一株米根霉固態(tài)發(fā)酵代謝產(chǎn)物的分析

楊雨琨，唐　潔（.湖北省大冶市第一中學(xué)，湖北大冶43500；.勁牌有限公司，湖北大冶43500）

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一株米根霉固態(tài)發(fā)酵代謝產(chǎn)物的分析

楊雨琨1，唐潔2
（1.湖北省大冶市第一中學(xué)，湖北大冶435100；2.勁牌有限公司，湖北大冶435100）

摘要：分析1株來(lái)源于小曲白酒中米根霉G12固態(tài)發(fā)酵的代謝產(chǎn)物。通過(guò)在實(shí)驗(yàn)室模擬小曲白酒固態(tài)發(fā)酵工藝建立小試發(fā)酵平臺(tái)，添加純種米根霉作為酒曲，經(jīng)糖化、發(fā)酵、蒸餾，測(cè)定餾液中主要揮發(fā)性成分，對(duì)照組為不添加任何酒曲。結(jié)果表明，米根霉G12具有較強(qiáng)的產(chǎn)酒能力，產(chǎn)酒平均出酒率為12.10 %。同時(shí)該株菌在固態(tài)發(fā)酵中也能產(chǎn)生大量正丙醇與雜醇油，因而對(duì)雜醇油的生成有一定的貢獻(xiàn)。研究可為降低小曲白酒雜醇油途徑提供不同的思路。

關(guān)鍵詞：米根霉；固態(tài)發(fā)酵；產(chǎn)物分析；白酒

清香型小曲白酒的工藝特點(diǎn)是先糖化，后發(fā)酵，清蒸流酒，續(xù)米查配料。小曲酒釀造工藝流程為：原料→泡糧→蒸糧(裝甑、初蒸、悶水、復(fù)蒸)→培菌(出甑攤晾、翻糧、加曲、進(jìn)箱保溫)→發(fā)酵(配糟、出箱、攤晾、混合、入池)→蒸餾[1]。獨(dú)特的釀造工藝，造就了小曲清香型白酒具有以乙酸乙酯為主體的協(xié)調(diào)復(fù)合香氣，清香純正、入口微甜、香味悠長(zhǎng)、落口干爽、微有苦味等特點(diǎn)。乙酸乙酯、乳酸乙酯、高級(jí)醇是構(gòu)成清香型小曲酒的主體香味成分，且組分中具有酯低、酸高、高級(jí)醇高等特征[2]。但與大曲清香白酒相比，小曲清香型白酒特點(diǎn)是口味簡(jiǎn)單、出酒率高，酒的品質(zhì)和口感不如大曲酒豐富。

清香型小曲白酒發(fā)酵過(guò)程中酵母主要起產(chǎn)酒精和代謝風(fēng)味物質(zhì)作用，雜醇油是其代謝副產(chǎn)物。米根霉在釀酒過(guò)程中產(chǎn)生糖化酶及液化酶，可將原料中的淀粉轉(zhuǎn)化成酵母可以利用的糖類(lèi)物質(zhì)，主要起糖化作用[3]。另外，有文獻(xiàn)報(bào)道米根霉還有一定的產(chǎn)酒精的作用，在發(fā)酵過(guò)程中，還可產(chǎn)生一些風(fēng)味物質(zhì)，但沒(méi)有具體的數(shù)據(jù)表明。開(kāi)展本試驗(yàn)的目的就是考察米根霉的產(chǎn)酒能力，以及其對(duì)小曲白酒固態(tài)發(fā)酵中主要微量成分如乙酸乙酯、雜醇油的生成是否有貢獻(xiàn)。

1　材料與方法

1.1材料

實(shí)驗(yàn)菌株：分離于小曲白酒酒曲，經(jīng)純化、麩皮管保藏的菌種米根霉G12，作為實(shí)驗(yàn)菌種；高粱為東北高粱。

主要試劑：葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉為生化級(jí)試劑，氯化鈉為分析試劑。

主要儀器：高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、Agilent 7890A型氣相色譜儀（配有氫火焰檢測(cè)器和7863型自動(dòng)進(jìn)樣器，美國(guó)安捷倫公司產(chǎn)品）。

YPD瓊脂培養(yǎng)基：酵母提取物1 %，葡萄糖2 %，蛋白胨2 %，瓊脂粉2 %，121℃滅菌20 min。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

本研究模擬釀造車(chē)間生產(chǎn)工藝流程進(jìn)行，即蒸糧、糖化培菌、入瓶發(fā)酵和蒸餾。為避免發(fā)酵過(guò)程中其他微生物生長(zhǎng)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，蒸糧后攤晾及后續(xù)操作均在無(wú)菌室中進(jìn)行。試驗(yàn)分成兩組進(jìn)行，設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和空白組：實(shí)驗(yàn)組加入純種根霉曲，空白組不添加任何酒曲。

