室旁核輸注褪黑素通過改善氧化應激對抗心肌缺血／再灌注損傷

楊金保，陳文生，劉大偉，金振曉，金屏，董小超

心肌缺血再灌注（myocardial ischemia reperfusion，MI／R）損傷是導致心臟患者死亡的重要原因［1］。 近年相關(guān)研究表明，褪黑素（melatonin，Mel）可以有效減輕 MI／R 損傷［2-3］；另有文獻報道，神經(jīng)體液的激發(fā)也參與了MI／R損傷的進展［4］。在高血壓大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）在外周組織和室旁核組織中均有明顯增加［5］，而室旁核（paraventricular nucleus，PVN）是一個調(diào)節(jié)交感神經(jīng)活動和缺血性心臟病的關(guān)鍵中樞整合部位，這表明腦ROS參與誘導缺血性心臟病的神經(jīng)體液激發(fā)。還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamideadenine dinucleotide phosphate， NADPH）和氮氧化物（nitrogen oxide，NOX）對于心血管系統(tǒng)中ROS的合成至關(guān)重要［6］。在大鼠缺血模型實驗中證實ROS的過表達在MI／R損傷的進展中起重要作用［7］。

Mel是一種有顯著抗氧化特性的激素［8］，它與ROS和NOX有交互作用，能夠增加抗氧化酶活性并降低促氧化酶活性［9-10］。本實驗室此前研究表明，Mel誘導的心臟保護作用是受體依賴性的，加之Mel兼具水溶性和脂溶性，易穿過血腦屏障進入中樞，且Mel受體也可在下丘腦中分布［11］。大量研究顯示，交感神經(jīng)興奮可縮短心室不應期，引起外周血管和冠狀動脈血管收縮，繼而導致缺血性心臟病的發(fā)生［12］；Mel生物作用廣泛，可抑制交感神經(jīng)活動，恢復心臟β受體功能并改善壓力感受性反射［13］，其抗腎上腺素能作用顯著促進其抑制MI／R損傷中心肌細胞分子損傷的潛力［14］。然而，在PVN中的Mel對MI／R損傷的心肌保護作用尚未引起重視。因此，本課題旨在探究PVN中Mel對MI／R損傷的心臟保護作用。

1 材料與方法

1.1材料 成年雄性 Sprague Dawley（SD）健康大鼠220～285 g，由空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，并經(jīng)空軍軍醫(yī)大學動物保護委員會批準。微型滲透泵（Alzet Model 1004）購自美國 Durect公司；Mel（泵速 0.025 μg／h）購自美國 Sigma-Aldrich 公司；下丘腦PVN立體定位裝置（WPI公司，美國）；圖像分析軟件（Media Cybernetics公司，美國）。超氧化物陰離子熒光探針二氫乙錠（Dihydroethidium，DHE，碧云天生物公司，中國上海）。

1.2方法

1.2.1實驗分組及模型建立 將28只大鼠隨機分為4組：①Sham＋PVN輸注人工腦脊液（vehicle，V）；②Sham＋PVN 輸注 Mel；③MI／R＋PVN 輸注 V；④MI／R＋PVN輸注 Mel。大鼠用3%戊巴比妥鈉（30 mg／kg）腹腔注射麻醉，之后將其固定于立體定位裝置上，參照室旁核定位圖，在前囟后方1.8 mm，距正中線外側(cè)0.4 mm處將不銹鋼套管植入側(cè)腦室PVN部位后連接到微型滲透泵，并將滲透泵植入頸后部皮下，用于緩慢輸注 Mel（0.025 μg／h）或 V（0.025 μg／h）。1周后進行 MI／R的建立。所有大鼠麻醉后，開胸并結(jié)扎冠狀動脈前降支模擬心肌缺血，缺血后30 min，將前降支結(jié)扎線松開使心肌再灌注6 h。在此模型建立后3周時分析心肌缺血和梗死面積的大小、蛋白表達情況和心臟功能。Sham組進行相同的手術(shù)操作，但穿過冠狀動脈前降支的慕絲線不打結(jié)。模型建立后肌注青霉素預防感染。在實驗結(jié)束時，所有大鼠用3%戊巴比妥鈉麻醉后處死，用以收集外周血液和PVN腦組織用于后續(xù)的免疫組化研究。所有手術(shù)均在麻醉和無菌條件下進行。

