楸樹花粉壁蛋白質(zhì)提取及特異性

王改萍，徐　濤，樊莉麗，彭方仁，呂　昕，陳琳月（南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江蘇南京210037）

?

楸樹花粉壁蛋白質(zhì)提取及特異性

王改萍，徐濤，樊莉麗，彭方仁，呂昕，陳琳月
（南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江蘇南京210037）

摘要：為了進(jìn)一步研究楸樹Catalpa bungei自交不親和特性，以楸樹不同產(chǎn)地植株云臺(tái)山楸樹（CB-1），老山楸樹（CB-2）和滇楸Catalpa fargesi f.duclouxii（CF）的花粉為對(duì)象，利用普通研磨法及超聲波破碎法，研究了適合于花粉壁蛋白質(zhì)提取的方法。同時(shí)采用考馬斯亮藍(lán)染色法及聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）比較了不同樹種花粉蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)及其主要蛋白質(zhì)組分。結(jié)果表明：超聲波破碎法適于花粉壁蛋白質(zhì)的提取，最佳超聲參數(shù)為功率400 W，超聲時(shí)間3 s·次(－1)，間歇時(shí)間6 s·次(－1)，3個(gè)回合，工作120次，相隔5 min·回合(－1)。蛋白質(zhì)提取液三羥甲基氨基甲烷（Tris-HCl）的pH 7.8最佳。不同樹種的花粉壁蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)表現(xiàn)為滇楸最高，云臺(tái)山楸樹和老山楸樹較低。蛋白質(zhì)組分研究表明：各樹種花粉共有蛋白質(zhì)有26個(gè)，特異蛋白質(zhì)為連楸53.8 kD，35.0 kD，23.4 kD，26.5 kD；老楸53.8 kD，38.5 kD，23.4 kD；滇楸38.5 kD，26.5 kD。圖6表1參18

關(guān)鍵詞：植物學(xué)；楸樹；超聲波破碎法；蛋白質(zhì)；聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）

植物自交不親和性（self-incompatibility，SI）是指植物的雌蕊柱頭或花柱可以辯別自體和異體花粉，并抑制自體花粉萌發(fā)或生長(zhǎng)的生理現(xiàn)象，是一種重要的防止植物近親繁殖、增加變異的遺傳機(jī)制［1］?；ǚ叟c柱頭之間的識(shí)別和互作是重要的生殖過(guò)程，而花粉壁中許多蛋白在此過(guò)程中扮演著重要角色。成熟花粉可分為外壁和內(nèi)壁兩部分，兩者都含有活性的蛋白質(zhì)，外壁蛋白已被確定存在于成熟花粉的外壁腔隙內(nèi)，并參與了花粉與柱頭的黏附、識(shí)別及花粉水合、萌發(fā)等過(guò)程［2－5］。楸樹Catalpa bungei是紫葳科Bignoniaceae梓樹屬Catalpa的落葉喬木，是中國(guó)特有的珍貴優(yōu)質(zhì)用材樹種和著名園林觀賞樹種，自古就有“木王”之稱［6－7］。楸樹具有自交不親和特性，已初步確定了其自交不親和特點(diǎn)、發(fā)生位置以及發(fā)生類型［8］。目前，對(duì)楸樹花粉的研究?jī)H限于其生活力測(cè)定及授粉特性等方面［9－11］。如何有效提取花粉壁內(nèi)特異蛋白成為研究花粉不親和機(jī)制的基礎(chǔ)。本研究以楸樹花粉為研究對(duì)象，利用超聲波破碎細(xì)胞法［12］及普通冰浴研磨法比較了不同蛋白提取方法對(duì)花粉壁蛋白的影響，同時(shí)以滇楸Catalpa fargesii f.duclouxii花粉為對(duì)照材料，比較了不同樹種之間蛋白質(zhì)含量及蛋白質(zhì)組分的變化特點(diǎn)，為楸樹花粉特異蛋白的研究及進(jìn)一步揭示楸樹自交不親和機(jī)理提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試材料為成年健壯的楸樹，分別位于連云港云臺(tái)山國(guó)家森林公園內(nèi)（簡(jiǎn)稱云臺(tái)山楸樹，CB-1）和南京老山林場(chǎng)內(nèi)（簡(jiǎn)稱老山楸樹，CB-2），均不能自花結(jié)實(shí)。對(duì)照為滇楸，來(lái)自于南京林業(yè)大學(xué)校內(nèi)（CF），能自花結(jié)實(shí)。各樹種均為優(yōu)良單株。

