亞麻L(zhǎng)usiCesA1上調(diào)基因表達(dá)研究

吳建忠（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，哈爾濱　150086）

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亞麻L(zhǎng)usiCesA1上調(diào)基因表達(dá)研究

吳建忠
（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，哈爾濱150086）

摘要：研究通過(guò)克隆亞麻纖維素合成酶LusiCesA1基因，利用抑制差減雜交（SSH）技術(shù)，以DIANE LusiCesA1基因敲除RNA為T(mén)ester，常規(guī)RNA為Driver，構(gòu)建亞麻纖維素合成酶cDNA文庫(kù)，逆向斑點(diǎn)雜交驗(yàn)證陽(yáng)性克隆，篩選差異表達(dá)克隆，鑒定出LusiCesA1上調(diào)表達(dá)增強(qiáng)基因122個(gè)，其中95個(gè)與已知功能基因同源，其余27個(gè)未知同源序列推斷為亞麻纖維素合成途徑新基因。LusiCesA1是亞麻纖維素合成途徑關(guān)鍵酶基因，通過(guò)其上調(diào)表達(dá)作用機(jī)理分析，挖掘纖維合成過(guò)程上調(diào)表達(dá)基因，可改良亞麻品種。

關(guān)鍵詞：亞麻；LusiCesA1；上調(diào)表達(dá)；差減雜交

吳建忠.亞麻L(zhǎng)usiCesA1上調(diào)基因表達(dá)研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2016,47(3):44-51.

WU Jianzhong.Study on gene up-regulation expression of LusiCesA1 in flax[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(3):44-51.(in Chinese with English abstract)

亞麻（Linum usitatissimum L.）是世界主要韌皮纖維經(jīng)濟(jì)作物之一，在紡織、化工、建材、裝飾、醫(yī)藥等行業(yè)廣泛應(yīng)用，經(jīng)濟(jì)附加值較高[1]。我國(guó)亞麻生產(chǎn)存在出麻率低、纖維品質(zhì)差等問(wèn)題。通過(guò)對(duì)亞麻纖維產(chǎn)量相關(guān)性狀分析表明，纖維產(chǎn)量提高首先要考慮原莖高產(chǎn)[2]，目前傳統(tǒng)育種手段很難在短時(shí)間內(nèi)取得顯著成效，分子克隆手段可彌補(bǔ)亞麻育種這一空缺，因此克隆亞麻纖維素合成途徑關(guān)鍵基因，揭示其分子控制機(jī)理，探索其上調(diào)表達(dá)相關(guān)基因，可為從基因源頭獲得優(yōu)質(zhì)、高纖維亞麻新品種奠定基礎(chǔ)。

纖維素合成酶在亞麻纖維素合成途徑中起重要作用，探明纖維素合成酶關(guān)鍵基因作用機(jī)理，研究其在亞麻纖維合成過(guò)程中調(diào)控表達(dá)模式，對(duì)亞麻品種改良具有指導(dǎo)性作用。因此，研究纖維素合成酶（CesA）基因具有重要意義。纖維素合成酶基因編碼纖維素合成酶的催化亞基，轉(zhuǎn)錄范圍3.0～3.5 kb，其內(nèi)含子和外顯子邊界區(qū)域高度保守，基因結(jié)構(gòu)差異取決于內(nèi)含子數(shù)量。目前已有研究證明，初生、次生細(xì)胞壁形成過(guò)程中，纖維素合成涉及不同纖維素合成酶。但每個(gè)纖維素合成酶彼此相關(guān)、協(xié)同作用，CesA已形成一個(gè)龐大的基因家族。纖維素合成酶CesA1是該酶家族重要成員，擬南芥纖維素合成酶AtCesA1序列結(jié)構(gòu)特點(diǎn)已被深入解析[3-4]。一個(gè)類(lèi)似于鋅指狀或LIM轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)象存在于植物纖維素合成酶N末端[5-6]，A區(qū)和B區(qū)是植物纖維素合成酶基因特有保守區(qū)，A區(qū)含有幾個(gè)保守天冬氨酸殘基，B區(qū)則與纖維素催化活性有關(guān)，另外，纖維素合成酶基因8個(gè)跨膜區(qū)是β-1，4-葡萄糖苷鏈穿過(guò)質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞壁重要通道[7]。

