兩種方法對(duì)產(chǎn)粘液型銅綠假單胞菌的藥敏試驗(yàn)探討

摘要：目的 通過(guò)兩種方法對(duì)產(chǎn)粘液型銅綠假單胞菌的藥敏試驗(yàn)進(jìn)行分析和探討。方法 應(yīng)用紙片法來(lái)檢測(cè)產(chǎn)粘液型銅綠假單胞菌的藥敏試驗(yàn)，同時(shí)應(yīng)用Vitek 2全自動(dòng)化細(xì)菌鑒定藥敏儀進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種方法的相關(guān)性。結(jié)果 158株產(chǎn)粘液型銅綠假單胞菌的藥敏試驗(yàn)紙片法和儀器法大多數(shù)的藥物還是存在顯著性差異。結(jié)論 儀器法的結(jié)果還是不可靠，建議采用紙片法或其他MIC方法來(lái)檢測(cè)產(chǎn)粘液型銅綠假單胞菌的藥敏。

關(guān)鍵詞：產(chǎn)粘液型銅綠假單胞菌；Vitek 2；全自動(dòng)化細(xì)菌鑒定藥敏儀；紙片

產(chǎn)粘液型銅綠假單胞菌是引起支氣管炎、慢性支氣管炎、支氣管擴(kuò)張并感染的重要病原菌之一。由于細(xì)菌的黏膜表面形成大量粘液-多糖藻酸鹽等，從而持續(xù)定植、形成生物膜。慢性支氣管炎急性發(fā)作患者的咯痰涂片可見(jiàn)銅綠假單胞菌形成大量微小的生物膜碎片，其周圍有大量游離的裸菌。裸菌可刺激呼吸道黏膜造成感染性炎癥[1]。由于臨床分離到的產(chǎn)粘液型銅綠假單胞菌呈上升趨勢(shì)，而我們用常規(guī)方法不易鑒定細(xì)菌和報(bào)告藥敏試驗(yàn)，為此我們嘗試采用了一種新型的肉湯稀釋法與常規(guī)的藥敏紙片法同時(shí)檢測(cè)臨床分離的158株菌株進(jìn)行鑒定和藥敏分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下：

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1菌株 來(lái)自臨床分離的158株產(chǎn)粘液型銅綠假單胞菌。均來(lái)自痰標(biāo)本，質(zhì)控菌株大腸埃希氏菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853。

1.1.2試劑與儀器 哥倫比亞血瓊脂和麥康凱、M-H瓊脂購(gòu)自伊華科技有限公司，氧化酶試劑和肉湯購(gòu)自美國(guó)的Sigma公司，藥敏紙片購(gòu)自英國(guó)的Oxoi公司，Vitek 2全自動(dòng)化細(xì)菌鑒定藥敏儀購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司。

1.2方法

1.2.1菌株鑒定 大多數(shù)患者分離到的產(chǎn)粘液型銅綠假單胞菌在哥倫比亞血平板上35℃培養(yǎng)18～24 h，可見(jiàn)無(wú)色無(wú)味、露滴狀、邊緣不規(guī)則、不溶血的小菌落。48 h菌落融合為粘稠、膠凍樣菌落，部分患者的菌株為淡綠色，溶血可有可無(wú)。在麥康凱平板上35℃培養(yǎng)18～24 h菌落為無(wú)色無(wú)味、粘稠、膠凍樣、成片狀的大菌落，用接種環(huán)不易挑起[2]。培養(yǎng)48 h部分患者菌株的菌落可有淡綠色或淺褐色。氧化酶試驗(yàn)均成陽(yáng)性，這就可以初步區(qū)分下肺炎克雷伯菌（也會(huì)有粘液形成，但氧化酶陰性）。用無(wú)菌棉棒刮取在血平板上的產(chǎn)粘液型銅綠假單胞菌純菌落加入營(yíng)養(yǎng)肉湯中制作菌懸液，將菌懸液管反復(fù)顛倒振搖，置于35℃培養(yǎng)18～24 h，然后取上清液制成0.5麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙海肰ITEK2的GN卡鑒定。

1.2.2藥敏試驗(yàn) 對(duì)分離到的158株產(chǎn)粘液型銅綠假單胞菌紙片擴(kuò)散法在M-H上進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，判斷標(biāo)準(zhǔn)按照CLSI M100-S24標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。同時(shí)在VITEK2 上用配套的AST-GN13藥敏卡嚴(yán)格按照儀器使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行藥敏測(cè)定。

2 結(jié)果和分析

2.1兩種方法檢測(cè)158株產(chǎn)粘液型銅綠假單胞菌的藥敏結(jié)果，見(jiàn)表1。

2.2兩種方法的檢測(cè)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（SPSS），見(jiàn)表2。

我們通過(guò)軟件SPSS分析了各組的藥敏結(jié)果，從表2中我們可以看到氨曲南、頭孢吡肟、頭孢他啶、慶大霉素、左氧氟沙星的P<0.05，說(shuō)明有顯著性差異。余下的阿米卡星、環(huán)丙沙星、亞胺培南、特治星、妥布霉素的P>0.05，說(shuō)明無(wú)顯著性差異。

