二苯乙烯苷及其β-環(huán)糊精包合物的穩(wěn)定性研究

王文靜　劉冬麗　王葳　魏澤英

650500　昆明，云南中醫(yī)學院中藥學院[王文靜、劉冬麗(碩士研究生)、王葳、魏澤英]

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·論著·

二苯乙烯苷及其β-環(huán)糊精包合物的穩(wěn)定性研究

王文靜劉冬麗王葳魏澤英

650500昆明，云南中醫(yī)學院中藥學院[王文靜、劉冬麗(碩士研究生)、王葳、魏澤英]

【摘要】目的明確影響二苯乙烯苷及其β-環(huán)糊精包合物穩(wěn)定性的因素。 方法以β-環(huán)糊精與二苯乙烯苷用量比、包合時間、包合溫度為影響因素，按L9(34)正交實驗篩選包合條件；利用高效液相色譜法，以二苯乙烯苷含量為指標，分別考察了人工胃液、人工腸液及醋酸-醋酸鈉緩沖液、氨-氯化銨緩沖液、光照對二苯乙烯苷及其β-環(huán)糊精包合物穩(wěn)定性的影響。 結果(1)根據(jù)正交實驗結果，確定最佳包合條件為：8倍量的β-環(huán)糊精，包合時間為2小時，包合溫度為35℃；(2)12小時內(nèi)，二苯乙烯苷未包合物的含量在人工胃液中由100%下降至79.7%，在醋酸-醋酸鈉緩沖液中由100%下降至15.9%；β-環(huán)糊精包合物中二苯乙烯苷含量在人工胃液中1小時達到100%，在醋酸-醋酸鈉緩沖液中2小時達到100%，隨后受酸度影響逐漸下降。二苯乙烯苷未包合物在人工腸液及氨-氯化銨緩沖液中的穩(wěn)定性差，幾乎無法存在；其β-環(huán)糊精包合物的穩(wěn)定性有所改善，在腸液中0.5小時含量達95.8%，之后未檢出；在堿性緩沖液中4小時達到峰值，6小時后未檢出。光照條件下，48小時后二苯乙烯苷的含量由100%下降至50.2%；β-環(huán)糊精包合物的含量在實驗條件下明顯得到改善，48小時后含量仍可達90.5%。 結論二苯乙烯苷及其β-環(huán)糊精包合物在酸性環(huán)境下較堿性條件下穩(wěn)定；在酸性溶液中，隨著溶液酸性增強，其穩(wěn)定性變差；β-環(huán)糊精包合物的穩(wěn)定性明顯強于未包合物，說明利用β-環(huán)糊精對二苯乙烯苷進行包合可以在一定程度上使其穩(wěn)定。

【關鍵詞】二苯乙烯苷；β-環(huán)糊精包合物；何首烏；穩(wěn)定性；含量測定

何首烏為蓼科植物何首烏PolygonummultiflorumThumb.的干燥塊根，是常用補益中藥，二苯乙烯苷是其主要化學成分[1-3]，具有降血脂、抗動脈粥樣硬化、抗衰老等作用，應用前景較好，但由于其穩(wěn)定性較差[4-6]，在一定程度上限制了對其開發(fā)利用。就給藥途徑看，何首烏主要通過口服給藥，因此課題組考察了人工胃液、人工腸液、醋酸-醋酸鈉緩沖液、氨-氯化銨緩沖液等對二苯乙烯苷及其包合物穩(wěn)定性的影響。

1材料與方法

1.1試劑

二苯乙烯苷對照品(批號：0844-200003)購于中國藥品生物制品檢定所；二苯乙烯苷樣品(自制，98.77%)；β-環(huán)糊精(批號：T20140424)購于中國醫(yī)藥(集團)上?；瘜W試劑公司；甲醇、乙腈購于德國Merk公司(色譜純)；實驗用水為石英二次重蒸水，其余試劑均為分析純。

1.2儀器

U-3000型高效液相色譜儀(美國Dionex公司)；YSEI藥品穩(wěn)定性試驗箱(重慶市永生實驗儀器廠)；UV-2450型紫外-可見分光光度計(日本島津公司)；pH-10型酸度計(德國賽多利斯)；先行者CP214型分析天平(上海奧豪斯儀器有限公司)。