目前國(guó)內(nèi)外已對(duì)擬南芥[8-9]、棉花[10]、楊樹(shù)[11-13]、玉米[14-15]等植物纖維素合成酶基因開(kāi)展大量研究，擬南芥AtCesA1基因幾乎在植物各個(gè)部位均有表達(dá)，且表達(dá)水平遠(yuǎn)高于其他同族基因，對(duì)初生壁纖維素合成起重要作用。楊樹(shù)PtrCesA1在木質(zhì)部與韌皮部高度表達(dá)，在植物細(xì)胞次生壁高質(zhì)量纖維素合成中起關(guān)鍵作用[16]。苧麻中纖維素合成酶基因BnCesA1已成功克隆并表達(dá)分析，推測(cè)該基因參與苧麻細(xì)胞初生和次生細(xì)胞壁纖維素合成[17]。

2000年國(guó)內(nèi)首次報(bào)道亞麻轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)研究[18]，成功獲得再生植株，建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的亞麻轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，在利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育亞麻新品種選育工作中發(fā)揮作用[19]。近年，亞麻纖維素合成酶基因LusiCesA1已被成功克隆[20-22]，GenBank登錄號(hào)：EF214742，研究表明，LusiCesA1在亞麻各個(gè)部位均有表達(dá)，表達(dá)水平遠(yuǎn)高于纖維素合成酶基因家族中其他基因，因此該基因作用機(jī)理對(duì)整個(gè)亞麻纖維素合成具有重要作用。但亞麻纖維素合成研究有待深入，僅依據(jù)部分基因片段分析并不能對(duì)基因功能和基因調(diào)控研究做詳細(xì)了解，因此，獲得LusiCesA1基因全長(zhǎng)序列，進(jìn)一步深入研究其表達(dá)與調(diào)控基因，將為亞麻纖維素生物合成及功能分析奠定基礎(chǔ)。本研究通過(guò)基因敲除手段獲得亞麻L(zhǎng)usiCesA1缺失突變體，構(gòu)建SSH抑制消減文庫(kù)，篩選差異表達(dá)序列進(jìn)行BLAST比對(duì)及功能注釋?zhuān)瑴y(cè)定分析上調(diào)表達(dá)cDNA片段，檢測(cè)目標(biāo)基因調(diào)控因子，發(fā)掘其調(diào)控基因，為亞麻纖維素合成研究提供新思路。

1　材料與方法

1.1材料

本研究在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所亞麻基因工程實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，纖維型亞麻DIANE莖干采自黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞麻試驗(yàn)圃，超低溫冰箱保存后試劑盒（Plant RNA Kit，Omega）提取RNA。逆轉(zhuǎn)錄酶、Eco R I均購(gòu)自Promega公司，TaKaRa LA Taq聚合酶、TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit、T4DNA連接酶、耐熱性DNA聚合酶LA Taq?DNA Polymerase、pMD18-T均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，NA凝膠回收試劑盒：AxyPrepTM，Axygen Biosciences，Inc，USA；化學(xué)試劑均為分析純。

大腸桿菌JM109（購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司）由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所保存。LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，菌懸液中加15%甘油于-80℃保存。載體pMD18-T，-20℃保存。質(zhì)粒提取溶液參照文獻(xiàn)[21]配制。

1.2方法

1.2.1亞麻L(zhǎng)usiCesA1基因克隆及功能驗(yàn)證

1.2.1.1亞麻L(zhǎng)usiCesA1基因克隆

本研究室前期已克隆亞麻L(zhǎng)usiCesA1基因[22]，為深入研究該基因，在已知全長(zhǎng)cDNA序列上設(shè)計(jì)引物，利用PCR擴(kuò)增LusiCesA1基因gDNA，擴(kuò)增方法參照文獻(xiàn)[21]。利用軟件Primer Primier 5.0和Oligo 6設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物WDNA-sense和WDNA-anti。PCR引物序列如下：