在楸樹盛花期（4月中旬－5月上旬）采集楸樹及滇楸各20個(gè)大花序，帶回實(shí)驗(yàn)室后用小鑷子取下花藥，置于稱量紙上，室溫（24±2）℃下約2 d，待花藥自然開裂后收集花粉，－76℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1花粉蛋白質(zhì)提取方法①普通冰浴研磨法。以云臺(tái)山楸樹（CB-1）花粉為材料。取花粉0.2 g·次－1，按照體積比1∶5比例加入0.1 mol·L－1三羥甲基氨基甲烷（Tris-HCl）蛋白提取緩沖液，緩沖液pH值共設(shè)3個(gè)水平，分別為pH 6.8，pH 7.8，pH 8.8。在冰浴條件下充分研磨后，取少量研磨液鏡檢，其余部分在4℃條件下靜提5 h，之后離心（4℃，12 000 r·min－1）30 min，上清液為粗提蛋白液。待上清液吸出后，余下沉淀再按照前述比例加Tris-HCl蛋白提取緩沖液，進(jìn)行2次提取。靜置及離心同前述條件，離心后，留上清液，去沉淀。之后將上清液分別進(jìn)行冷凍干燥，超低溫儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｖ貜?fù)3次·處理－1。②超聲波破碎法。在冰浴條件下，利用超聲波細(xì)胞破碎機(jī)（南京先歐儀器制造有限公司，XO-1000D）進(jìn)行破壁處理。超聲參數(shù)設(shè)定共4個(gè)組合（表1），重復(fù)3次·組－1。超聲結(jié)束后取少量進(jìn)行鏡檢。蛋白提取方法同①。

表1　超聲波破碎花粉粒試驗(yàn)參數(shù)Table 1 Parametrization of ultrasonic waves on extracting proteins from the pollen of catalpas

1.2.2蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)染色法［13］。

1.2.3蛋白質(zhì)組分測(cè)定電泳研究使用BIO-RAD垂直板電泳槽。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），分離膠質(zhì)量濃度為0.130 kg·L－1（13.0%），濃縮膠質(zhì)量濃度為0.044 kg·L－1（4.4%）。配膠質(zhì)量濃度及電泳設(shè)計(jì)程序參照相關(guān)材料，略有變動(dòng)［13］。電泳結(jié)束后，凝膠用Bio-Rad Gel Doc XR成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描，用Quantity one軟件進(jìn)行分析。低分子量蛋白質(zhì)Marker（Protein Molecular Weight Marker）購(gòu)自Fermentas生物工程有限公司，包括7種蛋白質(zhì)。試驗(yàn)所用藥品均為Amreso公司進(jìn)口分裝。

2　結(jié)果與分析

2.1不同花粉蛋白提取方法比較

2.1.1普通冰浴研磨法提取花粉蛋白普通冰浴研磨法提取花粉蛋白時(shí)，不同研磨時(shí)間對(duì)楸樹花粉壁的破碎性存在差異（圖1）。在研磨5 min后的鏡檢中發(fā)現(xiàn)，此時(shí)花粉大都保持完整（圖1A）。而研磨10 min后，花粉壁大多消失，但也出現(xiàn)花粉粒破碎（圖1B），導(dǎo)致了花粉壁蛋白粗提液中混雜有花粉粒蛋白。普通冰浴研磨法中需要多次鏡檢，以觀察破碎效果，耗時(shí)較多。而且研磨時(shí)使用力量不同，最終效果也存在差異，導(dǎo)致研磨時(shí)間不確定，精度也不夠，試驗(yàn)重復(fù)性差。

圖1　常規(guī)研磨方法提取花粉蛋白比較Figure 1　Compare with efficiency on extracting protein by routine method of rinding