1.2.1蒸糧

蒸糧的目的在于使淀粉顆粒吸水、膨脹、破裂、糊化，以利于淀粉酶的作用和后續(xù)糖化及發(fā)酵過(guò)程在微生物的利用；同時(shí)，在高溫下，糧食也得以滅菌，并排除一些揮發(fā)性的不良成分。

在三角瓶中稱(chēng)取250 g東北高粱，自來(lái)水浸泡24 h后，瀝干水分，經(jīng)過(guò)初蒸（121℃，20 min）、悶糧（100℃，25 min）和復(fù)蒸（115℃，10 min），使糧食水分在53 %～60 %，感官上達(dá)到大部分開(kāi)口，軟硬適中。復(fù)蒸時(shí)，紗布包扎瓶口，避免雜菌進(jìn)入。

1.2.2糖化培菌

糖化過(guò)程包括淀粉經(jīng)酶作用生產(chǎn)糖和酒曲中微生物利用糖增殖兩個(gè)過(guò)程。為確保糖化過(guò)程中產(chǎn)香正常，小試試驗(yàn)中熟糧糖化培菌在恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行，控制培養(yǎng)溫度為30℃。

熟糧在無(wú)菌室內(nèi)攤晾后，按1 %的加曲量，分別稱(chēng)取2.5 g純種根霉曲加入實(shí)驗(yàn)組，混合均勻，在培養(yǎng)箱中30℃糖化24 h?？瞻捉M為不添加酒曲的熟糧直接放入培養(yǎng)箱。

1.2.3入瓶發(fā)酵

糖化醅與配糟按一定比例混勻后入容器，在酵母、霉菌、細(xì)菌等微生物作用下產(chǎn)生乙醇、酸、酯及其他各種成分的過(guò)程即為發(fā)酵。

配糟采用大試車(chē)間復(fù)原糟，干糟與水按3∶7比例混合，浸泡3 h，121℃滅菌20 min。滅完菌后，復(fù)原糟水分控制在70 %～72 %。糖化醅與配糟按1∶1的重量比例混合入瓶，塞上裝有2.5 mol硫酸的發(fā)酵栓，在培養(yǎng)箱中30℃發(fā)酵7 d。

1.2.4蒸餾

發(fā)酵結(jié)束后，取1000 g發(fā)酵酒醅，利用小型蒸餾器蒸餾，接取溜出液50 mL。

1.2.5酵母計(jì)數(shù)

為防止發(fā)酵過(guò)程中污染酵母影響米根霉代謝產(chǎn)物的分析，對(duì)發(fā)酵結(jié)束后酒醅樣品進(jìn)行酵母計(jì)數(shù)。取發(fā)酵結(jié)束后的酒醅，稱(chēng)10 g樣品于100 mL無(wú)菌生理鹽水中，150 r/min振蕩30 min，在無(wú)菌操作臺(tái)上吸取200 μL菌懸液，均勻涂布在YPD平板上，30℃培養(yǎng)2～3 d后計(jì)數(shù)。平板計(jì)數(shù)以30～300個(gè)菌落數(shù)為有效數(shù)值。

1.2.6氣相色譜檢測(cè)

溜出液利用氣相色譜儀檢測(cè)微量成分組成及含量，具體方法見(jiàn)文獻(xiàn)[4]。

2　結(jié)果與分析

2.1酵母計(jì)數(shù)

培養(yǎng)3 d后，各酒醅樣品中酵母計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)組和空白組在發(fā)酵過(guò)程中均有樣品出現(xiàn)酵母感染的現(xiàn)象，尤以實(shí)驗(yàn)組1和空白組8感染酵母較多，不可計(jì)數(shù)。這很可能與糖化時(shí)放在恒溫培養(yǎng)箱中開(kāi)放式培菌有關(guān)，也與發(fā)酵器皿未洗干凈、酒精消毒未徹底有關(guān)。但實(shí)驗(yàn)組2—6，空白組7未受酵母污染，具有實(shí)驗(yàn)意義。

