光肩星天牛對山核桃揮發(fā)性組分的觸角電位分析

杜和芬，王佩星，徐華潮，張娓娓，王紫薇（.浙江省溫州市龍灣區(qū)農(nóng)林局，浙江溫州3504；.浙江農(nóng)林大學林業(yè)與生物技術學院，浙江臨安3300）

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光肩星天牛對山核桃揮發(fā)性組分的觸角電位分析

杜和芬1，王佩星2，徐華潮2，張娓娓2，王紫薇2
（1.浙江省溫州市龍灣區(qū)農(nóng)林局，浙江溫州325024；2.浙江農(nóng)林大學林業(yè)與生物技術學院，浙江臨安311300）

摘要：光肩星天牛Anoplophora glabripennis近年來危害山核桃Carya cathayensis，給浙江省臨安市山核桃產(chǎn)業(yè)造成巨大影響。為給光肩星天牛引誘劑和驅(qū)避劑的開發(fā)提供基礎數(shù)據(jù)，測定光肩星天牛成蟲對α-蒎烯、β-蒎烯、對二氯苯、鄰二甲苯、莰烯、檸檬烯、樟腦、羅勒烯、對乙基苯乙酮等9種山核桃植株揮發(fā)物5個濃度的觸角電位（EAG）反應。結果表明：光肩星天牛雌蟲觸角對β-蒎烯的EAG活性高于其他化合物，而雄蟲觸角對檸檬烯、羅勒烯有明顯的EAG反應。此外，光肩星天牛雄蟲觸角對檸檬烯的EAG反應活性隨濃度的升高而加大，而光肩星天牛雄蟲觸角對樟腦的EAG反應活性則隨濃度的升高而降低。表明天牛觸角對不同種揮發(fā)物質(zhì)的不同濃度所產(chǎn)生的EAG活性都存在差異，且雌雄差異顯著（P＜0.05）。這些特性很有可能為研發(fā)高效特異性光肩星天牛引誘劑與趨避劑提供理論基礎。表2參19

關鍵詞：森林保護學；光肩星天牛；山核桃；植株揮發(fā)物；觸角電位

山核桃Carya cathayensis為中國特有珍貴干果和木本油料，主產(chǎn)于浙皖交界的天目山區(qū)。然而山核桃受云斑天牛Batocera horsfieldi，桑天牛Apriona germari，光肩星天牛Anoplophora glabripennis等多種天牛的危害日趨嚴重，幼蟲蛀食山核桃枝干，嚴重時甚至造成整株枯死［1－2］。光肩星天牛是一類重要的森林昆蟲，種類繁多，分布廣泛［3－4］。天牛類蛀干型害蟲的幼蟲具有隱蔽活動、分散危害的特點［5］。針對天牛成蟲期在外裸露活動、補充營養(yǎng)等習性，從天?；瘜W生態(tài)學及其行為防治技術的研究，探明植物揮發(fā)性次生物質(zhì)的組分以及天牛的化學感受器對植物揮發(fā)物的反應機制，已成為防控天牛類蛀干害蟲的主要研究方向，有助于開發(fā)天牛植物源引誘劑或驅(qū)避劑，提出天牛類蛀干害蟲防治的新策略［6－7］。天牛雌、雄成蟲觸角對植物揮發(fā)性化合物反應的敏感部位位于末端，利用常規(guī)的電生理方法即可以檢測出揮發(fā)物是否會引起昆蟲生理反應［8］。觸角電位（electroantennagraphy，EAG）是最早用于昆蟲信息物質(zhì)研究的電生理技術，由于其高靈敏度和選擇性，在快速檢測昆蟲信息物質(zhì)中得到了廣泛的應用［6］。已有研究表明：光肩星天牛成蟲對月桂烯、水芹烯、蒈烯、莰烯、蒎烯、檸檬烯、羅勒烯、乙酸乙酯和正己烷等植物揮發(fā)物均有明顯的EAG反應［9］。本研究通過探討不同寄主山核桃植株揮發(fā)物對光肩星天牛EAG反應的影響，以期研究天牛類蛀干害蟲感知植物氣味的機制，為光肩星天牛植物源引誘劑與趨避劑的研究做鋪墊。

1　試驗材料

1.1供試昆蟲

研究所用的光肩星天牛雌、雄成蟲來自于浙江省臨安市橫路鄉(xiāng)登村山核桃林。將受蟲害山核桃植株砍下后，由浙江農(nóng)林大學森林保護重點實驗室人工飼養(yǎng)，溫度為25℃，濕度75%，待其幼蟲羽化飛出即可。選取處于初羽化狀態(tài)的天牛成蟲用作實驗材料。