WDNA- sense:5'GTCTCGGGCACCTTCGCTAT CC 3'

WDNA-anti：5'CCCCGATATCCAGGGAGGTG 3'

取4 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，1.5%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳，5 V·cm-1下電泳30 min，溴化乙錠染色10 min后，凝膠成像系統(tǒng)上檢測(cè)并拍照。

1.2.1.2 Inverse-PCR擴(kuò)增LusiCesA1基因gDNA側(cè)翼序列

酶切反應(yīng)參照TaKaRa公司產(chǎn)品目錄，反應(yīng)體系置于37℃下反應(yīng)10 h，將產(chǎn)物于65℃放置1 h，使內(nèi)切酶失活后連接，微量離心管中制備連接反應(yīng)液（10×T4DNA Ligase Buffer 15 μL、T4DNA Ligase 1 μL、酶切產(chǎn)物DNA 95 μL、ddH2O補(bǔ)至150 μL），反應(yīng)體系置于16℃下水浴4 h，回收連接產(chǎn)物，補(bǔ)水至500 μL，等體積氯仿/苯酚（V/V= 1/1）抽提1次，12 000 r·min-1離心10 min，棄上清，再用-20℃預(yù)冷100%乙醇洗滌1遍，置37℃干燥10 min后，30 μL 1×TE溶解10 min。

巢式PCR擴(kuò)增設(shè)計(jì)引物見(jiàn)表1，DNA聚合酶使用LA Taq?DNA聚合酶，具體使用方法參照說(shuō)明書(shū)。以L(fǎng)O1RO1和LO2RO2外引物對(duì)第一次PCR，一擴(kuò)產(chǎn)物稀釋50倍后，以L(fǎng)I3RI3和LI4RI4內(nèi)引物對(duì)第二次PCR，擴(kuò)增反應(yīng)體系同第一次PCR。

1.2.1.3目的片段回收及純化

將二次PCR得到擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，分離片段參考試劑盒說(shuō)明書(shū)回收目標(biāo)片段。

1.2.1.4重組質(zhì)粒提取、鑒定、保存及測(cè)序

將回收純化DNA和克隆載體pMD18-T相連接，連接體系如下：4.5 μL DNA，0.5 μL載體pMD18-T，5 μL solution，16℃水浴連接過(guò)夜，重組質(zhì)粒熱激轉(zhuǎn)化法構(gòu)建和大腸桿菌感受態(tài)制備，經(jīng)PCR鑒定的陽(yáng)性克隆送蘇州金唯智生物科技有限公司（GENEWIZ）測(cè)序。

1.2.1.5克隆序列分析

1.2.2利用SSH技術(shù)構(gòu)建亞麻纖維素合成酶基因功能cDNA文庫(kù)

1.2.2.1亞麻葉片mRNA分離

利用試劑盒抽提RNA，經(jīng)回收純化后，采用寡聚（dT）纖維素柱（Oligo dT Cellulose）mRNA層析純化，mRNA純化方法參照Promega公司PolyATtract?mRNAIsolation Systems操作，具體操作步驟見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.2.2 cDNA文庫(kù)構(gòu)建

以分離的mRNA為模板，根據(jù)BD PCR-Select?cDNA Subtraction Kit（Cat.No.637401）和BD AdvantageTMcDNA Polymerase Mix（Cat.No.639105）完成LusiCesA1基因cDNA差減抑制性雜交。以玻璃紙上亞麻葉片cDNA作為Driver，亞麻葉片cDNA作為T(mén)ester，構(gòu)建LusiCesA1基因正向SSH cDNA文庫(kù)；同理構(gòu)建LusiCesA1基因反向SSH cDNA文庫(kù)。

表1　PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)Table 1 Designed primer of PCR amplification

1.2.3 SSH cDNA文庫(kù)克隆插入片段檢測(cè)

二次PCR產(chǎn)物經(jīng)回收試劑盒純化后用于T載體連接，方法參照文獻(xiàn)[1]。連接產(chǎn)物與大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109混勻置冰上1 min后電擊轉(zhuǎn)化，加入1 mL SOC培養(yǎng)液37℃150 r·min-1振蕩培養(yǎng)1 h。采用PCR擴(kuò)增檢測(cè)插入片段大小。

