高羊茅在低氮脅迫下的蛋白組學(xué)分析

李小冬，舒健虹，于二汝，吳佳海，蔡一鳴，王小利*

(1.貴州省草業(yè)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006；2.貴州省油料研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006)

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高羊茅在低氮脅迫下的蛋白組學(xué)分析

李小冬1，舒健虹1，于二汝2，吳佳海1，蔡一鳴1，王小利1*

(1.貴州省草業(yè)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006；2.貴州省油料研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006)

摘要：為了研究高羊茅在低氮脅迫條件下的蛋白水平變化，我們采用iTRAP技術(shù)分析了氮脅迫30 d的高羊茅葉片中蛋白組學(xué)的變化。一共檢測(cè)到595個(gè)差異蛋白(295個(gè)上調(diào)，300個(gè)下調(diào))，分別參與了多個(gè)不同的代謝途徑。在高嚴(yán)謹(jǐn)篩選標(biāo)準(zhǔn)下，氮代謝、氧化還原反應(yīng)以及脅迫相關(guān)代謝等多個(gè)途徑的基因被明顯上調(diào)表達(dá)。通過(guò)生理生化測(cè)定發(fā)現(xiàn)，葉綠素、可溶性蛋白以及游離氨基酸的含量顯著下降，而過(guò)氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)以及谷胱甘肽合成酶(GS)等活性氧清除酶活性顯著升高。采用熒光定量PCR的方法驗(yàn)證蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)所有挑選的基因都具有相同的變化趨勢(shì)。分析顯著富集的14-3-3基因家族的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其都能被低氮脅迫誘導(dǎo)，因此脅迫相關(guān)的基因可能是調(diào)節(jié)高羊茅抵抗多種不同逆境的關(guān)鍵基因。本文首次在高羊茅中采用蛋白組學(xué)的方法分析低氮脅迫條件下基因的表達(dá)變化，獲得重要候選基因，并對(duì)其應(yīng)用進(jìn)行了討論。

關(guān)鍵詞：高羊茅；低氮脅迫；蛋白組學(xué)；表達(dá)分析

非生物脅迫限制植物的生長(zhǎng)發(fā)育與作物產(chǎn)量，植物主要通過(guò)兩種方式來(lái)抵御這些傷害：一種是形成抵抗能力強(qiáng)生理活性弱的成熟種子等特殊形態(tài)以躲避不利環(huán)境；二是通過(guò)激活一些可逆的調(diào)節(jié)機(jī)制(如抗逆基因的表達(dá))增強(qiáng)植物本身的抵抗力[1-2]。耐低氮脅迫新品種的培育是減少農(nóng)作物生產(chǎn)投入成本的一個(gè)主要方面。研究植物在低氮脅迫條件下的分子響應(yīng)機(jī)制將大大加快抗逆育種的進(jìn)程。

通過(guò)轉(zhuǎn)錄組、蛋白組以及代謝組學(xué)等高通量生物信息學(xué)分析方法已經(jīng)成功鑒定出許多參與逆境反應(yīng)的功能基因，它們參與了碳、氮以及油脂代謝等多個(gè)過(guò)程，在模式植物以及農(nóng)作物中，已經(jīng)成功發(fā)現(xiàn)了逆境脅迫調(diào)節(jié)過(guò)程中許多關(guān)鍵酶的功能[3]。蛋白質(zhì)是植物功能的體現(xiàn)者與執(zhí)行者，其調(diào)節(jié)植物的抗逆性不僅體現(xiàn)在改變酶的催化活性，而且部分可以作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)其他基因的表達(dá)。作為大分子物質(zhì)，蛋白質(zhì)能夠調(diào)節(jié)胞內(nèi)物質(zhì)的組成與濃度，進(jìn)而影響植物的滲透壓等。因此，蛋白組的數(shù)據(jù)往往比轉(zhuǎn)錄組或者芯片分析的結(jié)果更可靠[4-5]。

前人對(duì)氮代謝的研究主要集中在對(duì)植物根系的影響。根系發(fā)育和根吸收氮元素的能力是影響植物對(duì)氮元素吸收能力的兩個(gè)主要因素。氮元素對(duì)植物發(fā)育也有重要影響：隨著氮素水平的增加，根系生物量和根系活力呈增加的趨勢(shì)，根系總量增加主要表現(xiàn)在側(cè)根數(shù)目明顯增多[6]；而在低氮條件下，植物也傾向于根系生長(zhǎng)，但是在增加相同生物量的情況下，根莖比重值增大，而且不利于側(cè)根生長(zhǎng)[7-8]，對(duì)大部分收獲籽實(shí)和營(yíng)養(yǎng)體的農(nóng)作物不利。植物氮元素的代謝主要存在兩種機(jī)制：一種叫HATS (high affinity transport system)，是在低氮條件下植物啟動(dòng)組成型和誘導(dǎo)型表達(dá)的功能基因促進(jìn)氮元素吸收；另一種是LATS (low affinity transport system)，是在高氮條件下減緩植物吸收氮元素的機(jī)制[9-10]，因此，這些不同機(jī)制導(dǎo)致了農(nóng)作物不同品種對(duì)氮的吸收和利用具有顯著的差異，相關(guān)的研究在玉米(Zeamays)、油菜(Brassicacampestris)和小麥(Triticumaestivum)等農(nóng)作物中都有報(bào)道[10-13]。