1.3色譜條件及含量測定

C18色譜柱：(150 mm×0.5 mm，0.45 μm)，phelomen公司；流動相：乙腈-水(25︰75，V︰V)；檢測波長：320 nm；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL/min[2-3]。采用高效液相色譜(HPLC)測定[2-3,7]，進樣10 μL，檢測二苯乙烯苷的含量變化。

1.4對照品及供試品溶液的制備

對照品溶液的制備：精密稱取二苯乙烯苷對照品11.0 mg，置于10 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容，制成1.10 mg/mL的對照品溶液，備用。

供試品溶液的制備：精密稱取自制二苯乙烯苷樣品2.2 mg，置于10 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容，制成0.22 mg/mL的供試品溶液，備用。

1.5線性范圍、精密度及穩(wěn)定性考察

取對照品溶液適量，分別配制成濃度為0.22、0.44、0.66、0.88、1.10、2.20和3.30 μg/μL的標準品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，置于樣品瓶中，HPLC測定，自動進樣，進樣體積為5.0 μL?；貧w分析，標準曲線為A = 6820.20 m+24.20(r=0.9996)，A為峰面積，m為進樣質量(μg)。即進樣量在1.1～16.5 μg之間線性關系良好。

儀器精密度考察：取上述對照品溶液，在測定條件下進樣5 μL，連續(xù)進樣6次，其峰值面積相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)為0.12%，表明儀器精密度良好。

標準品溶液穩(wěn)定性考察：取上述對照品溶液，在測定條件下進樣5 μL，分別于0天、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天時考察峰面積的變化，其RSD為1.29%。結果表明，二苯乙烯苷溶液在7天內(nèi)穩(wěn)定。

1.6理論塔板數(shù)

色譜條件及系統(tǒng)適用性實驗：C18色譜柱150 mm×0.5 mm，0.45 μm，phelomen公司；以乙腈-水(25︰75，V︰V)為流動相；檢測波長為320 nm。理論塔板數(shù)按2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷計算，不低于3500。分離度均大于1.5，拖尾因子均在0.95～1.05之間。

1.7β-環(huán)糊精包合二苯乙烯苷條件優(yōu)化

通過預實驗結果，以β-環(huán)糊精為主體，二苯乙烯苷為客體，飽和水溶液法進行包合實驗。以β-環(huán)糊精與二苯乙烯苷用量比、包合時間、包合溫度為影響因素，按L9(34)正交實驗篩選包合條件。因素水平設計見表1，實驗安排見表2，方差分析見表3。

操作方法：取一定量β-環(huán)糊精，加水1500 mL，50℃水浴中溶解，置磁力攪拌器上攪拌，轉速500 rpm；取二苯乙烯苷樣品10.0 g，用15.0 mL蒸餾水溶解，緩慢滴加進β-環(huán)糊精的水溶液中，按相應的時間和溫度進行包合實驗[8～10]。按1.3項下方法對包合物進行定性和定量檢測。

表1　二苯乙烯苷包合正交實驗因素水平表

表2　二苯乙烯苷提取工藝正交實驗表

注： 包合率=(包合物中藥物的量/藥物投藥總量)×100%

表3　實驗結果方差分析

注： F0.05(2,6)=5.14；*P<0.05

1.8統(tǒng)計學處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件對正交實驗進行多因素方差分析，比較因子水平變化對指標實驗的顯著差別的影響。根據(jù)結果分析，其中因素A對包合實驗的影響最大。

1.9二苯乙烯苷及其包合物的穩(wěn)定性實驗

1.9.1二苯乙烯苷及其包合物在人工胃液及人工腸液中的穩(wěn)定性分別取二苯乙烯苷及其包合物樣品2.3 mg和31.5 mg，置25 mL容量瓶中，分別用人工胃液、人工腸液溶解，定容，置于37.5℃水浴中保溫，按HPLC測定條件分別測定其在0小時、0.5小時、1.0小時、2.0小時、4.0小時、6.0小時、8.0小時、12.0小時、24.0小時、48.0小時二苯乙烯苷含量變化。

1.9.2二苯乙烯苷及其包合物在醋酸鹽和氨-氯化銨緩沖液中的穩(wěn)定性分別配制醋酸-醋酸鈉緩沖液和氨-氯化銨緩沖液，pH值分別為5.0和9.0，備用。按1.9.1項方法實驗，測定二苯乙烯苷的含量變化。

