花青素苷提取專用菊種質及適宜采收期的篩選

劉海英，高 遠，邢晨濤，甄俊琦， 陸順麗，王玉芝

(河南師范大學 生命科學學院，河南 新鄉(xiāng) 453007)

菊花(ChrysanthemumxmorifoliumRamat.)，為多年生宿根花卉，其頭狀花序色彩豐富，具有重要的觀賞價值[1]?；ㄇ嗨剀?Anthocyanidin)又稱花色苷，是植物體內的一種天然水溶性色素，主要存在于植物的果實、花、莖和葉中的液泡[2]，水果、蔬菜、花卉等五彩繽紛的顏色大部分都與之有關[3]?；ㄇ嗨剀赵谑称?、化妝品、醫(yī)藥等方面有著巨大的應用前景[4-7]。菊花品種分為白色、黃色、橙色、粉色、紅色、紫色和綠色七大色系[8]，其中橙色、粉色、紅色和紫色4種色系菊花花色的形成均與花瓣中的花青素苷有關，尤其是紫色菊花，花瓣中花青素苷含量較高[9]。將菊花花瓣中的花青素苷進行工業(yè)化提取，對于菊花產業(yè)鏈的延伸具有重要的意義。

目前，我國對于菊花的研究主要在其資源的調查、花期調控及產量品質栽培學、菊花花青素苷合成關鍵基因表達與花色表型的關系，以及不同采收期對菊花產量和質量的研究等方面[10-14]，有關花青素苷提取專用菊種質及其適宜采收期篩選方面，目前尚未見報道。本研究選取橙色、粉色、紅色和紫色4個色系、7個品種菊花為供試材料，對其不同采收期的產量和品質指標進行跟蹤檢測，初步明確產量較高、品質較好的品種及其適宜采收期，并進一步利用該品種開展不同采收期分批次采收試驗，對初步研究結果進行驗證、完善和補充，以期為鑒定和選育花青素苷提取專用菊種質及其高產優(yōu)質栽培提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試品種為4個色系、7個菊花品種，包括：小菊品種橙小菊(橙色)、粉小菊(粉色)、粉色思緒(粉色)、意大利紅(紅色)、紅五九(紫色)和大菊品種紫玉(紫色)和姹紫嫣紅(紫色)(河南師范大學生命科學學院菊花圃種植)。在一般大田栽培方式管理下，5個小菊品種完全自然生長，2個大菊品種紫玉和姹紫嫣紅僅保留主莖，不斷除去多余的腋芽，待花蕾出現后，通過不斷抹蕾，僅保留1朵頂生花蕾。

試驗分為兩階段。第一階段：選取上述7個菊花品種代表性植株各3株，標記首批進入開花狀態(tài)的頭狀花序，隨開花進程推進設置7個采收期(Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期、Ⅵ期和Ⅶ期)，在每個采收期分別等數量采收標記過的菊花頭狀花序。第二階段：在第一階段試驗基礎上，選擇小菊品種紅五九代表性植株12株，分成4組，在4個采收期分別按5個批次采收所有達到標準的菊花頭狀花序。采收的菊花頭狀花序用于產量和品質指標的測定。

