Gene X-pert Mtb/RIF檢測技術(shù)與抗酸染色和BD960培養(yǎng)、藥敏的比對研究

布紅麗，張　麗，智霞萍，楊順利

(太原市第四人民醫(yī)院，山西 太原　030053)

?

·臨床醫(yī)學(xué)·

Gene X-pert Mtb/RIF檢測技術(shù)與抗酸染色和BD960培養(yǎng)、藥敏的比對研究

布紅麗，張麗，智霞萍，楊順利

(太原市第四人民醫(yī)院，山西 太原030053)

[摘要]目的：評價(jià)Gene X-pert Mtb/RIF檢測痰標(biāo)本診斷結(jié)核病和結(jié)核菌對利福平耐藥的效能。方法：采用2014年10月～2015年7月太原市第四人民醫(yī)院收集的確診結(jié)核病患者的痰標(biāo)本進(jìn)行涂片、BD960培養(yǎng)、BD960藥敏試驗(yàn)及Gene Xpert Mtb/RIF檢測，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對Gene Xpert Mtb/RIF與不同檢測方法進(jìn)行敏感度分析。結(jié)果：Gene X-pert Mtb/RIF檢測技術(shù)敏感度均高于涂片和BD960培養(yǎng)(P<0.05)，利福平耐藥與BD960利福平耐藥無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論：Gene Xpert Mtb/RIF檢測技術(shù)是一種快速、自動(dòng)化程度高、操作簡便的結(jié)核病分子生物學(xué)診斷技術(shù)，為臨床快速診斷結(jié)核病及是否對利福平耐藥提供了有力的實(shí)驗(yàn)室佐證。

[關(guān)鍵詞]結(jié)核病；涂片；Gene Xpert Mtb/RIF檢測；BD960培養(yǎng)

1資料與方法

1.1一般資料

收集太原市第四人民醫(yī)院2014年10月～2015年7月住院的結(jié)核患者200例，男110例，女90例；其他呼吸道(非結(jié)核病)疾病患者30例，其中肺癌患者8例，支氣管擴(kuò)張10例，慢性阻塞性肺病12例。

1.2儀器、試劑

抗酸染色液生產(chǎn)廠家為珠海貝索生物技術(shù)有限公司；培養(yǎng)及藥敏所用儀器為美國碧迪醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)的BACTEC MGIT960全自動(dòng)分枝桿菌檢測系統(tǒng)，試劑均為BD960配套試劑，由碧迪醫(yī)療器械有限公司提供；Gene Xpert Mtb/RIF儀器及試劑由美國Cepheid公司提供；結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株由國家CDC結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3研究方法

1.3.1涂片抗酸染色涂片抗酸染色按照《痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊》的要求操作。

1.3.2培養(yǎng)及菌種鑒定同時(shí)進(jìn)行BD960液體快速培養(yǎng)，培養(yǎng)陽性標(biāo)本再進(jìn)行BD960藥敏試驗(yàn)，操作如下：痰液標(biāo)本的前處理：a) 挑去5 mL痰液至50 mL已標(biāo)記的離心管中；b) 加等量的2%NALC-NaOH前處理液，強(qiáng)力旋渦振蕩20 s；c) 室溫靜置15～20 min；d) 加無菌PBS(PH6.8)至約50 mL，蓋緊蓋子，離心3 000轉(zhuǎn)，15 min，倒掉上清液；e) 添加1～3 mLPBS(PH6.8)以制備成懸濁液。標(biāo)本接種：標(biāo)本接種前，在MGIT 7 mL培養(yǎng)管中先加入0.8 mLGrowth Supplement溶解后的PANTA(雜菌抑制劑)；接種0.5 mL處理后的標(biāo)本至BBL MGIT培養(yǎng)管中，然后上機(jī)檢測，報(bào)告陽性者同時(shí)做涂片抗酸染色確認(rèn)，注意涂片染色陽性的分支桿菌并不都是結(jié)核菌，只是抗酸染色陽性。陽性同時(shí)做菌種鑒定，接種在濃度為50 μg/mL對硝基苯甲酸培養(yǎng)基上。

1.3.3藥敏試驗(yàn)報(bào)陽1 d或2 d，無需稀釋，顛倒混勻后準(zhǔn)備直接接種，報(bào)陽第3天至第5天。取1 mL陽性肉湯到4 mL無菌生理鹽水，混勻(1∶5稀釋)，加0.8 mLBACTECTM MGITTM960 SIRE添加劑至每一試管，加100 μL利福平藥物至標(biāo)記好的MGIT管，再加入菌液0.5 mL，將準(zhǔn)備好的MGIT管放入標(biāo)記好的AST試管架，并按放管程序放入BACTEC MGIT960儀器中進(jìn)行檢測。

