馬尾松水通道蛋白PmPIP1基因克隆及在干旱脅迫下的表達(dá)分析

蔡　瓊，丁貴杰，文曉鵬（1.貴州省森林資源與環(huán)境研究中心，貴州貴陽(yáng)550025; 2.貴州大學(xué)林學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025; .貴州大學(xué)貴州省農(nóng)業(yè)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州貴陽(yáng)550025）

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馬尾松水通道蛋白PmPIP1基因克隆及在干旱脅迫下的表達(dá)分析

蔡瓊1,2，丁貴杰1,2，文曉鵬3
（1.貴州省森林資源與環(huán)境研究中心，貴州貴陽(yáng)550025; 2.貴州大學(xué)林學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025; 3.貴州大學(xué)貴州省農(nóng)業(yè)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州貴陽(yáng)550025）

摘要：克隆馬尾松Pinus massoniana水通道蛋白（AQP），并對(duì)其生物信息學(xué)與干旱脅迫表達(dá)模式進(jìn)行分析。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）以及互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA）末端快速擴(kuò)增（RACE）方法克隆馬尾松水通道蛋白基因。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）分析其在干旱脅迫下的響應(yīng)模式。結(jié)果克隆到一個(gè)馬尾松水通道蛋白基因，命名為PmPIP1（GenBank登錄號(hào)為KF582038）。此基因cDNA全長(zhǎng)序列為1 301 bp，包括867 bp的完整開(kāi)放閱讀框，99 bp的5′末端非翻譯區(qū)和335 bp的3′末端非翻譯區(qū)。編碼288個(gè)氨基酸殘基，分子量為30.86 kD，等電點(diǎn)（pI）8.48。PmPIP1與菠菜Spinacia oleracea（2b5fA）水通道蛋白結(jié)構(gòu)相似。PmPIP1含有6個(gè)跨膜區(qū)，具有膜內(nèi)在蛋白（MIP）家族信號(hào)序列、高等植物高度保守序列HINPAVTFG和2個(gè)天門冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸（NPA）保守肽段。PmPIP1基因?qū)儋|(zhì)膜內(nèi)在蛋白（PIPs）亞族，與挪威云杉Picea abies水通道蛋白基因親緣關(guān)系最近，同源性達(dá)95%。qRT-PCR表明PmPIP1受干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。馬尾松PmPIP1的克隆豐富了植物AQP基因的資料庫(kù)，同時(shí)推測(cè)PmPIP1基因可能參與了馬尾松干旱脅迫過(guò)程。圖8表1參39

關(guān)鍵詞：植物學(xué)；馬尾松；水通道蛋白；克??；表達(dá)