1.2.2超聲心動圖評估 缺血再灌注3周后，所有大鼠行超聲心動圖檢查，用以計算左心室功能，包括左室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF），左室縮短率 （left ventricular shortening，LVFS）和左室舒張末期容積（left ventricular end-diastolic volume，LVEDV）。

1.2.3心肌梗死面積的測定 超聲心動圖檢查之后，再次開胸并結(jié)扎冠狀動脈前降支，并將2%伊文氏藍（1 ml）染料由主動脈根部注入，很快染色劑便經(jīng)由冠狀動脈均勻分布于除了前降支灌注的其余心肌組織。立即摘除心臟并保存于-80℃液氮中約10 min，冷凍后取出并切成垂直于心臟長軸約1 mm厚的切片；將切片放置在1%氯化三苯四氮唑（TTC）的磷酸鹽緩沖液（pH 7.4，溫度 37℃）中孵育 20 min，再置于40 g／L的甲醛中固定過夜，次日用數(shù)碼相機拍照。使用Image Pro-Plus軟件分析伊文氏藍染色區(qū)域（正常心?。?，TTC染色區(qū)域（紅色，缺血心?。┖突野咨珔^(qū)域（梗死心肌）。心肌梗死面積用總梗死面積占總切片心肌面積的百分比（INF／AAR×100%）表示。

1.2.4外周血標本和PVN組織的收集 所有大鼠用戊巴比妥鈉麻醉并斷頭處死。收集外周血液樣品并立即儲存在-80℃液氮中用以測量去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）的水平。開顱取完整的腦組織，在室溫下固定于4%多聚甲醛PBS液中約5 h，然后移入30%蔗糖PBS液備用，直至組織下沉后取出；然后固定腦組織，并切取視交叉與乳頭體之間的部分，在冰凍切片機上進行連續(xù)冠狀切片，厚度約10 μm，將切片貼于防脫玻片上，-80℃保存用于免疫組化。另取各組的大鼠PVN組織，稱重后制成組織勻漿，并離心收集上清液，分裝用于 ELISA和Western blot檢測。

1.2.5免疫組化的測定 免疫組化用于檢測PVN區(qū)腦組織的氧化應激水平。NOX2的一抗購自美國Santa公司。免疫組化中DAB（二氨基聯(lián)苯胺）顯色后細胞膜上出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性細胞。在同一條件下對每張標本按順序選取5個視野，計算每個視野經(jīng)免疫組織化學染色陽性細胞占總細胞數(shù)的百分比，其中＜4%為陰性，＞6%為陽性。

1.2.6Western Blot分析 對 PVN 組織勻漿進行蛋白質(zhì)印跡分析，以測定NOX2和銅鋅超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，Cu／Zn-SOD）的蛋白表達水平。所用一抗均購自美國Santa公司。用NIH Image J軟件分析條帶密度。

1.2.7統(tǒng)計分析 所有實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤（±s）表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1PVN輸注Mel可改善心功能及超聲心動圖指標 首先評估了PVN輸注Mel對Sham組大鼠心臟的影響，結(jié)果顯示：與Sham＋PVN輸注V組對比，PVN輸注 Mel對大鼠的心率（heart rate，HR）、LVEF、LVFS和 LVEDV 沒有顯著的影響（P＞0.05，表1）。 而與Sham＋PVN 輸注 V 組比較，MI／R＋PVN輸注V組卻顯示出明顯的心肌損傷，其HR和LVEDV 增加、LVEF和 LVFS均降低（P＜0.05，表 1）。另外與 MI／R＋PVN 輸注 V 組比較，MI／R＋PVN 輸注Mel組顯示LVEF和LVFS均顯著增加，HR和LVEDV卻有所降低（P＜0.05，表1）。 這些數(shù)據(jù)證明Mel治療可改善MI／R引發(fā)的心肌損傷。