氮元素吸收的分子模式在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中已經(jīng)有很好的研究成果，氮不僅是一種重要的礦物質(zhì)元素，而且還作為一種重要的外部信號(hào)調(diào)節(jié)氮代謝基因的表達(dá)[14-17]。氮元素作為生物體主要元素之一，其代謝過(guò)程往往與其他信號(hào)途徑互作。磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)是有機(jī)酸代謝途徑的關(guān)鍵酶，有報(bào)道稱PEPC在12 mmol/L硝酸鹽處理2 h后表達(dá)顯著下調(diào)，另外淀粉合成的關(guān)鍵基因腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPS2)的表達(dá)同樣受硝酸鹽的抑制[18]。

在牧草類作物中，關(guān)于蛋白組學(xué)的研究在苜蓿(Medicagosativa)已經(jīng)有開(kāi)展，但是在禾本科牧草中的報(bào)道還很少。本研究通過(guò)蛋白組學(xué)的方法分析高羊茅(Festucaarundinacea)在低氮脅迫條件下表達(dá)譜的變化，共檢測(cè)到595個(gè)差異蛋白，這些蛋白參與氮代謝、細(xì)胞氧化還原和逆境相關(guān)等多個(gè)不同的代謝途徑。生理生化測(cè)定發(fā)現(xiàn)，葉綠素、可溶性蛋白以及游離氨基酸的含量顯著下降，而過(guò)氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)以及谷胱甘肽合成酶(GS)等酶活性在脅迫條件下顯著升高，并采用熒光定量PCR的方法對(duì)隨機(jī)挑選的候選基因進(jìn)行了表達(dá)水平的分析。本研究為在禾本科牧草中研究氮代謝以及通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗性種質(zhì)資源提供候選基因與技術(shù)儲(chǔ)備。

1材料與方法

1.1材料

本研究采用2005年貴州省草業(yè)研究所育成的國(guó)家牧草新品種黔草1號(hào)高羊茅(登記號(hào)：299)為試驗(yàn)材料。本實(shí)驗(yàn)Hoagland水培液所用的無(wú)機(jī)鹽均購(gòu)自上海國(guó)藥公司，RNA提取試劑盒購(gòu)自Axygen公司，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Thermo Scientific公司，熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自Promega公司。

1.2方法

1.2.1試驗(yàn)材料的準(zhǔn)備和非生物脅迫處理從新鮮收獲的黔草1號(hào)高羊茅中選取300粒飽滿的種子，用50℃溫水浸泡過(guò)夜，加50 mL 75%酒精攪動(dòng)、浸泡30 s進(jìn)行表面消毒，用100 mL無(wú)菌水沖洗3次。在培養(yǎng)皿底鋪墊2～3張滅菌濾紙，加入4～5 mL無(wú)菌蒸餾水，然后將消毒好的種子均勻點(diǎn)播于濾紙上，放入光照培養(yǎng)箱中發(fā)芽7 d，每天補(bǔ)加3～4 mL無(wú)菌水使濾紙保持濕潤(rùn)，萌發(fā)后將幼苗放置在裝有Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的水培裝置中培養(yǎng)30 d進(jìn)行低氮脅迫處理：將幼苗分別轉(zhuǎn)移到無(wú)氮水培液(低氮脅迫，營(yíng)養(yǎng)液中NO3-被Cl-取代)和正常水培液中(對(duì)照，標(biāo)準(zhǔn)Hoagland營(yíng)養(yǎng)液)進(jìn)行生長(zhǎng)處理，低氮脅迫15 d，每3 d更換1次營(yíng)養(yǎng)液，同時(shí)為了縮小溫室內(nèi)微環(huán)境的影響，栽植盆進(jìn)行定期旋轉(zhuǎn)。剪取脅迫與對(duì)照的高羊茅葉片，用液氮速凍，保存在-80℃的冰箱中待用。植株培養(yǎng)條件參考文獻(xiàn)[19]，具體為光照16 h，黑暗8 h，生長(zhǎng)溫度22℃。