1.9.3光照條件下二苯乙烯苷的穩(wěn)定性將二苯乙烯苷樣品置于光照試驗箱內(nèi)，強光照條件下，與1.9.1項時間設定相同，分別考察二苯乙烯苷的含量變化。

2結果

2.1β-環(huán)糊精包合二苯乙烯苷條件

由表2可見，提取二苯乙烯苷的較佳工藝條件是A2B3C1組合。方差分析表3表明，包合溫度(因素C)和包合時間(因素B)有較小的影響，β-環(huán)糊精與二苯乙烯苷用量比例(因素A)有顯著影響。綜合分析，最佳包合條件為用8倍量的β-環(huán)糊精，包合時間為2.0小時，包合溫度為35℃。

2.2不同介質中二苯乙烯苷及其包合物的穩(wěn)定性

二苯乙烯苷及其包合物在人工胃液中穩(wěn)定性較好，48小時后，仍有50%左右可檢出。但在人工腸液中，二苯乙烯苷樣品穩(wěn)定性差，幾乎沒有檢出；二苯乙烯苷包合物的穩(wěn)定性有所改善，0.5小時后達95.8%，之后未檢出。結果見表4和圖1的A、B。

二苯乙烯苷及其包合物在醋酸鹽緩沖液中，24小時內(nèi)穩(wěn)定性較好，之后穩(wěn)定性較差。在氨-氯化銨緩沖液中，二苯乙烯苷樣品穩(wěn)定性差，不能檢出；但二苯乙烯苷包合物的穩(wěn)定性在3小時內(nèi)明顯改善，但之后穩(wěn)定性變差，6小時后未檢出。結果見表4和圖1的C、D。

表4　二苯乙烯苷及其包合物在不同條件下的穩(wěn)定性±s，%，n=5)

注： 1#：二苯乙烯苷樣品；2#：二苯乙烯苷包合物樣品。

圖1　二苯乙烯苷在不同環(huán)境中的HPLC圖

在人工腸液及氨-氯化銨緩沖液中的二苯乙烯苷及其包合物的色譜峰均無法檢測到，說明二苯乙烯苷對堿性環(huán)境敏感，易分解或轉化，因此，分別考察了不同堿性環(huán)境對二苯乙烯苷穩(wěn)定性的影響。結果表明，二苯乙烯苷在堿性環(huán)境中 (pH≥9) 穩(wěn)定性較差，不能以原形式存在。結果見表4和圖1的B、D。

在光照條件下，二苯乙烯苷包合物的穩(wěn)定性明顯強于未包合物。

分析結果表明，二苯乙烯苷在酸性環(huán)境下的穩(wěn)定性較在堿性環(huán)境下好；而在醋酸-醋酸鈉緩沖液中的穩(wěn)定性又較在胃液中的穩(wěn)定性好，即隨著酸性增強，二苯乙烯苷變得不穩(wěn)定。

3討論

二苯乙烯苷具有多種藥理作用，近年來其抗癌活性及相關化學研究報道也較多[11～14]，但其穩(wěn)定性較差，一定程度上限制了對其開發(fā)利用。因此，有必要對二苯乙烯苷的吸收及代謝形式進行系統(tǒng)考察。

本文從“模擬人體環(huán)境”的胃腸液及酸堿性、光照等化學及存貯環(huán)境的影響對二苯乙烯苷的含量進行了分析。二苯乙烯苷及其包合物在人工胃液及醋酸-醋酸鈉緩沖液中的穩(wěn)定性均較好，但相比之下，β-環(huán)糊精包合物的二苯乙烯苷量在胃液和醋酸緩沖液中分別在1.0小時和2.0小時達到峰值；二苯乙烯苷在人工腸液及氨-氯化銨緩沖液中的穩(wěn)定性差，幾乎無法存在(放置5分鐘后即無法檢測到其紫外吸收)。結果表明，二苯乙烯苷在酸性環(huán)境下的穩(wěn)定性較在堿性環(huán)境下好；而在醋酸-醋酸鈉緩沖液中的穩(wěn)定性又較在胃液中的穩(wěn)定性好，即隨著酸性的增強，二苯乙烯苷會變得更加不穩(wěn)定。β-環(huán)糊精包合物的穩(wěn)定性又與堿性強弱有關，因此，在一定程度上保護了二苯乙烯苷的有效存在。光照條件對二苯乙烯苷的穩(wěn)定性也有一定影響，β-環(huán)糊精包合物可以改善人體環(huán)境及光照等因素對二苯乙烯苷穩(wěn)定性造成的影響。