小菊品種7個采收期形態(tài)特征分別為：Ⅰ期，花序最外層顯色且花瓣微微張開；Ⅱ期，花序最外層舌狀花花瓣展開至豎立狀態(tài)；Ⅲ期，花序最外層舌狀花花瓣展開至45°張角；Ⅳ期，花序最外層舌狀花花瓣完全伸展，中間管狀花集中部分全為黃色；Ⅴ期，花序最外層舌狀花花瓣完全伸展，中間管狀花區(qū)域黃色消失一半且雌蕊Y形柱頭突出；Ⅵ期，花序最外層舌狀花花瓣完全伸展，中間管狀花區(qū)域從外向內1/2到2/3處黃色消失且雌蕊Y形柱頭突出；Ⅶ期，花序最外層舌狀花花瓣顏色變暗且略枯萎，中間管狀區(qū)域黃色全部消失且雌蕊Y形柱頭突出。大菊品種7個采收期形態(tài)特征分別為：Ⅰ期：花序從外向內第一、二輪花瓣顯色且微微張開，始花期；Ⅱ期：花序從外向內第一、二輪花瓣顏色加深，體積膨大，張開角度加大，從外向內第三、四輪花瓣花序微微張開，初花期；Ⅲ期：花序從外向內第三、四輪花瓣張開角度加大，內層仍有數層花瓣未張開，盛花前期；Ⅳ期：花序最外層花瓣完全伸展，露出中間管狀花集中部分且全為黃色，盛花中期；Ⅴ期：花序從外向內第一、二輪花瓣邊緣略有萎蔫狀態(tài)，中間管狀花區(qū)域外圍一、二圈黃色消失且雌蕊Y形柱頭突出，盛花后期；Ⅵ期：花序從外向內第三、四輪花瓣邊緣略有萎蔫狀態(tài)，中間管狀花區(qū)域從外向內1/2～2/3處黃色消失且雌蕊Y形柱頭突出，開花后期；Ⅶ期：全花序花瓣顏色變暗且呈萎蔫狀態(tài)，中間管狀區(qū)域黃色全部消失且雌蕊Y形柱頭突出，開花末期。

1.2 儀器與試劑

儀器：UV-2600紫外分光光度計(島津企業(yè)管理中國有限公司)；723N可見分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司)；FA2004 電子分析天平(上海上平儀器有限公司)；PHSJ-3F實驗室pH計(上海儀電科學儀器股份有限公司)；SZ-93自動雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)。

試劑：鹽酸(鄭州派尼化學試劑廠)；無水乙醇和檸檬酸(天津市德恩化學試劑有限公司)；乙酸鈉(天津興復科技發(fā)展有限公司)；冰乙酸(天津市富宇精細化工有限公司)；氯化鉀(上海振興試劑廠)；檸檬酸鈉和氫氧化鈉(天津市瑞金特化學品有限公司)；雙蒸水為河南師范大學生命科學學院植物生長發(fā)育調控實驗室制備。所有試劑均為分析純。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 單花序花瓣干質量的測定 采集新鮮菊花頭狀花序舌狀花花瓣，先用濕紗布擦去表面灰塵，再用吸水紙吸干表面水分，將所有舌狀花花瓣從花序上取下，在40 ℃下鼓風干燥72 h后稱量花序舌狀花花瓣干質量。將烘干后的舌狀花花瓣收集置于避光陰涼通風處存放，用于花青素苷含量的檢測。

1.3.2 花青素苷含量的測定 采用pH示差法測定[15-17]。將體積分數為80%的無水乙醇與0.1 mol/L的鹽酸溶液以1∶2的體積比混合，配制成花青素苷的浸提劑。準確稱取0.2 g不同品種菊花花瓣，添加10 mL花青素苷浸提劑，在室溫下避光浸提24 h后濾去花瓣，濾液用于測定花青素苷含量。取1 mL樣品稀釋液分別加入pH值為1.0和4.5的緩沖溶液定容至10 mL，室溫下平衡105 min后，以浸提液調零，于515 nm和700 nm波長下測定吸光度。根據Giusti等的研究，按公式(1)計算舌狀花花瓣中花青素苷含量[18]。

X1=(ΔT×V×F×M×1000)/(ε×m)

公式(1)

式中X1：花青素苷含量(mg/g)；ΔT:吸光度值，ΔT=(A515nm-A700nm)pH1.0-(A515nm-A700nm)pH4.5；V:浸提液體積(L)；F:稀釋倍數；M:矢車菊-3-O-葡萄糖苷的相對分子質量449.2；ε:摩爾消光系數26 900；m:樣品質量(g)。