1.2.2蛋白酶解與iTRAQ標(biāo)記蛋白酶解采用FASP程序，參照文獻(xiàn)[20]，打斷后的多肽采用4-plex/8-plex iTRAQ (applied biosystems)試劑進(jìn)行標(biāo)記，實(shí)驗(yàn)程序參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。操作過(guò)程如下：將200 μg蛋白樣品溶解到30 μL STD緩沖液中(4% SDS，100 mmol/L DTT，150 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)。采用UA緩沖液(8 mol/L Urea尿素，150 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)進(jìn)行超濾透析去除DTT和小分子量蛋白(30 kD)。然后加入100 μL 0.05 mol/L 碘乙酰胺到UA緩沖液中，黑暗條件孵育20 min用來(lái)封閉多肽殘基的C端。用100 μL UA緩沖液潤(rùn)洗3次，然后用100 μL DS緩沖液[50 mmol/L三乙基碳酸氫銨(triethylammonium bicarbonate)， pH 8.5]潤(rùn)洗2次。用40 μL DS緩沖液溶解，加入2 μg胰蛋白酶(promega，美國(guó))37℃暗光條件下酶解過(guò)夜后收集起來(lái)備用。采用紫外分光的方法在280 nm利用消光系數(shù)計(jì)算蛋白濃度。將iTRAQ試劑融入70 μL 乙醇，加入待標(biāo)記的樣品組織，標(biāo)記完成后冷凍真空抽干備用。

1.2.3蛋白分離與色譜分析將iTRAQ標(biāo)記好的蛋白利用通用電氣醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)部(GE Healthcare，美國(guó))的AKTA蛋白自動(dòng)純化系統(tǒng)進(jìn)行純化。將標(biāo)記好的多肽沖洗溶解于2 mL A緩沖液中(25% ACN中加入10 mmol/L KH2PO4，pH 2.7)，加入到 4.6×100 mm多聚磺乙基的分離柱中(5 μm，200 ?)(PolyLC，美國(guó))。洗脫采用0%～10% B緩沖液(25% ACN中加入500 mmol/L KCl和10 mmol/L KH2PO4，pH 2.7)以1 mL/min 的流速洗脫2 min，10%～20% B 緩沖液洗脫25 min，20%～45% B 緩沖液洗脫5 min，50%～100% B 緩沖液洗脫5 min。每min的樣品都單獨(dú)收集，通過(guò)在214 nm條件下監(jiān)測(cè)吸光值，將相似的樣品混合最終形成10個(gè)樣品池進(jìn)行脫鹽處理，每個(gè)樣品通過(guò)濃縮再溶解到40 μL 0.1%(v/v)三氟乙酸中保存在-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4液相質(zhì)譜分析將制備好的樣品上樣到nanoLC-MS/MS液相質(zhì)譜聯(lián)用分析儀中分析。具體過(guò)程如下：取10 μL(約5 μg)樣品溶液注射到 C18反相色譜柱(15 cm長(zhǎng)，內(nèi)徑75 μm),內(nèi)部填充5 μm RP-C18 樹(shù)脂混合液A(0.1%甲酸)，洗脫時(shí)采用線性濃度的B緩沖液 (80% 氰化甲烷和0.1% 甲酸溶液)，以流速250 mL/min分離超過(guò)140 min。質(zhì)譜數(shù)據(jù)是根據(jù)掃描300～1800 m/z 范圍豐度最高的高能誘導(dǎo)解離(HCD)片段。