2.1.2超聲波破碎法提取花粉蛋白利用超聲波破碎法提取花粉蛋白的研究表明，不同的超聲參數(shù)設(shè)計(jì)對(duì)花粉的破碎存在差異（圖2）。采用第1組合超聲參數(shù)設(shè)計(jì)破碎花粉，發(fā)現(xiàn)楸樹花粉粒保持完整，花粉壁少量變薄，在顯微鏡下仍能觀察到花粉壁，破損率為0（圖2A）。采用第2組合參數(shù)后，發(fā)現(xiàn)其花粉壁基本消失，花粉粒基本完好，破損率為5%左右（圖2B）。而利用第3組合參數(shù)破碎結(jié)束后，花粉壁基本上消失，但有少量花粉粒出現(xiàn)破損，破損率約15%（圖2C）。采用第4組合參數(shù)破碎結(jié)束后，其破碎的花粉粒明顯多于第3組合，基本上觀察不到完整的花粉粒，花粉破損率約90%。此時(shí)花粉粒中大量蛋白被提取出來(lái)，對(duì)花粉壁蛋白的研究造成不利影響（圖2D）。比較4種超聲波參數(shù)組合對(duì)花粉的破損影響，認(rèn)為第2組合更適于楸樹花粉壁中蛋白的提取，能更有效地提取花粉壁蛋白。

圖2　不同組合超聲波破碎法提取花粉蛋白比較Figure 2 Compare with efficiency of extracting protein by ultrasonic waves

2.2不同pH值及不同超聲功率對(duì)花粉蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

2.2.1不同pH對(duì)花粉蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響采用最佳超聲破碎參數(shù)設(shè)計(jì)，利用不同pH值的蛋白提取液（三羥甲基氨基甲烷Tris-HCl）對(duì)老山楸樹花粉蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行研究（圖3）。結(jié)果表明：提取液的pH值不同，其蛋白提取率存在差異。第1次浸提后，表現(xiàn)為pH 7.8的Tris-HCl蛋白提取率最高（73.5 mg·g－1），而pH 6.8提取率最低（52.9 mg·g－1），pH 7.8和pH 8.8的浸提液相差不大。方差分析結(jié)果也表明：第1次浸提后不同處理間達(dá)到極顯著差異（F＞F0.01），但pH 7.8和pH 8.8之間無(wú)論是0.05水平及0.01水平均不存在差異，說(shuō)明這2種pH值適合于楸樹花粉蛋白質(zhì)的提取。而對(duì)第2次浸提后蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的分析表明，pH 6.8與pH 7.8處理間差異不顯著，但兩者與pH 8.8之間在0.05水平存在差異。而第2次浸提后蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著低于第1次，不同pH值條件下蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在10 mg·g－1左右，即第2次浸提后獲得的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)占總蛋白量比例低，認(rèn)為楸樹蛋白一次提取率較高，可以不進(jìn)行多次浸提。

2.2.2不同超聲功率對(duì)花粉蛋白質(zhì)含量的影響不同超聲功率對(duì)楸樹花粉蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的研究也表明，在其他超聲參數(shù)一致的條件下，超聲功率對(duì)其蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)有明顯影（圖4）。由圖4可知：隨著超聲功率增大，花粉蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯增加。第1次蛋白提取后，超聲功率在600 W時(shí)蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)（為96.1 mg·g－1）明顯高于功率400 W時(shí)。方差分析結(jié)果也表明：第1次浸提后不同處理之間達(dá)到極顯著差異（F＞F0.01），比較第2次浸提后花粉蛋白提取率，發(fā)現(xiàn)2處理間蛋白提取率均較低，處理間沒(méi)有顯著差異。對(duì)2次花粉蛋白浸提疊加值也表現(xiàn)為超聲功率為600 W時(shí)，蛋白質(zhì)提取率最高，但顯微鏡觀察結(jié)果表明此處理花粉粒破碎較多，對(duì)楸樹壁花粉蛋白的精確性有影響，因此，本次試驗(yàn)仍選定超聲功率為400 W，保證其花粉特異蛋白的提取及后續(xù)的研究。

圖3　不同pH值對(duì)花粉蛋白質(zhì)的影響Figure 3　Effect of pH on extracting proteins from the pollen

圖4　不同功率對(duì)花粉蛋白質(zhì)的影響Figure 4　Effect of ultrasonic power on extracting proteins from the pollen

