給藥7 d后，于末次給藥30 min后，摘眼球取血，分離得血清。量取稀釋200倍血清l mL，加入5 % SRBC和10 %補體各0.5 mL,混勻，置37℃恒溫水浴箱中溫浴30 min，取出放在冰水中冷卻，離心，取上清液，于540 nm分光光度計下測吸光度(A)。以半數(shù)溶血值(HC50)表示溶血素水平，按公式(4)計算。

式中：HC50表示半數(shù)溶血值；A待測樣品表示待測樣品的吸光度值；ASRBC表示SRBC半數(shù)溶血時的吸光度值；n表示待測樣品稀釋倍數(shù)。

1.2.4統(tǒng)計學分析

計量資料用以(x±S)表示，采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析及組間兩兩比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.01表示差異有顯著統(tǒng)計學意義。

2　結果與分析

2.1功效成分測定

測得水提物收膏率及3種保健酒收膏率、石斛堿含量和總皂苷含量見表1。

2.2對小鼠免疫器官重量的影響

各劑量組小鼠活潑，皮毛光滑，未見任何不良反應。陽性對照組和樣品A、B、C高、低劑量組小鼠實驗結束時體重增加較明顯，與空白對照組比較，差異有顯著性(P＜0.05)。與空白對照組比較，溶媒基酒組動物脾臟、胸腺臟器系數(shù)未見顯著性差異。但陽性對照和樣品A、B、C高、低劑量組均能提高小鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)，呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，以樣品B作用最明顯，與空白對照組比較，P＜0.01，結果見表2。

2.3對小鼠血清溶血素形成的影響

結果顯示，陽性對照組和樣品A、B、C高、低劑量組均能促進小鼠溶血素抗體形成，以樣品B作用最明顯，與空白對照組比較，P＜0.01，結果見表3。

3　討論

表1 水提物和保健酒收膏率和指標成分含量

表2 對小鼠免疫器官的影響( x±S)

金釵石斛Dendrobium nobile Lindl.，又稱金釵石、扁金釵、扁黃草、扁草、黃草，為蘭科石斛屬多年生附生草本植物?！侗静菥V目》中記載，金釵石斛可“強陰益精，厚腸胃，壯筋骨，暖水臟，補腎益力，輕身延年”等，是藥用范圍較廣的名貴中藥；又由于其花型奇特、花色艷麗，而具有較高的觀賞價值。多糖類成分是石斛中具有免疫增強作用和抗腫瘤作用的活性成分。此外，還發(fā)現(xiàn)凡達到傳統(tǒng)標準“質重，嚼之粘牙，口甜，無渣者為優(yōu)”的樣品種類中多糖含量均高于30 %?？梢?，多糖是石斛中一種重要的有效成分。

表3 對小鼠血清溶血素形成的影響( x±S)

評價收膏率和指標性成分兩項化學指標，水煎提取物和A、B、C 3種保健酒收膏率均較高，配制過程所損失的成分均不大，其中B損失量最少。石斛堿含量以B、C較高，人參總皂苷含量以A、B較高。3種方法所制保健酒從感官指標評價，均符合保健酒相關規(guī)定。然而單從以上化學指標和感官指標參數(shù)難以確定最佳工藝方法，還需進一步結合藥理效應進行確定。

金釵石斛(D.nobile)多糖具有直接促進淋巴細胞有絲分裂的作用，從而增強機體的免疫能力。在本次研究中，臨床上免疫力測定沒有明確的生化指標，但可以從免疫器官脾、胸腺的狀態(tài)反應。造血干細胞在脾和胸腺等免疫器官發(fā)育分化為各類型成熟的免疫細胞。正常情況下，免疫器官的分化程度與機體免疫力相一致[10]。根據(jù)保健食品功能學評價程序和檢驗方法，免疫調節(jié)功效研究的判定方法：在一組試驗中，受試物對免疫系統(tǒng)某方面的試驗具有增強作用而對其他試驗無抑制作用，可以判定該受試物具有該方面的免疫調節(jié)效應；對任何一項免疫試驗具有抑制作用可判定該受試物具有免疫抑制效應。在細胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細胞功能及NK細胞功能檢測中，如有兩個以上(含兩個)功能檢測結果呈陽性，即可判定該受試物具有免疫調節(jié)作用[11]。在本實驗條件下，樣品A、B、C高、低劑量組均能升高脾指數(shù)與胸腺指數(shù)，提高血清溶血素水平，對小鼠的免疫功能具有顯著的調節(jié)作用。但以樣品B作用最強，為金釵石斛保健酒最佳配制樣品。