1.2.5數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用MASCOT和Proteome Discoverer 1.3軟件進(jìn)行分析，差異蛋白的序列根據(jù)UniProtKB數(shù)據(jù)庫(kù)獲得，通過(guò)NCBI BLAST與SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)與功能注釋，閾值小于10-3的序列進(jìn)行Blast2GO與 GO分析，閾值設(shè)為10-6。BLAST無(wú)結(jié)果的未注釋基因通過(guò)InterProScan3搜索EBI 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取已知蛋白的模體,通過(guò)InterProScan GO進(jìn)行注釋。代謝途徑分析通過(guò)比對(duì)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2.6生理生化指標(biāo)的測(cè)定用0.8 cm打孔器取低氮脅迫處理組和對(duì)照組的高羊茅葉片各10片，稱重后，加入5 mL 80% 丙酮溶液進(jìn)行萃取，分別測(cè)定663,646以及470 nm下的吸光值，葉綠素a(Chl a)與葉綠素b(Chl b)的計(jì)算方法分別為：Chl a=12.21 OD663-2.81 OD646; Chl b=20.13 OD646-5.03 OD663，總?cè)~綠素(T Chl)為Chl a+Chl b。取100 mg處理組和對(duì)照組新鮮葉片，加液氮磨碎，加入1 mL提取緩沖液(甲醇∶水=1∶1)超聲處理30 min，13200 r/min，4℃離心10 min，上清液用來(lái)進(jìn)行可溶性蛋白和游離氨基酸含量的測(cè)定，測(cè)定分析是由北京艾米諾醫(yī)藥研究公司分析完成，詳細(xì)操作程序參考文獻(xiàn)[21]。氧化還原酶活性采用試劑盒測(cè)定，稱取100 mg新鮮處理組和對(duì)照組的葉片，加1 mL預(yù)冷的PBS提取緩沖液，4℃，用研缽磨碎，超氧化物歧化酶(SOD)和谷氨酰胺合成酶(GS)分別采用試劑盒S0102和S0055(碧云天，北京)測(cè)定，過(guò)氧化物酶(POD)活性采用試劑盒A084-3 (南京建成)測(cè)定，測(cè)定過(guò)程均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.7高羊茅總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄PCR熒光定量分析RNA提取與反轉(zhuǎn)錄PCR參考文獻(xiàn)[22]，RNA提取采用TaKaRa RNAiso Reagent試劑盒，具體操作過(guò)程參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。RNA的反轉(zhuǎn)錄應(yīng)用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit完成，用1 μL DNase處理RNA，每樣品取5 μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，具體程序參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)驗(yàn)證篩選的候選基因的表達(dá)變化。具體方法如下，將合成的cDNA稀釋20倍作為熒光定量PCR的模板。PCR的程序?yàn)椋?5℃ 5 min，95℃ 10 s，58℃ 10 s，72℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min，從65℃緩慢升溫到95℃，每0.5℃收集一次熒光信號(hào)用于制作溶解曲線，熒光定量引物利用在線軟件http://www.idtdna.com/Scitools/Applications/Primerquest設(shè)計(jì)，引物序列參照表1。試驗(yàn)方法和程序參照文獻(xiàn)[20]，采用2-ΔΔct算法，每個(gè)樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

表1　本實(shí)驗(yàn)中使用的引物

1.3數(shù)據(jù)分析

采用Excel與PowerPoint完成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作圖及統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2.1高羊茅蛋白組數(shù)據(jù)總體描述

我們采用了iTRAQ技術(shù)分析了高羊茅葉片在低氮脅迫條件下蛋白組的變化，在差異基因閾值設(shè)為>1.2倍或者<0.83倍，并且P<0.05情況下，我們共檢測(cè)到595個(gè)蛋白表達(dá)有顯著變化，其中有295個(gè)蛋白上調(diào)表達(dá)，300個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，對(duì)所有氮脅迫誘導(dǎo)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能聚類(Gene Ontology database，http://geneontology.org)。在細(xì)胞組分聚類分析中，蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)(77)、細(xì)胞器(61)、質(zhì)膜(25)(圖1A)；在生物過(guò)程聚類中參與最多的依次為代謝過(guò)程(58)、細(xì)胞過(guò)程(40)、單有機(jī)體過(guò)程(18)、逆境反應(yīng)(13)等過(guò)程(圖1B)；在分子功能聚類分析中發(fā)現(xiàn)具有結(jié)合功能(51)和催化功能(45)的基因占據(jù)大部分(圖1C)。

2.2差異基因代謝途徑分析

高羊茅在低氮脅迫條件下，有幾個(gè)代謝途徑的基因呈現(xiàn)明顯的變化。其中氮代謝途徑的基因，在高嚴(yán)謹(jǐn)篩選條件下(表達(dá)差異倍數(shù)>1.5，或者<0.67)，共有10個(gè)蛋白(CL10359.Contig4_All、CL5776.Contig1_All、Unigene12843_All、CL5527.Contig1_All、CL8689.Contig1_All、CL8708.Contig2_All、Unigene9083_All、Unigene23702_All、CL11136.Contig1_All和CL340.Contig11_All)被上調(diào)1.52～2.24倍，另外5個(gè)蛋白(Unigene6516_All、Unigene23474_All、Unigene21261_All、Unigene42040_All和CL7688.Contig1_All)被下調(diào)了0.48～0.63倍(表2)。這些基因參與氮元素的吸收、固定、同化、轉(zhuǎn)運(yùn)等多個(gè)過(guò)程。

在低氮脅迫條件下，植株不僅會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢、葉片變黃、分蘗數(shù)減少等顯著的表型變化，同時(shí)在生理生化上也有顯著差異。在研究中發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)格篩選條件下，共有5個(gè)蛋白(Unigene24111_All、Unigene39854_All、CL784.Contig2_All、CL6318.Contig1_All和Unigene16350_All)的表達(dá)上調(diào)，有一個(gè)蛋白CL224.Contig5_All下調(diào)表達(dá)，這6個(gè)基因都參與了細(xì)胞內(nèi)氧化還原調(diào)節(jié)(表3)。

表2　氮代謝途徑的基因表達(dá)變化

圖1　高羊茅底單處理?xiàng)l件下差異蛋白的生物信息預(yù)測(cè)

圖中數(shù)字表示每個(gè)類別中包含的蛋白數(shù)目。The figures stand for the number of proteins contained in each categories.