究其原因，非洲的工業(yè)基礎(chǔ)非常薄弱，很多國(guó)家只能生產(chǎn)一些初級(jí)工業(yè)品，主要依靠出口原材料來(lái)?yè)Q取工業(yè)制成品和消費(fèi)品，因此商品匱乏，物價(jià)昂貴。

PCR反應(yīng)體系為：1×PCR buffer（含Mg2+）2.0 μL，10 mmol·L-1dNTPs 1 μL，10 mmol·L-1隨機(jī)引物各1 μL，1 U TaqDNA聚合酶，1 μL過(guò)夜培養(yǎng)的新鮮組培，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃變性5 min；95℃30 s，68℃30 s，72℃1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃完全延伸10 min。PCR結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)插入片段大小。

2　結(jié)果與分析

2.1 LusiCesA1基因gDNA的PCR擴(kuò)增

利用引物WDNA-sense & WDNA-anti對(duì)亞麻DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收產(chǎn)物并測(cè)序，獲得1.825×103bp的gDNA部分片段（見(jiàn)圖1）。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)與實(shí)驗(yàn)室前期得到的cDNA片段相比，gDNA多53 bp，推定為內(nèi)含子?？俁NA抽提完畢后0.8%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)其完整性，紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度。

圖1　PCR擴(kuò)增LusiCesA1基因gDNA片段Fig.1 gDNA fragment of PCR amplified LusiCesA1 gene

2.2 LusiCesA1基因gDNA側(cè)翼序列Inverse-PCR擴(kuò)增

采用Inverse-PCR技術(shù)擴(kuò)增LusiCesA1基因雙側(cè)序列，產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖2和3所示。SacⅠ對(duì)亞麻基因組DNA酶切后PCR擴(kuò)增的二擴(kuò)產(chǎn)物中，LusiCesA1基因左側(cè)序列有一條約2.2×103bp帶紋，右側(cè)序列有一條約3.2×103bp帶紋，分別將回收產(chǎn)物轉(zhuǎn)入克隆載體pMD18-T，測(cè)序拼接。

2.3 LusiCesA1基因序列全長(zhǎng)及相關(guān)分析

通過(guò)Inverse-PCR擴(kuò)增和序列拼接，最后得到全長(zhǎng)共6.423×103bp的DNA序列。利用Softberry閱讀框（ORF）預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該核苷酸序列包含一個(gè)1.875×103bp完整開(kāi)放閱讀框和兩個(gè)假定內(nèi)含子，分析得出該基因全長(zhǎng)序列（從ATG到Poly A），見(jiàn)圖4。該基因推定編碼一個(gè)584氨基酸的蛋白，序列見(jiàn)圖5。編碼蛋白氨基酸序列在NCBI上進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)該序列與其他物種磷酸核糖焦磷酸轉(zhuǎn)酰胺酶（Phosphoribosylpyrophosphate amidotransferase，PRAT）具有高度同源性，編碼蛋白命名為L(zhǎng)USICESA1。

圖2　Inverse-PCR擴(kuò)增LusiCesA1基因gDNA左側(cè)序列Fig.2 Left sequence of gDNA from inverse-PCR amplified LusiCesA1 gene

圖3　Inverse-PCR擴(kuò)增LusiCesA1基因gDNA右側(cè)序列Fig.3 Right sequence of gDNA from inverse-PCR amplified LusiCesA1 gene

2.4差減文庫(kù)構(gòu)建

2.4.1差減雜交產(chǎn)物選擇性PCR擴(kuò)增結(jié)果

根據(jù)BD PCR- SelectTMcDNA Subtraction Kit（Cat.No.637401），通過(guò)兩次差減雜交，進(jìn)一步富集差異表達(dá)cDNA，巢式PCR選擇性擴(kuò)增，所用PCR引物為：

primer 1：5' TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT 3'

primer 2：5'AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT 3'

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示差減產(chǎn)物選擇性PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分布在0.2～1.2 kb，為均勻彌散狀，無(wú)明顯主帶，表明接頭連接效率較好，符合建庫(kù)要求。