2.2PVN輸注Mel顯著降低心肌梗死面積 Sham＋PVN輸注V組心臟的心肌梗死面積（2±0.6）%與Sham＋PVN 輸注 Mel組（2±0.2）%比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。單純手術(shù)組的心肌梗死面積與Sham＋PVN輸注V組比較顯著增加［MI／R＋PVN輸注 V 組（38±4）%vs.Sham＋PVN 輸注 V 組（2±0.6）%（P＜0.01）］。 而在 MI／R 組，給予 Mel后，大鼠心肌梗死面積明顯減少［MI／R＋PVN 輸注 Mel組（24±2）%vs.MI／R＋PVN 輸注 V 組（38±4）%（P＜0.01）］。 見圖1。

2.3PVN輸注Mel可降低NE水平 NE是交感神經(jīng)活動的標志物，通過ELISA盒子測量。與Sham＋PVN輸注V組比較，在MI／R＋PVN輸注V組大鼠的外周血漿和下丘腦PVN組織中，顯示出更高水平的 NE 表達（P＜0.01）；然而，在 PVN 輸注 Mel 1個月后，外周血漿和下丘腦PVN組織中NE的表達明顯被抑制（P＜0.05）。 見圖 2。

圖1 各組間心肌梗死面積比較

圖2 不同組間NE表達差異的比較

表1 超聲心動圖結(jié)果（±s）

表1 超聲心動圖結(jié)果（±s）

注：再灌注后3周進行超聲心動圖測量。＃P值為Sham＋PVN輸注Mel組與Sham＋PVN輸注V組比較；*P值為MI／R＋PVN輸注V組與Sham＋PVN輸注V組比較；△P值為MI／R＋PVN輸注Mel組與MI／R＋PVN輸注V組比較。

指標 Sham＋PVN輸注V組Sham＋PVN輸注Mel組 P值＃ MI／R＋PVN輸注V組 P值* MI／R＋PVN輸注Mel組 P值△HR（次／min） 329±19 326±8 0.595 399±11 0.016 364±10 0.021 LVEF（%） 81.6±6.5 80.3±8.1 0.511 51.6±5.6 0.033 63.2±5.8 0.041 LVFS（%） 51.3±8.0 52.2±6.4 0.682 30.3±4.6 0.024 38.7±5.5 0.031 LVEDV（ml） 0.55±0.1 0.58±0.06 0.657 1.21±0.17 0.011 0.88±0.13 0.016

2.4PVN輸注Mel可改善Cu／Zn-SOD蛋白的表達

Western Blot用來測定作為抗氧化酶活性標志的Cu／Zn-SOD蛋白。Sham＋PVN輸注V組心臟的Cu／Zn-SOD蛋白表達水平與Sham＋PVN輸注Mel組比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。與Sham＋PVN輸注V組相比，MI／R＋PVN輸注V組大鼠在下丘腦PVN組織中Cu／Zn-SOD蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）。在PVN輸注Mel1個月后，MI／R＋PVN輸注Mel組大鼠的大鼠的Cu／Zn-SOD蛋白表達較MI／R＋PVN輸注V 組有顯著升高（P＜0.05）。 見圖3。

圖3 PVN輸注Mel對Cu／Zn-SOD蛋白表達的比較

圖4 不同組間NOX2蛋白表達的比較

2.5PVN輸注Mel可降低NOX2的表達水平 免疫組化和Western blot結(jié)果顯示，Sham＋PVN輸注V組與Sham＋PVN輸注Mel組比較，NOX2陽性神經(jīng)元數(shù)量和NOX2蛋白表達水平均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05，圖4 A～D）。 MI／R＋PVN 輸注V 組大鼠的下丘腦PVN組織中NOX2陽性神經(jīng)元數(shù)量較Sham＋PVN輸注V組高（P＜0.001，圖4 A和B），PVN輸注Mel 1個月后，MI／R＋PVN輸注Mel組大鼠的NOX2陽性神經(jīng)元數(shù)量較MI／R＋PVN輸注V組顯著降低（P＜0.05，圖 4 A 和 B）。 MI／R＋PVN 輸注 V 組大鼠的下丘腦PVN組織中NOX2蛋白表達水平較Sham＋PVN輸注V組顯著升高（P＜0.05，圖4 C和D），PVN輸注Mel 1月后，MI／R＋PVN輸注Mel組大鼠的NOX2蛋白表達水平較Sham＋PVN輸注V組顯著降低（P＜0.05，圖 4 C 和 D）。