1.2供試植物源揮發(fā)性物質(zhì)及其配制

采用頂空吸附采樣的方法收集山核桃植株的氣體揮發(fā)物。根據(jù)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography/mass spectrum,GC-MS）對寄主山核桃植株揮發(fā)性氣體的化學成分測定分析后，選擇其中的10種揮發(fā)性物質(zhì)單體進行EAG分析。其純度及來源見表1。

表1　光肩星天牛EAG試驗所用的10種標準揮發(fā)物的名稱、純度及來源Table 1 Name,purity and sources of 10 kinds of standard volatiles

將各種揮發(fā)物標準品分別溶于液體石蠟中，并使用渦旋混合器使其充分混合，配制成基本濃度為1.0 mol·L－1的溶液。試驗前分別用液體石蠟將其稀釋成所需濃度。試驗設為10－1，10－2，10－3，10－4和10－5mol·L－1等5個不同濃度，以液體石蠟（天津市百世化工有限公司）作對照。

2　試驗設計

2.1觸角電位反應

本研究采用的觸角電位儀由荷蘭Syntech公司生產(chǎn)的智能化數(shù)據(jù)獲取控制器IDAC-4，微動操作儀Syntech MN-151，刺激氣流控制器Syntech CS-55，及Syntech軟件處理系統(tǒng)組成。刺激氣流流速設定為400.0 mL·min－1,持續(xù)氣流流速設定為100.0 mL·min－1，刺激時間為0.5 s，2次刺激的間隔為40 s［12］。

濾紙剪成1.5 cm×0.8 cm大小，對折成1.5 cm×0.4 cm塞入干凈的巴斯德管頂部，用作揮發(fā)物的載體，塞入后的濾紙能夠在巴斯德管內(nèi)滑動為宜。試驗時每次用移液器將待測樣品均勻滴于濾紙載體上，并將其滑入巴斯德管內(nèi)［10－11］。測試的計量為10 μL·次－1。

選擇活躍的剛羽化的光肩星天牛成蟲，在用鋒利的手術刀片將其整根觸角從基部切下，再切除觸角鞭節(jié)的尖端少許末梢。觸角柄節(jié)端用Spectra 360型導電膠固定在參考電極上，切開小口的觸角末鞭節(jié)端通過導電膠與記錄電極相接［11］。調(diào)整氣味混合管與觸角間距離為1.0 cm。觸角的活性因離體時間的延長而降低，測試過程中需定時標定觸角的活性。標定方法：在各種揮發(fā)物EAG測定前后各做1次10－3mol·L－1濃度的β-石竹烯（aladdin industrial corporation）標樣的EAG測定［11-12］。

測定光肩星天牛雌、雄成蟲對5個濃度梯度寄主植物揮發(fā)物單品的EAG反應，測試以濃度從低到高的順序進行，刺激部位為觸角最敏感節(jié)端部第2節(jié)，以液體石蠟為對照，重復刺激光肩星天牛雌、雄成蟲各3只觸角，重復測定5次·觸角－1。

為了消除外界影響，以同濃度的石蠟油溶液為對照，測定樣品前后分別用對照溶液測定1次。將樣品EAG測量值減去前后對照的平均值，得到樣品EAG反應的絕對值。以標準化合物質(zhì)量分數(shù)為1‰β-石竹烯的EAG值為參比，消除不同天牛對氣體反應存在的個體差異。參比值減去前后對照溶液的平均值，得到參比樣品EAG反應的標準值。將樣品反應的絕對值除以參比樣品反應的標準值，得到了樣品反應的相對值［11］。

2.2數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法

所有試驗數(shù)據(jù)皆采用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析。2個因素間差異顯著性用配對樣本t檢驗。單變量雙因素間的交互作用采用單變量多因素方差分析法。最小顯著差多重比較法（LSD）分析各組間的配對比較。

3　結果與分析

光肩星天牛成蟲對9種揮發(fā)物10－1，10－2，10－3，10－4和10－5mol·L－1等5個濃度的EAG反應，根據(jù)每次試驗所測量的對照值及參照值分別計算樣本EAG反應相對值，如表2所示。光肩星天牛雌、雄蟲對上述9種植物揮發(fā)性化合物的刺激反應存在較大的差異，除對鄰二氯苯、對二甲苯、樟腦、對乙基苯乙酮、α-蒎烯、β蒎烯、羅勒烯等的個別濃度反應差異不顯著之外，雌、雄成蟲對其余大部分揮發(fā)物的EAG反應差異顯著（P＜0.05）。此外，光肩星天牛對同種化合物的不同濃度的EAG反應相對值存在顯著性差異。