水通道蛋白（AQP）是指細(xì)胞膜上能選擇性地高效轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白［1］。自1993年Maurel等［2］從擬南芥Arabidopsis thaliana中分離到第1個(gè)植物水孔蛋白γ-TIP以來(lái)，已在細(xì)菌、古生菌、真菌、動(dòng)物和植物等幾乎所有生物中發(fā)現(xiàn)AQP［3-5］。在植物中，擬南芥［6］和水稻Oryza sativa［7-8］等AQP基因的研究較為清楚。根據(jù)水通道蛋白的亞細(xì)胞定位，結(jié)合序列同源性分為4種類型：質(zhì)膜內(nèi)在蛋白（PIP），液泡膜內(nèi)在蛋白（TIP），類結(jié)瘤蛋白（NIP）及小堿性膜內(nèi)蛋白（SIP）［9-10］。AQP屬跨膜通道的膜內(nèi)在蛋白（MIP）家族，具有轉(zhuǎn)運(yùn)水、甘油、小分子溶質(zhì)的功能，在植物應(yīng)對(duì)水分不足的響應(yīng)機(jī)制中起著重要作用［11］。馬尾松Pinus massoniana因適生能力強(qiáng)、速生、豐產(chǎn)、綜合利用程度高等優(yōu)良特性，成為中國(guó)南方最主要用材樹(shù)種之一［12］。以往關(guān)于馬尾松林的研究主要集中在林木栽培技術(shù)［13］、栽培機(jī)制［14-15］、連栽生態(tài)系統(tǒng)變化［16］、合理采伐年齡［17］、人工林生長(zhǎng)規(guī)律［18］等方面，而對(duì)其分子生物學(xué)相關(guān)研究甚少［19］。干旱是影響林木正常生長(zhǎng)發(fā)育的一個(gè)最重要的逆境因子?？寺●R尾松抗旱相關(guān)基因以及研究其表達(dá)調(diào)控，對(duì)揭示馬尾松抗旱分子機(jī)制具有十分重要的意義。其中，水通道蛋白PIPs亞型基因在植物干旱分子調(diào)控機(jī)制中是一個(gè)重要的調(diào)控基因，其不僅受脅迫表達(dá)變化，而且轉(zhuǎn)運(yùn)活性受磷酸化調(diào)控［20］，參與非生物脅迫的響應(yīng)。CUI等［21］發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)VfPIP1的擬南芥增強(qiáng)了植株的抗旱能力。ZHOU等［22］研究表明小麥Triticum aestivum TaAQP7（PIP2）在聚乙二醇（PEG）處理后表達(dá)量上調(diào)，在番茄Solanum lycopersicum中過(guò)量表達(dá)同樣增強(qiáng)了其抗旱性。目前，馬尾松水通道蛋白PIPs基因克隆和功能分析至今未見(jiàn)研究報(bào)道。因此，對(duì)馬尾松水通道蛋白PIPs基因進(jìn)行克隆并分析其在干旱脅迫下的響應(yīng)模式，為馬尾松抗旱基因工程和遺傳改良提供可資利用的基因資源。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

選用高抗旱馬尾松優(yōu)良家系1年生幼苗為供試材料。植株平均高度為17.2 cm。培養(yǎng)容器為塑料盆（27 cm×18 cm×25 cm），按V（黃壤）∶V（河砂）=9∶2混合構(gòu)成。設(shè)對(duì)照（土壤相對(duì)含水量為70%±5%）和中度脅迫（土壤相對(duì)含水量為40%±5%）2個(gè)處理。每天通過(guò)稱量法維持土壤相對(duì)含水量在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)。干旱脅迫實(shí)施0，3，5，10，15，20，25 d分根、莖、葉取試材，迅速?gòu)氐兹コ?xì)土和其他雜物，液氮冷凍，保存于-80℃，作為實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）的試驗(yàn)材料。

1.2方法

1.2.1總核糖核酸（RNA）的提取參照Plant RNA Reagent與RNAprep pure Plant Kit說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.2目的基因克隆根據(jù)美國(guó)生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)中已報(bào)道的AQP基因序列，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物M1與M2（表1），獲得PmPIP1基因中間片段。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）反應(yīng)體系（25.0 μL）：模板1.0 μL，引物各1.0 μL，MasterMix 12.5 μL，重蒸水9.5 μL。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃3 min，變性94℃30 s，退火48.7℃30 s，延伸72℃1 min，35個(gè)循環(huán)，后延伸72℃10 min。在此片段基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)5′-RACE特異性引物GSP1，GSP2和GSP3（表1），參照5′-RACE system for rapid amplification of cDNA ends說(shuō)明，擴(kuò)增目的基因5′端序列。設(shè)計(jì)3′-RACE特異性引物M3與M4（表1），參照3′-FullRACE core set with prime ScriptTMRTase說(shuō)明，擴(kuò)增目的基因3′端序列。設(shè)計(jì)特異性引物M5與M6（表1），驗(yàn)證PmPIP1基因互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA）全長(zhǎng)序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下切下相應(yīng)條帶，按照DNA Purification Kit試劑盒說(shuō)明進(jìn)行膠回收，與pMD18-T Vector連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌Escherichia coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆子，送至北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1　PmPIP1基因克隆及表達(dá)使用的引物Table 1 PCR primers used to the cloning and expression of PmPIP1