1.3.4Gene Xpert Mtb/RIF檢測至少收集1 mL痰液樣品，裝入50 mL離心管中，加入Gene Xpert樣品試劑2∶1，蓋好蓋子，劇烈搖動(dòng)10～20次，室溫培養(yǎng)15 min，使用試劑盒提供的專用無菌移液管，將液化的樣品吸入，直至彎月面在移液管的最低標(biāo)記處，打開檢測盒子，將處理好的樣品由檢測盒的加樣孔緩慢加入，不要產(chǎn)生氣泡，確保蓋子蓋緊，將樣品反應(yīng)盒放入Gene Xpert儀器的樣品艙中進(jìn)行DNA的提取、PCR擴(kuò)增和結(jié)果的檢測，通過專用軟件判讀結(jié)果。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1診斷情況

200例住院患者按照《肺結(jié)核診斷和治療指南》(中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病分會(huì))診斷為結(jié)核病患者[1]，30例診斷為非肺結(jié)核病患者。

2.2細(xì)菌學(xué)檢測結(jié)果

200例住院患者痰涂片顯微鏡檢查，其中涂片陽性68例(34%)，涂片陰性132例(66%)，結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株涂片陽性。其中192例住院患者進(jìn)行BD960培養(yǎng)(8例由于其他原因未進(jìn)行BD960培養(yǎng)培養(yǎng))，陽性結(jié)果108例(56.25%)，培養(yǎng)陰性結(jié)果84例(43.75%)，結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株培養(yǎng)陽性，經(jīng)菌種鑒定為結(jié)核分枝桿菌的191例，非結(jié)核分枝桿菌1例。107例結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性患者進(jìn)行BD960藥敏試驗(yàn)(1例非結(jié)核分枝桿菌未做BD960藥敏試驗(yàn))，對利福平耐藥32例(29.9%)。30例非結(jié)核患者涂片抗酸染色鏡檢陽性1例，經(jīng)PNB菌種鑒定為非結(jié)核分枝桿菌；陰性29例，BD960培養(yǎng)陽性0例，陰性30例。

2.3Gene Xpert Mtb/RIF檢測結(jié)果

200例住院患者經(jīng)Gene Xpert Mtb/RIF檢測陽性結(jié)果136例(68%)，陰性結(jié)果68例(32%)，30例非結(jié)核病患者經(jīng)Gene Xpert Mtb/RIF檢測陽性結(jié)果1例，陰性29例，結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株檢測陽性。經(jīng)Gene Xpert Mtb/RIF檢測136例陽性結(jié)果中利福平耐藥45例(33.1%)，BD960藥敏試驗(yàn)利福平耐藥患者32例， Gene Xpert Mtb/RIF檢測均耐藥(見表1)。

表1　Gene Xpert Mtb/RIF檢測結(jié)果　　例

2.4Gene Xpert Mtb/RIF檢測靈敏度和特異度比較分析

200例肺結(jié)核患者中，陽性136例，提示該方法敏感度為68%(136/200)，30例非結(jié)核患者中陰性為29例，表明該方法的特異度為96.67%(29/30)(見表1)。

2.53種方法檢測結(jié)果分析

200例住院患者進(jìn)行涂片檢查，涂片陰性132例，涂片陽性68例，陽性率34.00%，其中192例患者做了BD960結(jié)核菌培養(yǎng)，陰性84例，陽性108例，陽性率56.25%，與Gene Xpert Mtb/RIF檢測結(jié)果比較，陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=36.70,P<0.05)。BD960利福平耐藥測定和Gene Xpert Mtb/RIF耐藥測定兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.11，P>0.05)(見表2)。

表2　3種方法檢測結(jié)果比較分析　　例

3討論

由于分枝桿菌培養(yǎng)及其核苷酸擴(kuò)增的技術(shù)較為復(fù)雜，全球“僅少數(shù)”患有耐藥肺結(jié)核的患者可獲得充分敏感的診斷性檢測和藥物敏感性測試。全球范圍內(nèi)，無效的肺結(jié)核檢測、不斷增長的多藥耐藥和廣泛耐藥的肺結(jié)核致使在肺結(jié)核流行的國家需要大力提高結(jié)核桿菌的培養(yǎng)和耐藥性檢測能力[2]。