圖4　LusiCesA1基因序列全長(zhǎng)Fig.4 Full-length sequence of LusiCesA1gene

圖5　LusiCesA1基因推定編碼的蛋白序列Fig.5 Encoding putative protein sequence of LusiCesA1 gene

2.4.2差減雜交文庫(kù)質(zhì)量控制

純化后擴(kuò)增產(chǎn)物連接載體pMD18-T并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取白色克隆2 304個(gè)，接種于LB（含Amp）培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，克隆的擴(kuò)增檢測(cè)表明，共獲得1.536×103個(gè)插入片段，分布在0.2～0.7 kb（見(jiàn)圖6）。

圖6　亞麻L(zhǎng)usiCesA1基因SSH文庫(kù)中克隆的cDNA插入片段Fig.6 cDNA insertion fragment of the SSH Library from the LusiCesA1 gene of flax

2.5反向Northern雜交篩選差異表達(dá)克隆

將插入片段反向Northern斑點(diǎn)雜交（見(jiàn)圖7），篩選雜交后信號(hào)有變化的克隆為陽(yáng)性克隆，其代表基因片段可能與LusiCesA1基因表達(dá)相關(guān)，共獲得150個(gè)信號(hào)差異明顯克隆，占克隆總數(shù)10%。

2.6差異克隆測(cè)序及同源性分析結(jié)果

對(duì)差異克隆測(cè)序后，獲得表達(dá)量明顯增強(qiáng)的差異表達(dá)序列（ESTs）122個(gè)，利用DNAMAN軟件去除載體序列，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)插入的cDNA長(zhǎng)度均在400 bp左右，與PCR擴(kuò)增結(jié)果相似。經(jīng)Blastx同源比對(duì)，共95個(gè)克隆序列與已知基因有同源性，27個(gè)克隆未搜索到同源性序列。

2.7功能分類(lèi)

結(jié)合MIPS和GO基因功能分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)所推定不同種類(lèi)MIPS基因功能分類(lèi)，結(jié)果表明，測(cè)序獲得的基因功能廣泛，分為12類(lèi)，分別涉及代謝途徑13%、蛋白質(zhì)命運(yùn)9%、蛋白質(zhì)合成8%、能量6%、信號(hào)傳導(dǎo)5%、細(xì)胞運(yùn)輸4%、細(xì)胞防御2%、轉(zhuǎn)錄1%、細(xì)胞骨架1%、調(diào)控1%、細(xì)胞循環(huán)1%和未分類(lèi)蛋白49%（見(jiàn)圖8）。根據(jù)基因功能分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)其中可能對(duì)亞麻L(zhǎng)usiCesA1基因上調(diào)表達(dá)的基因功能克隆主要有三類(lèi)：代謝途徑、蛋白質(zhì)命運(yùn)、蛋白質(zhì)合成，所占比例達(dá)30%，推斷未知功能基因（49%）中極有可能含有與LusiCesA1基因調(diào)控纖維生物合成相關(guān)的新基因。

圖7　亞麻L(zhǎng)usiCesA1基因SSH cDNA文庫(kù)差異篩選Fig.7 Differential screening of SSH cDNA library of LusiCesA1 gene

圖8　亞麻L(zhǎng)usiCesA1基因上調(diào)表達(dá)的基因功能推定（MIPS分類(lèi)）Fig.8 Function estimation of up-regulated gene of LusiCesA1

3　討　論

LusiCesA1是亞麻纖維素生物合成途徑關(guān)鍵基因，本研究在課題組前期獲得亞麻DIANE的LusiCesA1基因CDS序列基礎(chǔ)上，通過(guò)Inverse-PCR擴(kuò)增和序列拼接，首次獲得LusiCesA1基因6 423 bp 的DNA全長(zhǎng)序列，編碼一個(gè)584氨基酸的蛋白LUSICESA1，與先前報(bào)道的CesA部分序列比較[20,22]，可為探究LusiCesA1基因結(jié)構(gòu)及功能奠定基礎(chǔ)，為亞麻纖維素生物合成及調(diào)控機(jī)理深入剖析提供技術(shù)支持。