2.2.3不同樹種花粉蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)及聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析對(duì)3個(gè)樣品花粉蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的研究表明，滇楸蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為114.9 mg·g－1，其次是云臺(tái)山楸樹，老山楸樹質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低（圖5）。進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，滇楸花粉的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)是老山楸樹的1.58倍，而云臺(tái)山楸樹和老山楸樹之間差異較小。方差分析的結(jié)果也表明：不同樣品之間存在極顯著差異（F＞F0.01），且滇楸與楸樹間差異明顯。利用SDS-PAGE電泳分析了花粉的蛋白質(zhì)組分（圖6），結(jié)果表明：花粉蛋白質(zhì)分子量主要集中在100 kD內(nèi)，較均勻地分布于不同分子量區(qū)域，分離出的蛋白帶約30多條，反映了構(gòu)成花粉可溶性蛋白的亞基種類較多。對(duì)不同樣品的蛋白質(zhì)組分進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)三者差異蛋白包括出現(xiàn)在云臺(tái)山楸樹和老山楸樹中的53.8 kD，23.4 kD蛋白；出現(xiàn)在老山楸樹和滇楸中的38.5 kD蛋白；出現(xiàn)在云臺(tái)山楸樹和滇楸中的26.5 kD蛋白，云臺(tái)山楸樹中特有的35.0 kD蛋白。

圖5　不同樣品花粉蛋白質(zhì)比較Figure 5　Compare of protein contents of pollen in the different trees

圖6　花粉蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳Figure 6 SDS-PAGE of pollen’s protein

3　討論

植物授粉受精過(guò)程的順利進(jìn)行對(duì)植物生殖生長(zhǎng)起著至關(guān)重要的作用，而作為雄配子體——成熟花粉粒的表面物質(zhì)，尤其是花粉表面蛋白質(zhì)則是授粉過(guò)程能否順利完成的關(guān)鍵［2－3］。了解花粉表面蛋白質(zhì)組是為了深入研究花粉與柱頭黏附識(shí)別的分子機(jī)制的基礎(chǔ)。

花粉壁中蛋白的提取方法普遍采用常規(guī)液氮研磨法，但此次試驗(yàn)表明，液態(tài)研磨法雖然操作簡(jiǎn)單，易于進(jìn)行，但受研磨時(shí)間及人為用力大小不同，導(dǎo)致花粉壁蛋白與花粉粒中蛋白混雜，影響楸樹中與自交不親和有關(guān)的不親和蛋白（S蛋白）的研究。而超聲波破碎法在天然產(chǎn)物提取中已經(jīng)顯示出越來(lái)越多的優(yōu)勢(shì)［14－16］。本研究中，通過(guò)控制一定的超聲頻率和強(qiáng)度，能夠?qū)崿F(xiàn)提取楸樹花粉壁蛋白的目標(biāo)。同時(shí)，對(duì)蛋白提取液pH值的選擇中，發(fā)現(xiàn)隨Tris-HCl浸提液中pH值的增大，各樹種花粉內(nèi)蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，而且一次性蛋白提取率均較高，不需要多次浸提分離獲得蛋白。

在對(duì)植物自交不親和的研究中，人們逐步認(rèn)識(shí)到在成熟花粉的外壁和內(nèi)壁都含有活性的蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)是作為雌雄配子體識(shí)別的物質(zhì)基礎(chǔ)［4－5］。MAYFIELD等［17］發(fā)現(xiàn)10個(gè)擬南芥Arabidopsis thaliana花粉表面蛋白質(zhì)。劉寶敬等［18］對(duì)甘藍(lán)Brassica oleracea自交不親和系及親和系花粉和柱頭蛋白質(zhì)進(jìn)行等電聚焦電泳研究中，發(fā)現(xiàn)了6條蛋白質(zhì)譜帶僅存在于自交不親和系中，而親和系中未發(fā)現(xiàn)此譜帶。本研究中，比較楸樹和滇楸蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí)發(fā)現(xiàn)，滇楸（CF）的蛋白質(zhì)最高，其次是云臺(tái)山楸樹（CB-1），老山楸樹（CB-2）蛋白質(zhì)最低，但云臺(tái)山楸樹與老山楸樹兩者之間沒(méi)有顯著差異。利用SDS-PAGE電泳技術(shù)對(duì)花粉壁蛋白的初步分離，共分出可辨蛋白帶約30多條，主要集中在100 kD內(nèi)，而3樣品中存在差異的蛋白質(zhì)，包括出現(xiàn)在云臺(tái)山楸樹和老山楸樹中的53.8 kD，23.4 kD蛋白；出現(xiàn)在老山楸樹和滇楸中的38.5 kD；出現(xiàn)在云臺(tái)山楸樹和滇楸中的26.5 kD，僅出現(xiàn)在云臺(tái)山楸樹中的35.0 kD蛋白。但本研究?jī)H針對(duì)楸樹花粉S蛋白進(jìn)行摸索性研究，電泳分離中獲得的各樹種特異蛋白是否與楸樹自交不親和有關(guān)，還要通過(guò)蛋白的純化及分離鑒定等作進(jìn)一步的研究。

花粉的特異性研究將是自交不親和性研究中的重要內(nèi)容，對(duì)其特異性蛋白機(jī)制的研究可為人工打破植物的生殖障礙，利用遠(yuǎn)源基因資源和開發(fā)新作物育種途徑奠定基礎(chǔ)。

4　參考文獻(xiàn)

［1］SIJACIC P,WANG Xi,SKRPAN A L,et al.Identification of the pollen determinant of S-RNase-mediated selfincompatibility［J］.Nature,2004,429（6989）:302－305.