1.3.3 單花序花青素苷含量的計算 單花序花青素苷的含量由單花序花瓣干質量與花青素苷含量相乘求得(mg)。

1.4 數據處理與分析

采用Microsoft Excel 2010進行數據運算并作圖；采用SPSS 11.5軟件對數據進行單因素方差分析，并判斷不同菊花品種間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 7個菊花品種不同采收期產量及品質的變化

2.1.1 7個菊花品種不同采收期單花序花瓣干質量的變化 由表1可知，隨開花進程的推進，7個菊花品種單花序花瓣干質量逐漸增加，粉色思緒和粉小菊干質量持續(xù)增加直到Ⅶ期達到最大值，橙小菊、紫玉和姹紫嫣紅干質量在Ⅴ期達到最大值后逐漸下降，意大利紅和紅五九干質量在Ⅵ期達到最大值后下降。小菊品種中，紅五九單花序花瓣干質量在Ⅳ期、Ⅴ期和Ⅵ期較高，與粉色思緒相比其最大值略低。大菊品種由于舌狀花數量多，體積大，單花序花瓣干質量及其最大值均明顯高于小花品種，以紫玉較大。表明，小菊品種紅五九選擇在Ⅵ期采收，粉色思緒選擇在Ⅶ期采收，大菊品種紫玉選擇在Ⅴ期采收，可以獲得較高的單花序花瓣干質量。

表1 7個菊花品種不同采收期單花序花瓣干質量的變化 mg/g

注：同列數據后不同小寫和大寫字母分別表示0.05和0.01水平上的差異顯著，下同。

2.1.2 7個菊花品種花青素苷含量的變化 由表2可知，隨開花進程的推進，7個菊花品種花青素苷含量均呈先增加再減少的趨勢，粉色思緒和粉小菊最大值出現在Ⅲ期，橙小菊、紅五九、紫玉和姹紫嫣紅最大值出現在Ⅳ期，意大利紅最大值則出現在Ⅴ期。紅五九和意大利紅花青素苷含量明顯高于其他5個品種，在Ⅳ期和Ⅴ期均以紅五九較高，其最大值在所有小花品種不同采收期中最高。表明，紅五九選擇在Ⅳ期采收，可以獲得較高花青素苷含量。

2.1.3 7個菊花品種單花序花青素苷含量的變化 由表3可知，隨開花進程的推進，粉小菊單花序花青素苷含量總體上持續(xù)增加；粉色思緒在Ⅲ期達到最大值后略有下降，Ⅴ期后又逐漸恢復，在Ⅶ期再次達到最大值；其他5個品種均呈先增加后減少的趨勢，其中橙小菊和紅五九在Ⅳ期達到最大值，意大利紅、紫玉和姹紫嫣紅則在Ⅴ期達到最大值。大菊品種單花序花青素苷含量均明顯高于小花品種，其中紫玉較高，其最大值在7個品種中最高；小菊品種中以紅五九最高，其次是意大利紅，其他3個小菊品種均較低。表明，小菊品種紅五九選擇在Ⅳ期采收，大菊品種紫玉選擇在Ⅴ期采收，可以獲得較高的單花序花青素苷含量。

表2 7個菊花品種不同采收期花青素苷含量的變化 mg/g

表3 7個菊花品種不同采收期單花序花青素苷含量的變化 mg/g

綜合2.1結果，在小菊品種中，紅五九單花序花瓣干質量在Ⅳ期之后均較高，在Ⅳ期出現花青素苷含量和單花序花青素苷含量最大值，并且高于其他4個小花品種，即紅五九在5個小花品種中產量最高，品質最優(yōu)；與2個大花品種相比，紅五九的單花序花瓣干質量和單花序花青素苷含量較低，但其花青素苷含量較高，品質更優(yōu)，因此，可選擇小菊品種紅五九為花青素苷提取專用菊種質，其適宜采收期可初步確定為Ⅳ期。