1.2.3序列分析測(cè)序結(jié)果采用DNAStar進(jìn)行拼接，并與美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行局部序列比對(duì)基本檢索工具（BLAST）比對(duì)，利用ProtScale Sever軟件分析蛋白親水/疏水性；利用Ex-PASy ProtParam tool計(jì)算蛋白的等電點(diǎn)和分子量；利用TMHMM預(yù)測(cè)跨膜區(qū)；利用Signal P預(yù)測(cè)信號(hào)肽；利用SWISS-MODEL預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)；利用DNAMAN軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)序列的多重比對(duì)并構(gòu)建基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4基因表達(dá)分析設(shè)計(jì)特異引物M7和M8（表1）作為RT-qPCR引物，馬尾松18S和泛素（UBC）（表1）基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)基因，進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，重復(fù)3次·反應(yīng)-1。PCR反應(yīng)體系為2×熒光定量預(yù)混試劑增強(qiáng)版（super real premix plus）10.0 μL，正、反向引物各為0.6 μL，cDNA模板0.5 μL，重蒸水8.3 μL，終體積20.0 μL。擴(kuò)增程序95℃1 min，95℃10 s，60℃32 s，共35個(gè)循環(huán)?；蛳鄬?duì)表達(dá)量的計(jì)算采用2-ΔΔCT法［23］。采用SPSS16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用方差分析（ANOVA）模塊分析差異顯著性。

2　結(jié)果與分析

2.1馬尾松PmPIP1基因cDNA全長(zhǎng)的克隆

以cDNA為模板，用簡(jiǎn)并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得1個(gè)458 bp的中間片段（圖1A）。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行5′端與3′端PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示：5′-RACE在520 bp左右獲得1條亮帶（圖1B）, 3′-RACE在460 bp左右獲得1條亮帶（圖1C）。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收、連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序及拼接，獲得PmPIP1基因序列。為驗(yàn)證PmPIP1序列準(zhǔn)確性，進(jìn)行基因全長(zhǎng)PCR擴(kuò)增，在867 bp左右獲得1條亮帶,大小與拼接得到的PmPIP1基因的完整開(kāi)放閱讀框大小一致（圖1D）。陽(yáng)性克隆經(jīng)測(cè)序證實(shí)擴(kuò)增序列與拼接結(jié)果一致。此基因已登錄GenBank，登錄號(hào)為KF582038。對(duì)PmPIP1基因全長(zhǎng)序列分析表明：全長(zhǎng)cDNA為1 301 bp，含1個(gè)完整開(kāi)放閱讀框867 bp，5′末端非翻譯區(qū)99 bp，3′末端非翻譯區(qū)335 bp，在100 bp處發(fā)現(xiàn)起始密碼子ATG，964 bp處發(fā)現(xiàn)終止密碼子TAG，編碼288個(gè)氨基酸（圖2）。利用NCBI的BLAST對(duì)PmPIP1進(jìn)行蛋白保守區(qū)預(yù)測(cè)（圖3），結(jié)果顯示：PmPIP1有1個(gè)MIP保守區(qū)。PmPIP1的氨基酸殘基在MIP匹配區(qū)內(nèi)與MIP蛋白保守區(qū)序列完全一致，可以推測(cè)PmPIP1基因是水通道蛋白基因家族一員。

圖1　瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Figure 1 Agarose gel electrophoresis results

圖2　PmPIP1基因核苷酸序列及推測(cè)的氨基酸序列Figure 2 Nucleotide sequence and amino acid sequence of the PmPIP1 gene

圖3　PmPIP1核酸序列的保守結(jié)構(gòu)域Figure 3 Conserved domains of nucleic acid sequences of PmPIP1