［2］EDLUND A F,SWANSON R,PREUSS D.Pollen and stigma structure and function:the role of diversity in pollination ［J］.Plant Cell Online,2004,16（supp 1）:S84－S97.

［3］MURPHY D J.The extracellularpollen coat inmembers of the Brassicaceae:composition,biosynthesis,and functions in pollination［J］.Protoplasma,2006,288（1/3）:31－39.

［4］王愛(ài)云，李栒，胡大有.諸葛菜與蕓薹屬間花粉與柱頭相互作用的研究［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006，32（3）：232－236.WANG Aiyun,LI Xun,HU Dayou.Pollen-stigma interaction between Orychophragmus violaceus and Brassica species ［J］.J Hunan Agric Univ Nat Sci,2006,32（3）:232 - 236.

［5］張丞，王冠，易素華，等.擬南芥花粉表面蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)的整合［J］.上海師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，38（5）：511－515.ZHANG Cheng,WANG Guan,YI Suhua,et al.Data integration of pollen surface proteins in Arabidopsis thaliana ［J］.J Shanghai Norm Univ Nat Sci,2009,38（5）:511－515.

［6］張綿.“材”貌絕倫的楸樹［J］.森林與人類，2003（3）：34－35.ZHANG Mian.“Material”and unsurpassed Catalpa bungei［J］.For &Humankind,2003（3）:34－35.

［7］郭從儉，錢士金，王連卿，等.楸樹栽培［M］.北京：中國(guó)林業(yè)出版社，1988.

［8］樊莉麗，彭方仁，王改萍，等.楸樹自交及種內(nèi)、種間雜交親和性的細(xì)胞學(xué)觀察［J］.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2013，37（4）：1－7.FAN Lili,PENG Fangren,WANG Gaiping,et al.Cytological observation of fertilization compatibility of Catalpa bungei after self,intraspecific cross and interspecific cross-pollination［J］.J Nanjing For Univ Nat Sci Ed,2013,37（4）:1－7.

［9］王改萍，楊紅寧，倪果果，等.楸樹等4種梓屬樹種花粉離體培養(yǎng)條件的研究［J］.植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2009，18（2）：34－42.WANG Gaiping YANG Hongning,NI Guoguo,et al.Study on in vitro culture conditions of pollens from four tree species of Catalpa Scop.including Catalpa bungei［J］.J Plant Res Environ,2009,18（2）:34－42.

［10］王改萍，彭方仁，徐濤，等.幾種不同楸樹花粉萌發(fā)率的測(cè)定及花粉超低溫保存方法［J］.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2008，32（5）：123－126.WANG Gaiping,PENG Fangren,XU Tao,et al.Studies on pollen germination and cryopreservation method in different species of Catalpa［J］.J Nanjing For Univ Nat Sci Ed,2008,32（5）:123－126.

［11］郝明灼，彭方仁，王改萍，等.楸樹人工雜交授粉試驗(yàn)及種實(shí)分析［J］.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2008，32（5）：131－134.HAO Mingzhuo,PENG Fangren,WANG Gaiping,et al.Artificial pollination test and analysis of hybrid seed of Catalpa bungei［J］.J Nanjing For Univ Nat Sci Ed,2008,32（5）:131－134.

［12］李惠敏，秦新民，覃屏生，等.超聲波提取沙田柚花粉管可溶性蛋白的初步研究［J］.廣西師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2004，22（1）：82－86.LI Huimin,QIN Xinmin,QIN Pingsheng,et al.Research on ultrasonic wave extracting proteins from pollen tubes of Shatinyu［J］.J Guangxi Univ Nat Sci Ed,2004,22（1）:82－86.