2.2 小菊品種紅五九不同采收期不同批次產量及品質的變化

2.2.1 紅五九不同采收期不同批次單花序花瓣干質量的變化 由表4可知，按采收期分析批次間變化，隨著采收批次的推遲，紅五九單花序花瓣干質量基本呈逐漸下降的變化趨勢，其中在Ⅱ期和Ⅲ期采收時，前4個批次間變化幅度較大，在Ⅳ期和Ⅴ期采收時則較平穩(wěn)。按批次分析采收期間變化，隨著采收期的推遲，單花序花瓣干質量逐漸增加，在Ⅳ期和Ⅴ期采收時達到最大，這2個采收期之間差異多數情況不顯著(第3批次，在Ⅳ期采收略低于在Ⅴ期采收除外)。表明，在Ⅳ期和Ⅴ期采收，尤其是在前4個批次采收，有利于獲得較高的紅五九單花序花瓣干質量。

2.2.2 紅五九不同采收期不同批次花青素苷含量的變化 由表4可知，按采收期分析批次間變化，隨著采收批次的推遲，紅五九花青素苷含量呈現不同的變化趨勢，具體為：在Ⅱ期采收時逐漸增加；在Ⅲ期采收時變化基本平穩(wěn)(第2批次比第1批次有小幅增加，第3、4批次與第1批次相近，第5批次比第1批次有小幅減少)；在Ⅳ期采收時變化平穩(wěn)(11.91～12.99 mg/g)；在Ⅳ期采收時變化平穩(wěn)；在Ⅴ期采收時逐漸下降。按批次分析采收期間變化，在第1批次采收時，隨著采收期的推遲，花青素苷含量逐漸增加，處理間差異均達到顯著或極顯著水平；在第2批次采收時，在Ⅴ期采收的花青素苷含量較高；在第3批次采收時，不同采收期之間差異均不顯著；在第4和第5批次采收時，則Ⅱ期最高、Ⅳ期居中、Ⅲ期和Ⅴ期最低(第4批次時，Ⅳ期和Ⅲ期之間差異不顯著)。表明，Ⅴ期采收的第1和第2批次，Ⅱ期采收的第4和第5批次紅五九均可以獲得最高的花青素苷含量；在Ⅳ期采收紅五九，不同批次樣品花青素苷含量均比較高且變化穩(wěn)定。

2.2.3 紅五九不同采收期不同批次單花序花青素苷含量的變化 由表4可知，紅五九不同采收期5個采收批次的單花序花青素苷含量與單花序花瓣干質量變化趨勢和處理間差異基本一致。不同之處在于，按采收期分析批次間變化，Ⅱ期采收時，不同批次樣品間變化基本平穩(wěn)，有一定幅度波動；Ⅴ期采收時隨采收批次推遲，單花序花青素苷含量持續(xù)下降。按批次分析采收期間變化，在第1和第2批次，Ⅳ期低于Ⅴ期，在第3批次，二者持平；在第4批次，Ⅳ期則高于Ⅴ期；在第5次批次采收時，Ⅱ期高于Ⅲ期，達到與Ⅳ期和Ⅴ期相同的水平。表明，Ⅴ期和Ⅳ期采收的前4個批次樣品均可以獲得較高的紅五九單花序花青素苷含量，以Ⅳ期采收變化較平穩(wěn)。

表4 小菊品種紅五九不同采收期不同批次產量及品質的變化

3 結論與討論

選擇合適的種質，確定科學合理的采收期對于保證花青素苷提取用菊質量，提高其產量具有重要的意義。孫衛(wèi)等[9]研究指出，粉色、紅色和紫色菊花花瓣中花青素苷含量依次增加；Xiang等[19]研究指出，橙色菊花花青素苷含量低于紅色菊花。隨著植物發(fā)育進程的推進，其有效成分和產量有關指標均發(fā)生變化，這是確定最佳采收期的基本依據。劉晶等[20]在對金銀花采收期的研究中指出，花蕾的早期階段是金銀花的最佳采收時期；楊俊等[21]和胡碧波等[22]的研究指出，杭白菊中的總黃酮和木犀草素-7-β-D-葡萄糖苷在開花初期均較高，也與杭白菊在生產實際中多在蕾期和開花初期采收相一致。