2.2生物信息學(xué)分析

ProtParam分析表明PmPIP1蛋白分子量為30.86 kD，理論等電點(diǎn)為8.48。此蛋白中相對(duì)含量比較多的氨基酸是甘氨酸Gly（G）和丙氨酸Ala（A），分別為36和34個(gè)；蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)為30.91，屬于穩(wěn)定蛋白。經(jīng)Signal P分析，沒(méi)有信號(hào)肽切割位點(diǎn)，說(shuō)明此蛋白為非分泌蛋白。ProtScale表明此轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白符合膜蛋白的特征，具有較強(qiáng)的疏水性。Predictprotein顯示PmPIP1蛋白含有1個(gè)依賴于cAMP and cGMP蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)、2個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、3個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)和10個(gè)肉豆蔻?；稽c(diǎn)。蛋白激酶C在許多信號(hào)通路中的功能與膜結(jié)合密切相關(guān)，N-豆蔻?；话惚徽J(rèn)為是一個(gè)組成性的過(guò)程和一個(gè)永久性的修飾，起開(kāi)關(guān)作用［24］。這些位點(diǎn)可能與PmPIP1調(diào)控關(guān)系密切。

運(yùn)用TMHMM Server軟件對(duì)PmPIP1進(jìn)行跨膜區(qū)分析，膜螺旋中氨基酸期望值高達(dá)127.431 43，且具有水通道蛋白典型的6個(gè)跨膜區(qū)（TM1～TM6），由膜兩側(cè)的5個(gè)親水環(huán)（Loop A，B，C，D，E）連接，A，C和E環(huán)在細(xì)胞膜外，B，D環(huán)及N，C末端都位于細(xì)胞膜內(nèi)（圖4）。TM2和TM3之間，TM5與TM6之間，各包含有1個(gè)天門冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸Asn-Pro-Ala（NPA）保守結(jié)構(gòu)域，NPA高度保守，幾乎所有的MIP均具有此結(jié)構(gòu)域。PmPIP1具有質(zhì)膜水通道蛋白C環(huán)和E環(huán)的特征序列（GGGANXXXXGY 和TGI/TNPARSL/FGAAI/VI/VF/YN）以及水通道形成有關(guān)的高度保守的EXXXTXXF/L單元，這與已經(jīng)證明具有水通道蛋白功能的AtPIP1功能區(qū)的氨基酸序列高度一致。N末端53個(gè)氨基酸, C末端9個(gè)氨基酸，符合植物水通道蛋白PIPl亞家族成員的N-端長(zhǎng)、C-端短的特點(diǎn)，因此，推測(cè)PmPIP1基因?qū)儆赑IP1亞家族成員。

圖4　PmPIP1蛋白跨膜區(qū)的預(yù)測(cè)Figure 4 Prediction model for transmenbrane domain of PmPIP1 protein

將PmPIP1與己知的其他植物水通道蛋白進(jìn)行氨基酸序列多重比對(duì)分析，結(jié)果表明：PmPIP1與挪威云杉Picea abies具有極高的同源性，可達(dá)95%，與擬南芥，葡萄Vitis vinifera，陸地棉Gossypium hirsutum，無(wú)梗花櫟Quercus petraea，野茶樹(shù)Camellia sinensis，小果野芭蕉Musa acuminata，煙草Nicotiana tabacum，白花檉柳Tamarix albiflonum等植物的同源性達(dá)83%～87%（圖5）。由此可以看出：水通道蛋白基因家族編碼蛋白氨基酸序列的保守性非常強(qiáng)，不同植物的水通道蛋白序列具有高度的同源性。

圖5　PmPIP1氨基酸序列與其他植物AQP基因的氨基酸序列多重比對(duì)Figure 5 Multi-comparison in amino acid sequence of AQP gene between Pinus massoniana and other plant species

將PmPIP1氨基酸序列與其他植物AQP基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析（圖6）。結(jié)果表明：PmPIP1與挪威云杉親緣關(guān)系最近，而且明顯可以看出PmPIP1與PIPs蛋白聚為一類，與NIPs，TIPs，SIPs蛋白等進(jìn)化距離較遠(yuǎn)（圖6）。因而推測(cè)PmPIP1在PIPs蛋白進(jìn)化上是保守的。

圖6　PmPIP1蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析Figure 6 Phylogenetic analysis of PmPIP1 and other plant species

經(jīng)SWISS-MODEL模型，采用自動(dòng)搜索模式對(duì)PmPIP1氨基酸三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示：模型殘基從44～278 bp，三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的模板是菠菜Spinacia oleracea（2b5fA），序列同源性77.872%。經(jīng)Rasmol查看，發(fā)現(xiàn)兩者的結(jié)構(gòu)十分相似（圖7）。