利用同源重組原理開(kāi)展LusiCesA1基因片段同源替代是靶標(biāo)基因敲除基礎(chǔ)，基因敲除技術(shù)路線(xiàn)雖不復(fù)雜，但由于亞麻內(nèi)外源DNA與靶細(xì)胞DNA序列自然發(fā)生同源重組機(jī)率較低，篩選基因敲除成功的細(xì)胞困難。本研究通過(guò)敲除LusiCesA1基因片段的同源替代序列，利用SSH文庫(kù)低豐度序列富集同時(shí)，避免敲除唯一基因目的性，結(jié)合巢式PCR技術(shù)進(jìn)行目的基因片斷特異性擴(kuò)增，一定程度上抑制非目標(biāo)序列擴(kuò)增，但篩選出的大量LusiCesA1上調(diào)控表達(dá)基因，尚需進(jìn)一步基因結(jié)構(gòu)分析及功能驗(yàn)證以確定其上調(diào)表達(dá)準(zhǔn)確性。另外，本研究中獲得150個(gè)差異克隆，僅122個(gè)差異表達(dá)序列表達(dá)量明顯增強(qiáng)，推斷這些序列均為L(zhǎng)usiCesA1上調(diào)表達(dá)基因，其中僅95個(gè)序列在數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)中獲得同源基因，但這些基因功能尚需進(jìn)一步鑒定以確定其纖維合成途徑的調(diào)控作用，其余27個(gè)片段，推斷為未知功能基因片段或已知基因一段序列。

4　結(jié)　論

經(jīng)同源基因篩選，RT-PCR方法擴(kuò)增測(cè)序獲得亞麻L(zhǎng)usiCesA1基因全長(zhǎng)，利用抑制差減雜交技術(shù)，構(gòu)建亞麻L(zhǎng)usiCesA1基因cDNA文庫(kù)，逆向斑點(diǎn)雜交驗(yàn)證陽(yáng)性克隆，獲得差異表達(dá)基因122個(gè)，其中27個(gè)為未知基因，其余95個(gè)為已知基因同源克隆。LusiCesA1是亞麻纖維素合成途徑中影響纖維產(chǎn)量和品質(zhì)關(guān)鍵酶基因，本試驗(yàn)為深入研究其分子作用機(jī)制，調(diào)控植物纖維合成功能奠定基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Musialak M,Wróbel-Kwiatkowska M,Kulma A,et al.Improving retting of fibre through genetic modification of flax to express pectinases[J].Transgenic Research,2008,17(1):133-147.

[2]吳建忠,趙茜,關(guān)鳳芝.11個(gè)亞麻品種的產(chǎn)量特征分析[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué),2012(10):18-20.

[3]Riehmond T.Higher plant cellulose synthases[J].Genome Biology,2000(4):3001.1-3001.6.

[4]李春秀,齊力旺,王建華,等.植物纖維素合成酶基因和纖維素的生物合成[J].生物技術(shù)通報(bào),2005(4):6-11.

[5]Kawagoe Y,Delmer D P.Pathways and genes involved in cellulose biosynthesis[J].Genet Eng,1997,19:63-87.

[6]Kawagoe Y,Delmer D P.Cotton CelA1 has a LIM-like Znbinding domain in theN- terminal cytoplasmic region[J].Plant Physiol,1997,114(suppl):85.

[7]Molhoj M,Ulvskov P,Degan D.Characterization of a functional soluble form of a brassica napus membrane-anehored endo-l,4-beta- glueanase heterologously expressed in Pichia pastoris[J].Plant Physiol,2001,127:678-684.

[8]Joanne E B,Charles H H,Rosemary J B,et al.Functional analysis of the cellulose synthase genes CesA1,CesA2 and CesA3 in Arabidopsis[J].Plant Physiol,2002,129:797-807.

[9]Neil G T,Rhian M H,AlisonK H,et al.Interactions among three distinct CesA proteins essential for cellulose synthesis[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(3):1450-1455.