3 討論

產(chǎn)粘液型銅綠假單胞菌自然存在的一種特殊形式，其在黏膜表面產(chǎn)生大量粘液--多糖藻酸鹽等，從而持續(xù)定植、形成生物膜[3]。產(chǎn)粘液型銅綠假單胞菌在長(zhǎng)期慢性呼吸道感染的患者痰標(biāo)本中檢出率高，準(zhǔn)確及時(shí)的藥敏結(jié)果更加重要。由于產(chǎn)粘液型銅綠假單胞菌的粘液使該菌生長(zhǎng)明顯減慢，一般都需要48 h才生長(zhǎng)，并且在生理鹽水中不容易形成均勻的菌懸液，使我們?cè)谏蠙C(jī)鑒定和藥敏試驗(yàn)時(shí)，無(wú)法鑒定或者結(jié)果不準(zhǔn)確。故我們?cè)谵D(zhuǎn)純的時(shí)候采用哥倫比亞血瓊脂，且生長(zhǎng)良好。菌懸液的制備也是采用肉湯使其生長(zhǎng)良好而容易鑒定。

我們?cè)诓扇煞N方法檢測(cè)產(chǎn)粘液型銅綠假單胞菌的藥敏時(shí)發(fā)現(xiàn)敏感組基本差異不大，P=0.649，說(shuō)明兩種方法的結(jié)果無(wú)差異。而在中介組，P=0.003，說(shuō)明結(jié)果有顯著差異。耐藥組P=0.040，顯示結(jié)果有顯著差異。這些結(jié)果可以這樣認(rèn)為產(chǎn)粘液型銅綠假單胞菌，如果是機(jī)器檢測(cè)藥敏的話，結(jié)果不是很可靠，可能是生長(zhǎng)不良的原因，有些耐藥的結(jié)果變成中介了，至于敏感的菌株，不管你生長(zhǎng)好或是不好，只要對(duì)照孔生長(zhǎng)，機(jī)器肯定會(huì)出現(xiàn)敏感的結(jié)果，和紙片法應(yīng)該是符合一致的，所以我們建議采用紙片法或者其他MIC法的方法來(lái)檢測(cè)產(chǎn)粘液型銅綠假單胞菌的藥敏。

在我院分離到的產(chǎn)粘液型銅綠假單胞菌對(duì)10種常見(jiàn)的抗生素敏感性高，見(jiàn)表1，耐藥性較弱，但在治療產(chǎn)粘液型銅綠假單胞菌引起的感染時(shí)，往往臨床反映效果不佳，我們應(yīng)考慮藻酸鹽對(duì)銅綠假單胞菌生物膜的形成的耐藥性。如果由于生物被膜的作用而難以完全清除的話，就容易在體內(nèi)寄居，這樣就很容易誘發(fā)再次感染，而且反復(fù)的誘發(fā)以及反復(fù)的抗感染治療，就容易導(dǎo)致耐藥的形成，很強(qiáng)的定植和粘附能力，以及加上耐藥的形成，一旦再次繼發(fā)感染的話，治療就更加困難。據(jù)小林宏行報(bào)道大環(huán)內(nèi)酯類藥物可通過(guò)抑制藻酸鹽合成酶而減少細(xì)菌藻酸鹽的分泌破壞細(xì)菌生物被膜的結(jié)構(gòu)增加其他抗菌藥物對(duì)細(xì)菌生物被膜滲透從而達(dá)到與其他抗菌藥物聯(lián)合殺菌的目的[4]。

體內(nèi)的研究發(fā)現(xiàn)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素能使生物膜的表面形成孔穴，從而使生物膜內(nèi)部細(xì)菌得以暴露，有利于敏感藥物進(jìn)入生物膜內(nèi)部殺滅細(xì)菌。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素可使體內(nèi)藻酸鹽免疫復(fù)合物逐漸下降，可有效地抑制由藻酸鹽介導(dǎo)的抗原抗體反應(yīng)。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素尚有免疫調(diào)節(jié)作用，能有效地增強(qiáng)中性粒細(xì)胞對(duì)銅綠假單胞菌生物膜的吞噬作用；最新的研究發(fā)現(xiàn)克拉霉素能明顯抑制銅綠假單胞菌菌毛的顫動(dòng)從而抑制銅綠假單胞菌的致病力，總之，我們認(rèn)為大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在治療銅綠假單胞菌生物膜感染中具有舉足輕重的作用，而這種作用是其他藥物所不具備的[5]。

參考文獻(xiàn)：

[1]李彤，莊輝.細(xì)菌生物膜的研究進(jìn)展[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2002，22（3）：343-346.

[2]周庭銀，趙虎.臨床微生物學(xué)診斷與圖解[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2001：141.

[3]大垣憲隆，太田見(jiàn)宏，小林宏行.細(xì)菌感染癥一最新化學(xué)療法[J].臨床微生物，1994，21（1）：51.

[4]小林宏行.細(xì)菌生物被膜的基礎(chǔ)與臨床[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，1999，15：299-307.

[5]范春，牛其昌，王穎.銅綠假單胞菌生物膜耐藥性機(jī)制及防治[J].國(guó)外醫(yī)藥抗生素分冊(cè)，2004，25（5）：230-232.編輯/翟辰萬(wàn)