圖7　PmPIP1蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與菠菜AQP （2b5fA）蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Figure 7　The 3-dimensional prediction of the PmPIP1 and the spinach aquaporin（2b5fA）

2.3PmPIP1基因在馬尾松各組織中的表達(dá)及干旱脅迫下的表達(dá)分析

分別以馬尾松根、莖和葉cDNA為模板，進(jìn)行PmPIP1基因的RT-PCR反應(yīng)，18S作為內(nèi)參基因，結(jié)果如圖8A所示。PmPIP1在根、莖、葉中均有表達(dá)，根中表達(dá)量最高，其次是莖和葉。為明確干旱脅迫對(duì)PmPIP1基因表達(dá)的影響，使用qRT-PCR技術(shù)研究馬尾松根、莖和葉表達(dá)模式。在干旱脅迫下，以18S為內(nèi)參分析（圖8B），PmPIP1基因在根、莖中表達(dá)水平基本逐步升高，且在第10天表達(dá)程度最為強(qiáng)烈，而后開(kāi)始降低；葉中表達(dá)量差異不大。以UBC為內(nèi)參分析（圖8C），在根、莖、葉中表達(dá)水平趨勢(shì)基本與以18S為內(nèi)參的結(jié)果基本一致。上述結(jié)果暗示，PmPIP1基因的表達(dá)與干旱脅迫相關(guān)。

圖8　PmPIP1基因的相對(duì)表達(dá)量分析Figure 8 Analysis of relative expression level of PmPIP1

3　討論

馬尾松是荒山造林的先鋒樹(shù)種，同時(shí)也是一種非常重要的耐旱樹(shù)種，可能蘊(yùn)含著豐富的抗逆基因資源。為了在分子水平上深入研究馬尾松抗旱分子機(jī)制，本研究對(duì)馬尾松重要的耐旱相關(guān)基因-水通道蛋白基因開(kāi)展了研究。

通過(guò)RT-PCR及表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）序列拼接，獲得PmPIP1基因，該基因具有MIP家族典型的保守氨基酸序列HINPAVTFG，2個(gè)NPA保守肽段，6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，較長(zhǎng)的N端和較短的C端，說(shuō)明該蛋白屬于水通道蛋白基因家族一員。聚類分析表明：PmPIP1與挪威云杉同源關(guān)系達(dá)95%，與其他8種植物AQP基因同源性達(dá)83%～87%。將PmPIP1與其他植物AQP基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，進(jìn)一步推測(cè)PmPIP1屬于質(zhì)膜水通道蛋白PIPs亞家族，與挪威云杉親緣遺傳距離最近。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明：PmPIP1與已登陸的菠菜（2b5fA）AQP三級(jí)結(jié)構(gòu)極為相似。大量研究已表明，AQP是調(diào)節(jié)水分在細(xì)胞間以及植物整個(gè)體內(nèi)水分平衡分子基礎(chǔ)［25］，其中大約70%～90%的水分受到水通道蛋白基因的表達(dá)調(diào)控［26］。PmPIP1基因與AQP基因的相同保守性以及基本結(jié)構(gòu)的相吻合意味著PmPIP1在功能上可能具有與其他物種非常相近的作用模式［27-28］。

植物AQP的轉(zhuǎn)運(yùn)活性受磷酸化調(diào)控，是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與水分運(yùn)輸調(diào)節(jié)的媒介，磷酸化時(shí)水通道蛋白水運(yùn)轉(zhuǎn)活性增加，直接就近參與原位的快速、直接、可逆的門控［20,25］,促進(jìn)上調(diào)水通道的活性［29］。PmPIP1蛋白包括5個(gè)色氨酸（Ser），2個(gè)蘇氨酸（Thr）和2個(gè)酪氨酸（Tyr）。這些位點(diǎn)可能成為蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)，直接或間接參與PmPIP1對(duì)水分或其他物質(zhì)運(yùn)輸?shù)恼{(diào)節(jié)。