[10]Isaac K,Yasushi K,Deborah J W,et al.Dimerization of cotton fiber cellulose synthase catalytic subunits occurs via oxidation of the zine-binding domains[J].Proc Natl Acad Sci USA,2002,99(17):11109-11114.

[11]Kalluri U C,Chandrashekhar P J.Isolation and charaeterization of a new,full- length cellulose synthase cDNA PtrCesA5 from developing xylem of aspen trees[J].J Exp Bot,2003,54(390):2187-2188.

[12]Djerbi S,Lindskog M,Arvestad L,et al.The genome sequence of black cotton wood(Populus trichocarpa)reveals 18 conserved cellulose synthase(CesA)genes[J].Planta,2005,221:739-746.

[13]李春秀,齊力旺,王建華,等.毛白楊纖維素合成酶基因（PtoCeA1）克隆、序列分析及其植物表達(dá)載體的構(gòu)建[J].中國(guó)生物工程雜志,2006,26(2):49-52.

[14]Neta H,Doron H,Tim H,et al.A comparative analysis of the plant cellulose synthase(CesA)gene family[J].Plant Physiol,2000,123:1313-1323.

[15]Laura A,Monika D,Roberto B,et al.Cellulose synthesis in maize:isolation and expression analysis of the cellulose synthase(CesA)gene family[J].Cellulose,2004(11):287-299.

[16]Joshi C P.Xylem-specific and tension stress-responsive expression of cellulose synthase genes from aspen trees[J].Appl Biochem Biotechnol,2003,105(1-3):17-25.

[17]田志堅(jiān),易蓉,陳建榮,等.苧麻纖維素合成酶基因cDNA的克隆及表達(dá)分析[J].作物學(xué)報(bào),2008,34(1):76-83.

[18]王玉富,周思君,劉燕,等.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行亞麻轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)基的研究[J].中國(guó)麻作,2000,22(l):14-16.

[19]王玉富,周思君,劉燕,等.亞麻轉(zhuǎn)基因植株的再生及生根培養(yǎng)的研究[J].中國(guó)麻作,2000,22(3):25-27.

[20]高原,陳信波,龍松華,等.亞麻纖維素合成酶及其類(lèi)蛋白基因部分序列的克隆[J].中國(guó)麻業(yè)科學(xué),2008,30(6):293-297,310.

[21]Green M R,Sambrook J.Molecular cloning:A laboratory manual(Fourth Edition)[J].State of New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,2013.

[22]吳建忠.亞麻纖維素合酶關(guān)鍵基因（LusiCesA1）的克隆[J].作物雜志,2014(6):36-38.

Study on gene up- regulation expression of LusiCesA1 in flax

WU Jianzhong(Institute of Industrial Crops,Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150086,China)

Abstract:Flax cellulose synthase gene LusiCesA1 was cloned in this study,and the gene cDNA library constructed using suppression subtractive hybridization(SSH)technique,with DIANE LusiCesA1 knockout RNA as a Tester,conventional RNA as the Driver,reverse spot hybridization test positive for cloning,to screening of differentially expressed clone,the results showed that 122 genes were obviously enhanced for LusiCesA1 up-regulated expression,of which 95 gene homology with known genes,the 27 remaining unknown homologous sequence were inferred the new genes for flax fiber synthetic.LusiCesA1 was a key enzyme gene affeced the fiber yield and quality in cellulose biosynthesis,it will play a crucial role in breed improvement through analyzed its regulated expression mechanism and regulated its function in the regulation of plant fiber synthesis process in flax.

Key words:flax; LusiCesA1; up-regulated expression; SSH

作者簡(jiǎn)介：吳建忠（1983-），男，助理研究員，博士研究生，研究方向?yàn)閬喡檫z傳育種。E-mail:wujianzhong176@163.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（31401451）；國(guó)家麻類(lèi)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)資金資助（CARS- 19- S03）；哈爾濱市科技創(chuàng)新工程青年基金（2013RFQYJ010，2013RFQYJ162）；黑龍江省農(nóng)科院創(chuàng)新重點(diǎn)基金（2014ZD014）

收稿日期：2015-12-28

中圖分類(lèi)號(hào)：S563.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1005-9369（2016）03-0044-08