光肩星天牛雄蟲對10－4，10－5mol·L－1等2個濃度的莰烯，10－1，10－2，10－3、10－4，10－5mol·L－1等5個濃度羅勒烯，10－1，10－3mol·L－1等2個濃度的β-蒎烯，10－2，10－3，10－5mol·L－1等3個濃度的α-蒎烯，10－2，10－3，10－4，10－5mol·L-1等4個濃度的對二甲苯，10－3，10－4，10－5mol·L－1等3個濃度的樟腦以及10－1，10－2，10－3，10－4，10－5mol·L－1等5個濃度的檸檬烯的EAG相對反應值較大，反應較為顯著。對10－1，10－2，10－3，10－4，10－5mol·L－1等5個濃度的對乙基苯乙酮的EAG相對反應值較小，表明光肩星天牛雄蟲對其不敏感。

光肩星天牛雌蟲對10－2，10－3mol·L－1等2個濃度的莰烯，10－1，10－2，10－3，10－4，10－5mol·L－1等5個濃度的β-蒎烯，10－1，10－2，10－3，10-4mol·L－1等4個濃度的α-蒎烯，10－1，10－4，10－5mol·L－1等3個濃度的鄰二氯苯，10－1，10－3，10－4mol·L－1等3個濃度的對二甲苯，10－2，10－3，10－4，10－5mol·L－1等4個濃度的對乙基苯乙酮，10－1，10－2，10－3，10－4，10－5mol·L－1等5個濃度的樟腦的EAG相對反應值較大，反應較為顯著。而對10－1，10－2，10－3，10－4，10－5mol·L－1等5個濃度的羅勒烯以及檸檬烯的EAG相對反應值較小，這點與光肩星天牛雄蟲的反應正好相反。

光肩星天牛雄蟲對羅勒烯、對二甲苯、樟腦、檸檬烯以及α-蒎烯反應較為明顯，其中對檸檬烯的EAG反應值最大，對鄰二氯苯和對乙基苯乙酮則幾乎無明顯反應；光肩星天牛雌蟲對樟腦、β-蒎烯以及α-蒎烯的EAG反應效果明顯，其中對β-蒎烯的EAG反應值最大，對莰烯、鄰二氯苯以及檸檬烯反應不明顯。

表2　光肩星天牛成蟲對山核桃揮發(fā)物成分單品的EAG反應相對值Table 2 Relative EAG responses of beetles to five different concentrations of 9 kinds of volatile compounds

4　結論與討論

本研究通過從觸角電位圖中獲取光肩星天牛成蟲對山核桃植株揮發(fā)性氣體化合物的反應情況。山核桃植株釋放的揮發(fā)性氣體是由數(shù)十種化合物組合而成，且受不同的生境影響化合物的成分組成與濃度比例不同。通過使用各種揮發(fā)性化合物的不同濃度一一刺激光肩星天牛的觸角，篩選出最佳的揮發(fā)性化合物種類以及濃度，設計出針對光肩星天牛最為有效的植物源引誘劑配方。

從數(shù)據(jù)分析可知，光肩星天牛成蟲對上述9種山核桃植株氣體揮發(fā)物的EAG反應程度存在較大的差異，如光肩星天牛雄蟲對羅勒烯、對二甲苯、樟腦、檸檬烯以及α-蒎烯反應較為明顯，其中對檸檬烯的EAG反應值最大，對鄰二氯苯和對乙基苯乙酮則幾乎無反應；光肩星天牛雌蟲對樟腦、β-蒎烯以及α-蒎烯的EAG反應效果明顯，其中對β-蒎烯的EAG反應值最大，對莰烯、鄰二氯苯以及檸檬烯反應不明顯。

光肩星天牛雌、雄蟲對山核桃植物揮發(fā)性化合物的反應存在較大的差異，在今后植物源引誘劑的研制方面需要加以注意，雄蟲對羅勒烯、檸檬烯以及α-蒎烯的反應明顯，對檸檬烯的EAG反應相對反應值隨濃度遞增，對其余化合物則在濃度達最大值時EAG反應相對值有下降；雌蟲則對α-蒎烯、β-蒎烯反應明顯，使用10－2mol·L－1濃度處理雌蟲觸角所獲得的EAG反應相對值達到所有試驗最大值，足以說明雌蟲對β-蒎烯的敏感度，與雄蟲相比最為明顯的區(qū)別是雌蟲對各濃度的檸檬烯皆不敏感，對羅勒烯則起初隨著濃度上升，EAG反應相對值也呈上升趨勢，到達10－3mol·L－1時，EAG反應相對值達到最大，隨后則有下降的趨勢。雌蟲對樟腦的EAG反應相對明顯。