3 討 論

在本研究中，筆者首次發(fā)現(xiàn)：①下丘腦PVN中過表達的氧化應激參與了MI／R損傷；②PVN輸注Mel可提高抗氧化酶的活性，并抑制下丘腦PVN中NAD（P）H氧化酶亞基NOX2的表達水平；③PVN輸注Mel顯著降低了MI／R大鼠血漿和PVN中的NE水平。綜述以上結(jié)果都表明下丘腦PVN輸注Mel有助于改善MI／R損傷。

有文獻報道，自主神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂與過量的NE產(chǎn)生之間的相互作用對MI／R損傷至關(guān)重要。另有研究發(fā)現(xiàn)，心肌缺血后下丘腦PVN神經(jīng)元活動的調(diào)節(jié)顯著改變了外周交感神經(jīng)的活動，并進一步改善了心肌缺血大鼠的心臟功能［14-15］。研究還表明，Mel可顯著降低高血壓大鼠的外周交感神經(jīng)活動［16］。眾所周知，Mel具有多種生物學效應，它可以透過血腦屏障，并且Mel受體在大腦組織中廣泛表達，在下丘腦PVN組織中也很豐富［11］。鑒于Mel對外周交感神經(jīng)活動的調(diào)節(jié)作用，本研究中也發(fā)現(xiàn)，與Sham＋PVN輸注V組相比，MI／R＋PVN輸注V組大鼠的PVN組織和血漿中NE的水平顯著升高，而PVN輸注Mel可降低NE的表達；這表明PVN輸注Mel可減緩交感神經(jīng)的過度激活，從而進一步改善MI／R損傷。Mel對交感神經(jīng)過度激活的抑制作用可能與對氧化應激的調(diào)節(jié)有關(guān)。最近的研究表明，Mel的抗心肌缺血效應主要與抗氧化、抗自由基形成、降低心磷脂過氧化和減少線粒體釋放等有關(guān)［17-18］。Mel可有效地與各種ROS相互作用，能夠增加抗氧化酶并減少促氧化酶的產(chǎn)生［19］。下丘腦PVN中的NAD（P）H亞基，尤其是 NOX2和NOX4是ROS的主要來源。在下丘腦中，高水平的ROS是增強外周交感神經(jīng)興奮性的重要因素，阻斷中樞ROS的形成可顯著降低交感神經(jīng)的活動［5］。SOD作為一種抗氧化酶，是抗ROS誘導的氧化組織損傷的第一道防線［20］。 本研究中發(fā)現(xiàn)，MI／R＋PVN 輸注 V組PVN中NOX2的表達均顯著升高，而抗氧化酶Cu／Zn-SOD的表達則較Sham＋PVN輸注V組明顯降低。然而，PVN輸注Mel提高了Cu／Zn-SOD的表達水平，并降低了NOX2的表達?；谝陨辖Y(jié)果，筆者得出結(jié)論：下丘腦PVN中的Mel可通過激發(fā)抗氧化酶的過表達和抑制促氧化酶的表達來降低交感神經(jīng)活動，并進一步改善MI／R損傷。

總之，本研究表明下丘腦PVN輸注Mel可改善MI／R大鼠中SOD的降低和NOX2的增加；同時能夠抑制MI／R大鼠NE的增加。這些結(jié)果表明PVN輸注Mel可以通過減弱氧化應激和降低交感神經(jīng)活動來對抗MI／R損傷。本研究表明Mel在PVN組織中具有潛在的抗氧化活性，為其在MI／R損傷中的治療價值提供了證據(jù)；并進一步揭示了一種Mel在中樞神經(jīng)系統(tǒng)治療MI／R損傷的新方法。