Xpert MTB/RIF 核酸檢測采用Cepheid公司Gene xpert檢測系統(tǒng)，是世界上唯一的全自動(dòng)一體化實(shí)時(shí)定量PCR體外診斷技術(shù)；全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)能自動(dòng)完成并整合以下過程；核酸提取，擴(kuò)增以及目標(biāo)序列，在單或者復(fù)雜樣品中的檢測，采用一次性特定分析用Gene xpert檢測盒制備和處理樣本，將是樣本和所需試劑加入到檢測盒中，然后將試劑盒放到一個(gè)可用的設(shè)備模塊之中。Xpert MTB/RIF檢測技術(shù)針對rpoB基因81bp利福平耐RRDR區(qū)間設(shè)計(jì)引物，探針，檢測其是否發(fā)生突變進(jìn)而用于診斷患者是否結(jié)核以及是否利福平耐藥(rpoB序列存在突變)[3]。本研究Gene xpert檢測結(jié)核桿菌敏感度均高于痰涂片和BD960培養(yǎng)，利福平耐藥率與BD960檢測利福平耐藥率比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。利福平作為重要的抗結(jié)核藥物，被世界衛(wèi)生組織推薦為治療結(jié)核病的一線藥物，耐利福平結(jié)核病危害嚴(yán)重。世界衛(wèi)生組織將同時(shí)對利福平和異煙肼耐藥的結(jié)核病稱為MDR—TB，MDR—TB治療時(shí)間長，治療難度大，治療費(fèi)用高，治愈率低，已成為結(jié)核病控制的難題。Xpert MTB/RIF 核酸檢測全程只需2.5 h，與也屬于快速培養(yǎng)的BD960比較，檢測結(jié)果更加快速，可以在第一時(shí)間診斷患者是否結(jié)核及是否對利福平耐藥，為結(jié)核病的早期快速診斷提供了實(shí)驗(yàn)室的診斷依據(jù)。因此，世衛(wèi)組織遏制結(jié)核病司司長Maoio Rarig lione博士評價(jià)Xpert MTB/RIF檢測方法是全球結(jié)核病診斷和治療方法的一個(gè)重要里程碑，為患結(jié)核病和耐藥結(jié)核病危險(xiǎn)的數(shù)百萬人帶來了新希望。但是該方法也有它的局限性，僅能檢測利福平耐藥，缺乏對異煙肼耐藥的檢測，不能快速診斷出MDR-TB，且儀器及試劑均很昂貴，這些均會(huì)限制其應(yīng)用。

總之，Xpert Mtb/RIF檢測操作簡單、快速,不易造成交叉污染，對生物安全性要求很低并且檢測敏感度高于涂片鏡檢法，BD960液體培養(yǎng)，同時(shí)該方法可以診斷患者是否對利福平耐藥,在我國結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷方面具有非常好的應(yīng)用前景。

[參考文獻(xiàn)]

[1]中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病分會(huì).肺結(jié)核診斷和治療指南[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2001,24(2):70-74.

[2]胡忠義.結(jié)核病耐藥檢測技術(shù)進(jìn)展及存在的問題和對策[J].中國防癆雜志,2014,35(11)：865-867.

[3]李輝，譚耀駒，李洪敏，等.利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)的診斷效果對比研究[J].中國防癆雜志,2014,36(6)：472-476.

本文編輯：王知平

The Comparison Research on Gene X-pert Mtb/RIF Detection Technology and Acid Fast Stain and BD960 Culture and Drug Sensitivity

BU Hongli,ZHANG Li,ZHI Xiaping,YANG Shunli

(TheFourthPeople'sHospitalofTaiyuan,Taiyuan030053,Shanxi,China)

[ABSTRACT]Objective: To evaluate the efficiency of Gene X-pert Mtb/RIF detection of sputum specimens diagnosis of TB on drug resistant tuberculosis bacterium of rifampicin.Methods: The sputum specimens diagnosed cases of tuberculosis patients from Oct.2014 to July 2015 were conducted a smear, BD960 cultivated, BD960 drug sensitive test and Gene X-pert Mtb/RIF detection.The sensitivity analysis based on the a statistical approach were achieved on Gene X-pert Mtb/RIF and the different test methods.Results: The sensitivity of Gene X-pert Mtb/RIF detection technology was higher than the smear, BD960 cultivation(P<0.05). There was no statistically significant difference in the drug resistance of rifampicin and BD960 drug resistance of rifampicin(P>0.05). Conclusion: Gene X-pert Mtb/RIF detection technology is a kind of Tuberculosis (TB) diagnosis technology of molecular biology, which is fast, convenient to use automatically.It provides a powerful laboratory evidence to perform the rapid diagnosis of tuberculosis (TB) and judge whether the rifampicin resistants in the clinic treatment.

[KEYWORDS]tuberculosis (TB); smear; Gene X-pert Mtb/RIF detection; BD960 cultivation

[中圖分類號]R446.5

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1671-0126(2016)01-0011-03

[作者簡介]布紅麗，女，副主任技師，從事醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)工作