表3　氧化還原反應(yīng)途徑的基因表達(dá)變化

除了氮代謝以及氧化還原反應(yīng)途徑外，脅迫相關(guān)的基因也有明顯的變化，在高嚴(yán)謹(jǐn)篩選條件下，共有15個(gè)蛋白顯著被誘導(dǎo)，只有1個(gè)蛋白的表達(dá)被抑制(表4)。在這些上調(diào)表達(dá)的基因中，高羊茅14-3-3家族蛋白如CL210.Contig4_All、CL210.Contig7_All、CL210.Contig2_All、Unigene6925_All在低氮脅迫條件下，其表達(dá)呈現(xiàn)整體被誘導(dǎo)的趨勢(shì)。具有一致變化趨勢(shì)的除14-3-3蛋白外，還有3個(gè)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(CL468.Contig2_All、CL468.Contig1_All 和CL4631.Contig2_All)以及2個(gè)脅迫相關(guān)蛋白(CL11641.Contig1_All和CL3913.Contig3_All)。這些關(guān)鍵基因的上調(diào)表達(dá)說(shuō)明其在高羊茅氮代謝過(guò)程中起到重要的調(diào)節(jié)作用。

表4　脅迫相關(guān)途徑的基因表達(dá)變化

2.3高羊茅在脅迫條件下生理生化的改變

為了驗(yàn)證蛋白組學(xué)的結(jié)果，我們測(cè)定了低氮脅迫條件下，高羊茅葉片中葉綠素、可溶性蛋白、氨基酸等的含量，以及POD、SOD、GS等酶的活性。氮脅迫顯著降低了葉片中葉綠素的含量，在對(duì)照材料鮮葉中，葉綠素a、葉綠素b以及總?cè)~綠素含量依次為(1.45±0.12)，(0.67±0.11)和(2.12±0.22) mg/g(圖2A)。低氮脅迫條件下其含量分別降低到(0.80±0.16)，(0.48±0.08)和(1.28±0.22) mg/g，暗示低氮脅迫能夠顯著降低光合作用的效率(圖2A)。

與葉綠素含量變化類似，在低氮脅迫下，可溶性蛋白的含量也顯著降低了47%(圖2B)。在檢測(cè)的19種游離氨基酸中，只有色氨酸的含量增加4倍，而其余氨基酸含量下降了20%～80%(圖2C)。另外，低氮脅迫打破了細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，POD、T-SOD 和GS的活性被分別上調(diào)了1.43，2.07和1.78倍(圖2D)。這些生理生化水平的變化與蛋白組學(xué)中檢測(cè)到調(diào)節(jié)氮代謝以及氧化還原反應(yīng)蛋白水平的變化可能存在密切的聯(lián)系。

圖2　氮脅迫條件下高羊茅生理生化變化Fig.2　Physiological and biochemical changes in tall fescue under low nitrogen condition 　Chl a：葉綠素a Chlorophyll a；Chl b：葉綠素b Chlorophyll b；T Chl：總?cè)~綠素Total chlorophyll；POD：過(guò)氧化物酶Peroxidase；T-SOD：總超氧化物歧化酶Total superoxide dismutase；GS：谷胱甘肽合成酶Glutathione synthetase.

圖3　熒光定量PCR驗(yàn)證蛋白組數(shù)據(jù)

2.4熒光定量驗(yàn)證蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)及14-3-3基因表達(dá)分析

為了驗(yàn)證蛋白數(shù)據(jù)的可靠性，我們隨機(jī)挑選了12個(gè)基因，采用熒光定量PCR方法分析其在低氮脅迫條件下的表達(dá)變化。包括3個(gè)上調(diào)表達(dá)的基因(Unigene18806、CL163.Contig2和Unigene14042)和8個(gè)下調(diào)的基因(CL1564.Contig1、CL7119.Contig2、CL3787.Contig1、CL10900.Contig1、Unigene18786、CL4924.Contig1、CL7743.Contig1和Unigene11547)。所有挑選的基因的表達(dá)變化趨勢(shì)與蛋白組相同。然而，蛋白差異篩選標(biāo)準(zhǔn)為大于1.2或者小于0.8的前提下，有4個(gè)基因(Unigene18806、CL163.Contig2、Unigene14042和Unigene11547)的熒光定量變化倍數(shù)小于2。說(shuō)明這些基因在低氮脅迫條件下的表達(dá)只受到輕微的激活或抑制，或者最終的蛋白含量受到了轉(zhuǎn)錄后翻譯的影響。