由于不同性別的昆蟲存在嗅覺生理方面的特殊差異，直接導致在尋找寄主、繁殖后代等行為中所起的作用不同［12－13］。光肩星天牛雌、雄個體之間觸角感受器的類型雖沒存在明顯差異，但感受器的分布存在性二型現(xiàn)象，這種差異也體現(xiàn)在本次研究之中［13－14］。雌、雄個體觸角感受器針對不同濃度的寄主揮發(fā)物產(chǎn)生的活性不同可能與嗅覺相關蛋白（氣味結合蛋白、氣味降解酶、化學感受蛋白、感覺神經(jīng)元膜蛋白、氣味受體）和甘油激酶、清道夫受體、β-乙酰葡萄糖胺轉移酶同源蛋白等有關，但由于目前針對鞘翅目相關嗅覺基因家族報道的內(nèi)容較少，且已報道的受體蛋白同源性均較低，尚不能系統(tǒng)的解釋上述差異［14－15］。

由于EAG反應僅能表示光肩星天牛對揮發(fā)性化合物的敏感程度，不能說明光肩星天牛究竟是趨向還是趨避，所以需要通過下一步行為測試才能獲知其效果。光肩星天牛在識別寄主植物的過程中，寄主植物釋放的揮發(fā)性信息化學物質(zhì)起著重要的通信引導作用［16－17］。寄主植物所釋放的氣味源于多種微濃度揮發(fā)性次生物質(zhì)組成的復雜混合體，植物揮發(fā)物對昆蟲的驅(qū)避、引誘等同樣源于多種揮發(fā)物的協(xié)同作用［18－19］。利用這些天然的揮發(fā)性化學物質(zhì)來防治光肩星天牛具有很重要的理論和實踐意義。目前，針對光肩星天牛還有許多基礎研究和應用研究工作還未完成，如進一步對光肩星天牛觸角感受器的透射電鏡以及觸角結合蛋白開展深入研究，探明光肩星天牛寄主選擇定位化學信息的指紋圖譜，明確光肩星天牛觸角內(nèi)特異氣味識別系統(tǒng)及其分子作用機制，尚需致力于該研究領域的相關學者共同努力。

5　參考文獻

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EAG responses of Asian longhorn beetle Anoplophora glabripennis（Coleoptera:Cerambycidae）to volatiles of hickory

DU Hefen1,WANG Peixing2,XU Huachao2,ZHANG Weiwei2,WANG Ziwei2
（1.Agriculture and Forest Enterprise of Longwan District,Wenzhou 325024,Zhejiang,China;2.School of Forestry and Biotechnology,Zhejiang A &F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China）

Abstract:To provide basic information for development of attractants and repellents of Anoplophora glabripennis,electroantennography（EAG）instrumentation was used to examine the EAG response of A.glabripennis adults to nine kinds of Carya cathayensis（hickory）volatiles,including:α-pinene,β-pinene,ocimene,1,4-dichlorobenzene,1,2-xylene,camphene,limonene,camphorand and so on,at five concentrations（10(－1),10(－2),10(－3),10(－4),10(－5)mol·L(－1)）.Significant differences（P＜0.05）were present for the feeling strength of the antennae in relation to volatiles from female and male adults.For female adults β-pinene elicited the highest EAG response（relative EAG values is about 17.4）,for male adults EAG responses to limonene and ocimene were appresent（relative EAG values is about 13.4 and 7.3）.In addition,EAG showed a response to different concentrations of volatile matter for tentacles,significantly different among different samples（P＜0.05）by LSD method.This study will provide a theoretical foundation for research and development of attractants and repellents of A.glabripennis.［Ch,2 tab.19 ref.］

Key words:forest protection;Anoplophora glabripennis;Carya cathayensis（hickory）;volatiles;electroantennography（EAG）

作者簡介：王佩星，從事森林有害昆蟲綜合防治研究。E-mail：wpx126@126.com。通信作者：徐華潮，教授，博士，博士生導師，從事昆蟲系統(tǒng)學及有害生物綜合治理研究。E-mail：xhcinsect@zafu.edu.cn

基金項目：浙江省重大科技專項重點項目（2010C12029）；國家重點基礎研究發(fā)展計劃（“973”計劃）項目（2009CB119205）；浙江農(nóng)林大學科研發(fā)展基金人才啟動項目（2013FR061）

收稿日期：2015-01-31；修回日期：2015-03-20

doi:10.11833/j.issn.2095-0756.2016.01.022

中圖分類號：S763.38

文獻標志碼：A

文章編號：2095-0756（2016）01-0166-06