本研究7個菊花品種不同采收期試驗結果顯示，小菊品種按花青素苷含量最大值從小到大的順序依次為：粉色思緒(粉色)< 橙小菊(橙色)<粉小菊(粉色)<意大利紅(紅色)<紅五九(紫色)，與已有研究結果基本一致。2個紫色大菊品種的花青素苷含量峰值較低，與橙小菊相近，介于粉小菊和粉色思緒之間，這可能與其舌狀花花瓣面積大，表現在舌狀花花瓣干質量大，對花青素苷起到了稀釋效應有關，這2個品種在Ⅴ期達到最大值時差異不顯著。在花青素苷含量上，小菊品種紅五九最高，盡管其單花序花青素苷含量低于大菊品種紫玉和姹紫嫣紅，但是其單株平均頭狀花序數可達460余朵，單株總花青素苷產量遠高于同等土地面積上的大菊品種的花青素苷產量，因此初步確定紅五九為花青素苷提取專用菊種質。由于本試驗條件所限，僅涉及7個具有代表意義的菊花種質，小菊品種紅五九在豐富的菊花種質資源庫中可能并不是最理想的花青素苷提取專用菊種質，但本研究為繼續(xù)開展相關探索，篩選出更優(yōu)秀的花青素苷提取專用菊種質提供了參考。由于紅五九在Ⅳ期采收時，單花序花瓣干質量、花青素苷含量和單花序花青素苷含量均較高，因此，初步確定其適宜采收期為Ⅳ期。

上述結果是在同一植株上按開花進程逐漸取材獲得的，能否確實保障原材料生產的高產和優(yōu)質，答案仍不清楚，為此，本試驗進一步選擇紅五九不同植株，分別在Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期4個采收期，分5個批次采收試驗。結果顯示，Ⅳ期和Ⅴ期單花序花瓣干質量均較高，采收批次越晚，單花序花瓣干質量越少；Ⅴ期采收的第1、2批次，Ⅱ期采收的第4、5批次花青素苷含量最高，但均存在大幅度的變化，Ⅳ期采收時，花青素苷含量較高且變化穩(wěn)定；Ⅴ期和Ⅳ期采收的前4個批次樣品均可以獲得較高的紅五九單花序花青素苷含量，其中Ⅴ期采收的前2個批次較高，這兩個采收期的第3批次差異不顯著，Ⅳ期采收的第4批次較高，所有采收期下的第5批次樣品均較低，其中Ⅲ期最低。從獲得品質高且在批次間穩(wěn)定、產量也高的原材料角度考慮，選擇在Ⅳ期采收最為理想，這有效驗證了上述7個菊花品種不同采收期試驗的結果。同時，本試驗結果也提示另一種復合采收期采收機制可能具有潛在的優(yōu)勢，可設置4個采收批次，不同批次采收期不同，具體為：第1批次，Ⅴ期(對應分批采收試驗Ⅴ期第1批次)；第2批次，Ⅴ期(對應分批采收試驗Ⅴ期第2批次)、Ⅳ期(對應分批采收試驗Ⅳ期第3批次)和Ⅱ期(對應分批采收試驗Ⅱ期第5批次)；第3批次，Ⅳ期(對應分批采收試驗Ⅳ期第4批次)；第4批次，Ⅳ期(對應分批采收試驗Ⅳ期第5批次)。采用復合采收期采收機制可能有利于進一步提高小菊品種紅五九的產量和品質，減少采收次數，對此尚需進一步試驗驗證。本試驗結果顯示，在Ⅴ期采收的前2個批次紅五九產量高、品質優(yōu)，在Ⅱ期采收的第5批次可以獲得最高的舌狀花花瓣花青素苷含量，單花序舌狀花花瓣花青素苷含量與Ⅳ期和Ⅴ期采收差異不顯著，如果按7個采收期設置分批次采收試驗，是否會有新的發(fā)現，對此尚待進一步研究。