上述挑選的上調(diào)表達(dá)基因定量PCR驗(yàn)證結(jié)果，雖然具有和蛋白組數(shù)據(jù)相同的變化趨勢(shì)，但是其誘導(dǎo)的幅度并不大(小于2)，為了檢驗(yàn)上調(diào)表達(dá)數(shù)據(jù)的可靠性，我們對(duì)14-3-3基因家族在低氮脅迫條件下的表達(dá)變化也進(jìn)行了驗(yàn)證。4個(gè)被檢測(cè)的14-3-3基因CL210.Contig4_All、CL210.Contig7_All、CL210.Contig2_All和Unigene6925_All分別命名為14-3-3A、14-3-3B、14-3-3C和14-3-3D，在低氮脅迫后4個(gè)基因都顯著被誘導(dǎo)2.7～11.3倍，說(shuō)明蛋白組的數(shù)據(jù)是可信的。

3討論與結(jié)論

氮元素是限制植物生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵因素之一，和20世紀(jì)70年代相比，植物的產(chǎn)量已經(jīng)增長(zhǎng)了一倍，其中氮肥是主要貢獻(xiàn)因素之一。然而氮肥的大量使用直接導(dǎo)致了植物氮利用效率的下降[23]。通過(guò)改良氮利用效率是減少氮肥使用的主要方法之一，植物對(duì)氮元素的吸收利用受到其自身的精細(xì)調(diào)控，通過(guò)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)、關(guān)鍵酶活性以及代謝物的含量，可以改變植物應(yīng)對(duì)不同氮營(yíng)養(yǎng)水平的能力[24-25]。牧草類作物相對(duì)于其他農(nóng)作物受貧瘠土壤脅迫的危害更加嚴(yán)重，然而相應(yīng)的理論研究還比較滯后。本文采用iTRAQ的方法鑒定高羊茅葉片在低氮脅迫條件下蛋白水平的變化，獲得了氮高效利用的候選基因，該研究在禾本科牧草類植物中處于領(lǐng)先地位，為在其他牧草類作物中開(kāi)展類似研究提供了很好的借鑒作用。

在高羊茅低氮處理的蛋白組數(shù)據(jù)中，氮代謝途徑蛋白發(fā)生了明顯變化(表1)，相應(yīng)的生理生化測(cè)定結(jié)果也表明低氮脅迫顯著降低了葉綠素含量、可溶性蛋白和游離氨基酸的水平(圖2A～C)，說(shuō)明在低氮脅迫條件下，光合作用速率、蛋白質(zhì)的翻譯與合成等都受到顯著的影響。類似的研究在水稻(Oryzasativa)中也有報(bào)道，在低氮脅迫條件下，水稻氣體交換、光合效率、光合色素的含量、可溶性蛋白等都不同程度受到抑制[26]。另外在小麥低氮誘導(dǎo)的蛋白譜中同樣也發(fā)現(xiàn)了光合作用、氮代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的變化[27]。

光合中心Ⅱ(PSⅡ)的活性在低氮條件下被減弱，進(jìn)而會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞體內(nèi)的活性氧化物質(zhì)的積累，出于對(duì)不利環(huán)境的應(yīng)激反應(yīng)，植物細(xì)胞會(huì)激活活性氧清除系統(tǒng)以保護(hù)自身不受傷害[28]。我們的研究發(fā)現(xiàn)低氮處理下，高羊茅體內(nèi)氧化還原代謝途徑的關(guān)鍵蛋白都明顯上調(diào)(表3)，通過(guò)測(cè)定相應(yīng)酶的活性發(fā)現(xiàn)POD、SOD與GS活性都顯著增強(qiáng)(圖2D)，說(shuō)明低氮脅迫間接地導(dǎo)致了植物細(xì)胞受到活性氧傷害在植物界中具有一定的普遍性。與其他植物一樣，在高羊茅中，低氮脅迫能夠激活活性氧清除系統(tǒng)。