二苯乙烯苷是中藥何首烏的主要有效成分之一，傳統(tǒng)用藥方式為水煎煮或者制成“藥酒”，傳統(tǒng)給藥方式以口服為主，二苯乙烯苷進入體內(nèi)后吸收程度如何，是否發(fā)生變化，到達靶器官的作用形式是什么等，這些問題有待今后的深入探討。體外實驗結果表明，二苯乙烯苷在人工腸液中穩(wěn)定性較差，提示二苯乙烯苷在體內(nèi)可能并不以原形式吸收和發(fā)揮藥效。苷類物質由于其結構的不穩(wěn)定性在體內(nèi)主要以代謝物存在，代謝物是其藥效的主要來源，二苯乙烯苷在體內(nèi)生物和化學環(huán)境下會發(fā)生什么樣的變化，以何種形式作用于靶點，有待進一步的體內(nèi)代謝研究。

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(本文編輯： 韓虹娟)

The stability study of stilbene glucoside and its β-cyclodextrin inclusion complex

WANGWen-jing，LIUDong-li，WANGWei,etal.

FacultyofChineseMateriaMedica,YunnanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Kunming650500,China

【Abstract】ObjectiveTo make certain the influence factors of affecting the stability of stilbene glucoside and its β-cyclodextrin inclusion complex. MethodsThe β-cyclodextrin inclusion of stilbene glucoside was conducted according to an L9(34) orthogonal experiment design with three factors, namely the ratio of β-cyclodextrin amount to stilbene glucoside, the time and temperature of inclusion. The contents of stilbene glucoside were detected by HPLC in a simulated gastric fluid, a simulated intestinal fluid, an acetic acid-sodium acetate buffer solution, an ammonia-ammonium chloride buffer solution, and under illumination, respectively. Results1. Optimal inclusion conditions from orthogonal experiments were an amount of β-cyclodextrin 8 times as much as that of stilbene glucoside, an inclusion time was 2.0 h and inclusion temperature was 35℃. 2. The content of stilbene glucoside without β-cyclodextrin inclusion in the simulated gastric fluid went down from 100% to 79.7% in 12.0h, and in the acetic acid-sodium acetate buffer solution declined from 100% to 15.9%. The content of the β-cyclodextrin inclusion complex of stilbene glucoside in the simulated gastric fluid went up to 100% in 1.0 h and 2.0h in the acetic acid-sodium acetate buffer solution, and afterwards went down gradually influenced by the acidity of the fluid. Stilbene glucoside without β-cyclodextrin inclusion was very unstable in the simulated intestinal fluid and the ammonia-ammonium chloride buffer solution. The β-cyclodextrin inclusion complex of stilbene glucoside was more stable, and the content was reached 95.8% in the simulated intestinal fluid in 0.5h, and became undetectable afterwards, and it was reached peaked in 4.0 h and became undetectable in 6.0 h in the alkaline solution. Under illumination, the content of stilbene glucoside without β-cyclodextrin inclusion went down from 100% to 50.2% in 48.0h, and its β-cyclodextrin inclusion complex was more stable with the content of 90.5% in 48.0h. ConclusionStilbene glucoside and its β-cyclodextrin inclusion complex are more stable in an acid solution than in an alkaline solution. In acid solution, the stability becomes weaker with the increment of the acidity. The stability of the β-cyclodextrin inclusion complex of stilbene glucoside is stronger than without β-cyclodextrin conclusion. β-cyclodextrin can be used to make stilbene glucoside more stable as an inclusion complex.

【Key words】Stilbene glucoside；β-cyclodextrin inclusion complex；Polygonum multiflorum；Stability；Determination of content

(收稿日期：2016-01-15)

Corresponding author:WEI Ze-ying, E-mail: janewei7@hotmail.com

【中圖分類號】R932

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.04.008

作者簡介:王文靜(1977- )，女，博士，副教授。研究方向：中藥化學成分及質量控制研究。E-mail: notoww@163.com通訊作者： 魏澤英(1964- )，女，碩士，副教授。研究方向：中藥化學成分及質量控制研究。E-mail: janewei7@hotmail.com

基金項目：國家自然科學基金(81060337)