表1 發(fā)酵結(jié)束時(shí)酒醅中酵母在YPD平板上數(shù)量

2.2色譜數(shù)據(jù)分析

2.2.1米根霉G12產(chǎn)酒精能力分析

將發(fā)酵結(jié)束蒸餾得出的餾液進(jìn)行酒精度檢測(cè)，折算成55 %vol出酒率情況見(jiàn)表2。實(shí)驗(yàn)組1酒精度和出酒率都比其他組高，這與該實(shí)驗(yàn)組污染大量酵母有關(guān)。實(shí)驗(yàn)組2—6酒精度和出酒率相差不大，平均出酒率為12.01 %?？瞻捉M理論酒精度和出酒率應(yīng)該為0 %，由于空白組8感染酵母原因，導(dǎo)致酒精度和出酒率比理論值高。由此可以判斷，米根霉G12不僅具有糖化功能，還有一定的產(chǎn)酒精能力，與文獻(xiàn)報(bào)道相吻合。

表2 各酒醅樣品酒精度及折55 %vol出酒率情況

2.2.2米根霉G12產(chǎn)酯、產(chǎn)雜醇油能力分析

清香型小曲白酒主體香味成分為乙酸乙酯，由表3可知，米根霉G12代謝產(chǎn)乙酸乙酯能力非常弱，平均為5.84 mg/100 mL，說(shuō)明該菌株對(duì)小曲白酒酯香無(wú)貢獻(xiàn)作用；該菌株代謝生成正丙醇平均值為39.19 mg/100 mL、雜醇油平均值為97.99 mg/100 mL，空白值為0，說(shuō)明該菌株具有較強(qiáng)的產(chǎn)正丙醇和雜醇油能力。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，正丙醇和雜醇油均是酵母代謝產(chǎn)酒精的副產(chǎn)物，其中降低雜醇油含量方法之一就是選育低產(chǎn)雜醇油的酵母菌株。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)米根霉也具有產(chǎn)雜醇油的能力，說(shuō)明其對(duì)小曲白酒中雜醇油的生成有一定的貢獻(xiàn)作用。

表3 各酒醅樣品代謝產(chǎn)酯及雜醇油情況

3　結(jié)論

研究了純種根霉曲以高粱為原料在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行小試固態(tài)發(fā)酵，對(duì)發(fā)酵結(jié)束后蒸餾得出的餾液進(jìn)行分析，得出米根霉G12具有較強(qiáng)的產(chǎn)酒能力，產(chǎn)酒平均出酒率為12.10 %。同時(shí)根霉G12在固態(tài)發(fā)酵中也能產(chǎn)生大量正丙醇與雜醇油，因而對(duì)小曲白酒中雜醇油的生成有一定的促進(jìn)作用。說(shuō)明雜醇油的生成菌株不一定全是酵母，可以拓寬思路為降低小曲白酒中雜醇油途徑提供不同的方法。

參考文獻(xiàn)：

[1]李銳利.高產(chǎn)乙酸乙酯酵母的選育及在清香型小曲酒中的應(yīng)用研究[D].武漢：湖北工業(yè)大學(xué), 2011.

[2]楊強(qiáng),王衍,童國(guó)強(qiáng).清香型小曲酒的香味組分特點(diǎn)及風(fēng)味特征[J].釀酒科技, 2001(2)：75-76.

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[4]王海瑞，陳軍.氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定白酒中高級(jí)醇與酯類(lèi)[J].農(nóng)產(chǎn)品加工（學(xué)刊）,2014,361(8)：54-56.

Analysis of the Metabolites of a Rhizopus oryzae Strain in Solid-State Fermentation

YANG Yukun1and TANG Jie2
（1.No.1 Middle School of Daye, Daye, Hubei, 435100；2.Jingpai Co. Ltd., Daye, Hubei 435100, China）

Abstract：To analyze the metabolites of the Rhizopus oryzae strain G12(isolated from Xiaoqu Baijiu) in solid-state fermentation, we simulated the solid-state fermentation techniques of Xiaoqu Baijiu and built a small-scale testing platform in the laboratory. With purebred Rhizopus oryzae as starter, we measured the main volatile components of the distillate after saccharification, fermentation and distillation, while the control group was without starter. The results showed that, Rhizopus oryzae G12 had strong alcohol-producing ability, with the average liquor yield of 12.10 %. Meanwhile, the strain produced a large amount of n-propanol and fusel oils in solid-state fermentation, which contributed to the generation of fusel oils. The study provided a different idea for the reducing of the content of fusel oils in Xiaoqu Baijiu. (Trans. by HUANG Xiaoli)

Key words：Rhizopus oryzae; solid-state fermentation; metabolites analysis; Baijiu

作者簡(jiǎn)介：楊雨琨，學(xué)生。

收稿日期：2016-03-01

DOI：10.13746/j.njkj.2016063

中圖分類(lèi)號(hào)：TS261.1；TS262.3；TS261.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-9286（2016）04-0122-03

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-03-14；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160314.1133.001.html。