低氮條件下，脅迫相關(guān)蛋白明顯誘導(dǎo)，他們分別具有不同的功能，定位于不同的亞細(xì)胞器，參與不同的代謝途徑。因此，低氮脅迫可能與其他脅迫存在廣泛的互作，而這些基因則可能具有調(diào)節(jié)植物多種抗性的功能。其中最顯著的是14-3-3蛋白，在前人研究中，14-3-3能夠調(diào)控植物對(duì)非生物脅迫(干旱、高溫、高鹽等)和生物脅迫(病蟲(chóng)害)的應(yīng)答[29]。在本研究中，我們一共發(fā)現(xiàn)了4個(gè)高羊茅14-3-3蛋白受低氮脅迫條件誘導(dǎo)(表4)，并且其表達(dá)水平也得到熒光定量PCR的驗(yàn)證(圖3C)，說(shuō)明14-3-3蛋白在高羊茅應(yīng)對(duì)低氮脅迫的反應(yīng)中可能起到至關(guān)重要的作用，為我們創(chuàng)制氮高效高羊茅新品種提供了重要的基因資源。

References：

[1]Levitt J. Responses of Plants to Environmental Stresses. Volume I: Chilling, Freezing, and High Temperature Stresses[M]. Orlando, Florida: Academic Press, 1980.

[2]Larcher W. Physiological Plant Ecology: Ecophysiology and Stress Physiology of Functional Groups[M]. New York: Springer Science & Business Media, 2003.

[3]Hirai M Y, Yano M, Goodenowe D B,etal. Integration of transcriptomics and metabolomics for understanding of global responses to nutritional stresses inArabidopsisthaliana. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2004, 101(27): 10205-10210.

[4]Gygi S P, Rochon Y, Franza B R,etal. Correlation between and mRNA in east. Molecular and Cellular Biology, 1999, 19(3): 1720-1730.

[5]Bogeat-Triboulot M-B, Brosché M, Renaut J,etal. Gradual soil water depletion results in reversible changes of gene expression, protein profiles, ecophysiology, and growth performance inPopuluseuphratica, a poplar growing in arid regions. Plant Physiology, 2007, 143(2): 876-892.

[6]Liu X J, Ye F, Zhang X L. Effects of exogenous nitrogen forms on root characteristics of alfalfa at different growth stages. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(6): 53-63.

[7]Goss M, Miller M, Bailey L,etal. Root growth and distribution in relation to nutrient availability and uptake. European Journal of Agronomy, 1993, 2(2): 57-67.

[8]Drew M, Saker L, Ashley T. Nutrient supply and the growth of the seminal root system in barley I. The effect of nitrate concentration on the growth of axes and laterals. Journal of Experimental Botany, 1973, 24(6): 1189-1202.

[9]Rao K P, Rains D W. Nitrate absorption by barley II. Influence of nitrate reductase activity. Plant Physiology, 1976, 57(1): 59-62.

[10]Siddiqi M Y, Glass A D, Ruth T J,etal. Studies of the regulation of nitrate influx by barley seedlings using13NO3-1. Plant Physiology, 1989, 90(3): 806-813.

[11]Daniel-Vedele F, Filleur S, Caboche M. Nitrate transport: a key step in nitrate assimilation. Current Opinion in Plant Biology, 1998, 1(3): 235-239.

[12]Orsel M, Filleur S, Fraisier V,etal. Nitrate transport in plants: which gene and which control. Journal of Experimental Botany, 2002, 53: 825-833.

[13]Oscarson P. The strategy of the wheat plant in acclimating growth and grain production to nitrogen availability. Journal of Experimental Botany, 2000, 51: 1921-1929.

[14]Walch-Liu P, Filleur S, Gan Y,etal. Signaling mechanisms integrating root and shoot responses to changes in the nitrogen supply. Photosynthesis Research, 2005, 83(2): 239-250.

[15]Stitt M, Krapp A. The interaction between elevated carbon dioxide and nitrogen nutrition: the physiological and molecular background. Plant, Cell & Environment, 1999, 22(6): 583-621.

[16]Lejay L, Tillard P, Lepetit M,etal. Molecular and functional regulation of two NO3- uptake systems by N- and C-status ofArabidopsisplants. The Plant Journal, 1999, 18(5): 509-519.

[17]Wang R, Tischner R, Gutiérrez R A,etal. Genomic analysis of the nitrate response using a nitrate reductase-null mutant ofArabidopsis. Plant Physiology, 2004, 136(1): 2512-2522.

[18]Scheible W R, Gonzalez-Fontes A, Lauerer M,etal. Nitrate acts as a signal to induce organic acid metabolism and repress starch metabolism in tobacco. The Plant Cell, 1997, 9(5): 783-798.

[19]Yu E, Fan C, Yang Q,etal. Identification of heat responsive genes inBrassicanapussiliques at the seed-filling stage through transcriptional profiling. PloS One, 2014, 9(7): e101914.

[20]Wi?niewski J R, Zougman A, Nagaraj N,etal. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods, 2009, 6(5): 359-362.