參考文獻：

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茅臺新品悉數(shù)亮相瀘州酒博會

本刊訊：據(jù)《糖酒快訊-白酒》報道，2016年3月18日，貴州茅臺集團黨委書記、總經(jīng)理李保芳率領有多名集團高管在內的70多人龐大代表團趕赴瀘州，參加19日開幕的中國（瀘州）國際酒業(yè)博覽會。業(yè)內人士發(fā)現(xiàn)，這是近年來，貴州茅臺集團派出的規(guī)模最大、規(guī)格最高的參會隊伍。

由于本屆瀘州酒博會專門設置了“中國名酒館”，為國酒茅臺、瀘州老窖、五糧液等17個中國著名品牌提供專屬展區(qū)。所以此次茅臺集團核心企業(yè)的茅臺酒股份公司現(xiàn)有主打產(chǎn)品及新研發(fā)產(chǎn)品將悉數(shù)亮相，包括技術開發(fā)有限公司、保健酒公司、習酒公司、生態(tài)農(nóng)業(yè)公司等在內的其他酒類子公司的產(chǎn)品也將集體登場。為此，除組委會免費提供的近200平方米面積的主展館，茅臺集團還在茅臺主展館旁邊的一塊空地上增加約為80平方米的場地用于集團子公司展示產(chǎn)品。（江源薦，駱佳龍編輯）

來源：糖酒快訊-白酒2016-03-18

Screening of Dendrobium nobile Healthcare Wine with Immunity-Enhancing Capability

ZHAO Mingde1, XIAO Shunhan2, SUN Qin2, LUO Yin2, QIN Xuefeng2and LIU Minghua2
( 1. Experimental Animal Center, Southwest Medical University, Luzhou, Sichuan 646000; 2. School of Pharmacy, Southwest Medical University, Luzhou, Sichuan 646000, China)

Abstract:In this study, Dendrobium nobile healthcare wine samples A, B and C were prepared by three different preparation technology respectively, and the best preparation technology was selected through the analysis of three indexes of wine samples (ointment collecting rate, index component content, and sensory indexes). Furthermore, the best wine sample with immunity-enhancing capability was screened out through the measurement of rat weight, immune organs weight, and serum hemolysin. The results showed that, ointment collecting rates of wine samples A, B and C produced by the three different technology were 32.3 %, 34.4 % and 32.1 % respectively, dendrobium content were 0.018 mg/mL, 0.069 mg/mL and 0.076 mg/mL respectively, and total saponins content were 0.39 mg/mL, 0.33 mg/mL and 0.23 mg/mL respectively. Both lowdosage group and high-dosage group of wine samples A, B and C could increase the immune organ spleen and thymus index, increase serum hemolysin level, and regulate the immune function of mice(P＜0.05). Among them, wine sample B had the best immunity-enhancing capability (P＜0.01) and it was the best wine sample.

Key words:Dendrobium nobile；healthcare wine；immunity-enhancing

通訊作者：劉明華（1972-），男，碩士，教授，碩士研究生導師，研究方向：抗腫瘤藥物篩選及分子靶點研究，E-mail：liumhvip@163.com。

作者簡介：趙明德（1966-），男，副研究員，研究方向：實驗動物學，E-mail：99053808@qq.com。

收稿日期：2015-12-17

基金項目：瀘州市-四川醫(yī)科大學聯(lián)合基金項目（No：2013LZLY-K74）。

DOI：10.13746/j.njkj.2015469

中圖分類號：TS262.91；TS261.4

文獻標識碼：A

文章編號：1001-9286(2016)04-0077-04

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-02-26；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160226.0948.003.html。