［13］郭紅彥，吳青霞，彭方仁.銀杏枝條營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)藏蛋白質(zhì)的組分及動(dòng)態(tài)變化［J］.林業(yè)科學(xué)，2009，45（3）：24－29.GUO Hongyan,WU Qingxia,PENG Fangren.Components and dynamics of vegetative storage proteins in the branch of Ginkgo biloba［J］.Sci Silv Sin,2009,45（3）:24－29.

［14］王振宇，楊春瑜，金鐘躍.超聲波提取蘆薈凝膠的工藝［J］.東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，30（4）：72－73.WANG Zhenyu,YANG Chunyu,JIN Zhongyue.The technology of abstracting aloe gelatin by ultrasonic［J］.J Northeast For Univ,2002,30（4）:72－73.

［15］徐超，吳小芹，林司曦，等.馬尾松根部蛋白雙向電泳分離體系的構(gòu)建［J］.南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011，35（1）：15－18.XU Chao,WU Xiaoqin,LIN Sixi,et al.Establishment of two-dimensional gel electrophoresis system for analyzing the root protein of Pinus massoniana［J］.J Nanjing For Univ Nat Sci Ed,2011,35（1）:15－18.

［16］胡桂萍，賈憲波，劉波，等.芽胞桿菌菌體蛋白提取方法的比較［J］.生物技術(shù)通訊,2013,24（5）:698－671.HU Guapan,JIA Xianbo,LIU Bo,et al.Comparison of the methods to extract proteins from Bacillus spp.［J］.Lett Biotechnol,2013,24（5）:698－671.

［17］MAYFIELD J A,FIEBIG A,JOHNSTONE S E,et al.Gene families from the Arabidopsis thaliana pollen coat proteome［J］.Science,2001,292（5526）:2482－2485.

［18］劉寶敬，宋明，李成瓊，等.等電聚焦電泳測(cè)定甘藍(lán)自交不親和性研究［J］.西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，20（2）：104－110.LIU Baojing,SONG Ming,LI Chengqiong,et al.Rapid inentification of self-incompatibility of cabbage（Brassica oleracea L.）with isoelectric focusing［J］.J Southwest Agric Univ,1998,20（2）:104－110.

Pollen-wall protein extraction and characteristics of Catalpa bungei

WANG Gaiping,XU Tao,FAN Lili,PENG Fangren,Lü Xin,CHEN Linyue
（College of Forestry,Nanjing Forstry University,Nanjing 210037,Jiangsu,China）

Abstract:The research was conducted to further reveal the self-incompatibility that exists extensively Catalpa bungei and to evaluate the best way to extract pollen-wall protein of Catalpa,including the Catalpa bungei plants CB-1 from Yuntaishan National Forest Park of Lianyungang and CB-2 from Laoshan Forest of Nanjing and Catalpa fargesii f.duclouxii（CF）using incorporation and ultrasonication.Also,the content and component of pollen-wall protein from different varieties was compared by the Coomassie Blue Staining Method and SDS（sodium dodecyl sulfate）-polyacrylamide gel electrophoresis（PAGE）.Results showed that the relative optimization method to extract pollen-wall protein of C.bungei was ultrasonication with the optimal parameters being:ultrasonication at 400 W power for 3 s every 6 s for 3 rounds taking 120 duplications at an interval of 5 min.The optimal pH value to extract pollen-wall protein was pH 7.8（F＞F(0.05)）.For pollen-wall protein content,CF was higher（F＞F(0.01)）than both CB-1 and CB-2.From the pollen of these three catalpas,26 proteins were found.Molecular weight of the specific proteins for CB-1 were 53.8 kDa,35.0 kDa,23.4 kDa,and 26.5 kDa;for CB-2 they were 53.8 kDa,38.5 kDa,and 23.4 kDa;and for CF they were 8.5 kDa and 26.5 kDa.［Ch,6 fig.1 tab.18 ref.］

Key words:botany;Catalpa bungei;ultrasonication;protein;SDS-PAGE

作者簡(jiǎn)介：王改萍，從事森林培育及植物生理生化研究。E-mail：wanggaiping@njfu.edu.cn。通信作者：彭方仁，教授，博士，博士生導(dǎo)師，從事用材林及經(jīng)濟(jì)林的栽培與利用等研究。E-mail：frpeng@njfu.edu.cn

基金項(xiàng)目：“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃子項(xiàng)目（2012BAD21B03）；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目（PAPD）

收稿日期：2015-03-02；修回日期；2015-06-02

doi:10.11833/j.issn.2095-0756.2016.01.009

中圖分類號(hào)：S718.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：2095-0756（2016）01-0065-06