[21]Feng Z, Zhou X, Wu F,etal. Both dietary supplementation with monosodium L-glutamate and fat modify circulating and tissue amino acid pools in growing pigs, but with little interactive effect. PloS One, 2014, 9(1): e84533.

[22]Li X, Yu E, Fan C,etal. Developmental, cytological and transcriptional analysis of autotetraploidArabidopsis. Planta, 2012, 236(2): 579-596.

[23]Ju X T, Xing G X, Chen X P,etal. Reducing environmental risk by improving N management in intensive Chinese agricultural systems. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2009, 106(9): 3041-3046.

[24]Sakakibara H. Nitrate-specific and cytokinin-mediated nitrogen signaling pathways in plants. Journal of Plant Research, 2003, 116(3): 253-257.

[25]Sakakibara H, Takei K, Hirose N. Interactions between nitrogen and cytokinin in the regulation of metabolism and development. Trends in Plant Science, 2006, 11(9): 440-448.

[26]Huang Z A, Jiang D A, Yang Y,etal. Effects of nitrogen deficiency on gas exchange, chlorophyll fluorescence, and antioxidant enzymes in leaves of rice plants. Photosynthetica, 2004, 42(3): 357-364.

[27]Chandna R, Ahmad A. Nitrogen stress-induced alterations in the leaf proteome of two wheat varieties grown at different nitrogen levels. Physiology and Molecular Biology of Plants, 2015, 21(1): 19-33.

[28]Li B L, Mei H S. Relationship between oat leaf senescence and activated oxygen metabolism. Acta Phytophysiologica Sinica, 1989, 15(1): 6-12.

[29]Keller C K, Radwan O. The functional role of 14-3-3 proteins in plant-stress interactions. i-ACES, 2015, 1(2): 100-110.

參考文獻(xiàn):

[6]劉曉靜, 葉芳, 張曉玲. 外源氮素形態(tài)對(duì)紫花苜蓿不同生育期根系特性的影響. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2015, 24(6): 53-63.

[28]李柏林, 梅慧生. 燕麥葉片衰老與活性氧代謝的關(guān)系. 植物生理學(xué)報(bào), 1989, 15(1): 6-12.

Proteomic analysis of nitrogen stress-responsive proteins in the leaves of tall fescue

LI Xiao-Dong1, SHU Jian-Hong1, YU Er-Ru2, WU Jia-Hai1, CAI Yi-Ming1, WANG Xiao-Li1*

1.GuizhouInstituteofPrataculture,Guiyang550006,China; 2.GuizhouInstituteofOilCrops,Guiyang550006,China

Abstract:In order to thoroughly investigate the protein level changes of tall fescue in low-nitrogen conditions, we analyzed the proteome of the leaves from 30 day old plants exposed to low-nitrogen stress using the iTRAP technique. In total, 595 proteins were differentially accumulated (295 up-regulated and 300 down-regulated), which participated in diverse metabolic pathways. According to a strict selection standard, we discovered that the genes related to redox reactions and stresses significantly increased. Physiological and biochemical analysis revealed that the contents of chlorophyll, soluble proteins and free amino acid dramatically decreased, while reactive oxygen-scavenging enzymes such as POD, SOD and GS were highly active. The expression pattern of affected genes, detected by real-time fluorescence quantitative RT-PCR, coincided with the proteomic data. Notably, most of the 14-3-3 family of proteins were enriched by nitrogen shortage, suggesting that these involve the key genes that take part in diverse stresses in tall fescue. In this study, we provide proteomic information for tall fescue subjected to low-nitrogen availability. We also highlight some of the key genes involved and discuss their potential uses.

Key words:tall fescue; nitrogen stress; proteomic; gene expression

*通信作者

Corresponding author. E-mail: wangxiaolizhenyuan@126.com

作者簡(jiǎn)介：李小冬(1984-)，男，湖南邵陽(yáng)人，副研究員，博士。 E-mail: lixiaodongzl@163.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然基金項(xiàng)目“高羊茅光周期調(diào)控基因FaCONSTANS特異性表達(dá)與生物學(xué)功能分析”(31360576)資助。

收稿日期：2015-09-29；改回日期：2015-11-16

DOI：10.11686/cyxb2015470

http://cyxb.lzu.edu.cn

李小冬,舒健虹,于二汝,吳佳海,蔡一鳴,王小利. 高羊茅在低氮脅迫下的蛋白組學(xué)分析. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 25(3): 67-76.

LI Xiao-Dong, SHU Jian-Hong, YU Er-Ru, WU Jia-Hai, CAI Yi-Ming, WANG Xiao-Li. Proteomic analysis of nitrogen stress-responsive proteins in the leaves of tall fescue. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(3): 67-76.