在研究植物抗旱分子機(jī)制的過(guò)程中，從干旱誘導(dǎo)的基因中已分離出很多水通道蛋白基因［30-31］。AQP蛋白受環(huán)境條件和植物激素的調(diào)節(jié)，有些組成型表達(dá)，有些特異性表達(dá)，參與根葉生長(zhǎng)、有性繁殖及非生物脅迫等過(guò)程［32-34］，表達(dá)方式也存在顯著差異［35］。Marc等［36］研究表明, PIP1和PIP2基因在生殖器官中的表達(dá)水平不同，PIP1 RNA在柱頭累積, PIP1和PIP2 RNA在花粉囊的幾乎所有組織中多有表達(dá)。JcPIP在植株的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育期都有表達(dá)，在干旱脅迫下表達(dá)量增加［32］。PIP2在木欖樹(shù)Bruguiera gymnorhiza根中表達(dá)量明顯強(qiáng)于嫩莖和葉［37］。本研究發(fā)現(xiàn)PmPIP1基因在馬尾松的根、莖、葉中均有表達(dá),根中表達(dá)量最高，莖次之，葉最低。水通道蛋白在不同組織中的含量不同，并隨細(xì)胞生理狀態(tài)和環(huán)境與刺激產(chǎn)生波動(dòng)［38］。PmPIP1基因在干旱脅迫不同時(shí)期的表達(dá)特性分析顯示，PmPIP1在根、莖中表達(dá)水平首先呈上升趨勢(shì)，表明干旱初期隨著時(shí)間延長(zhǎng)，PmPIP1受到水分虧缺的誘導(dǎo)，表達(dá)量增加，到第10天表達(dá)量達(dá)到最高值，隨后由于PmPIP1無(wú)法再適應(yīng)干旱的加劇，于是呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；葉中表達(dá)量差異不大。推測(cè)PmPIP1基因的這種表達(dá)模式可能與植物在干旱脅迫下首先由根系從土壤中吸收水分，再經(jīng)木質(zhì)部導(dǎo)管向上運(yùn)輸最后由葉片蒸騰散失的生理現(xiàn)象相關(guān)。

XU等［39］分離到MaPIP1;1基因，并且在擬南芥中過(guò)表達(dá)MaPIP1;1增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽和滲透脅迫能力。因此將PmPIP1轉(zhuǎn)入模式植物（擬南芥、煙草等）并驗(yàn)證是否能提高轉(zhuǎn)基因植株抗旱能力需要進(jìn)一步驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)室目前正在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究，以期為該基因在植物中的進(jìn)一步利用奠定基礎(chǔ)。

4　參考文獻(xiàn)

［1］MAUREL C, VERDOUCQ L, LUU D T, et al.Plant aquaporins: membrane channels with multiple integrated functions ［J］.Annu Rev Plant Biol, 2008, 59: 595 - 624.

［2］MAUREL C, REIZER J, SCHROEDER J I, et al.The vacuolar membrane protein gamma-TIP creates water specific channels in Xenopus oocytes［J］.EMBO J, 1993, 12（6）: 2241 - 2247.

［3］LUDEWIG U, DYNOWSKI M.Plant aquaporin selectivity: where transport assays, computer simulations and physiology meet［J］.Cell Mol Life Sci, 2009, 66（19）: 3161 - 3175.

［4］PIEN＇KOWSKA, J R, KOSICKA E, WOJTKOWSKA M, et al.Molecular identification of first putative aquaporins in snails［J］.J Membrane Biol, 2014, 247（3）: 239 - 252.

［5］鄒智，王丹華，莫業(yè)勇，等.橡膠死皮相關(guān)液泡型水通道蛋白基因TIP1的克隆與序列分析［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013, 41（36）：13851 - 13854.ZOU Zhi, WANG Danhua, MO Yeyong, et al.Molecular cloning and sequence analysis of a tonoplast aquaporin gene TIP1 associated with tapping panel dryness in Hevea brasiliensis［J］.J Anhui Agric Sci, 2013, 41（36）: 13851 -13854.

［6］ALEXANDERSSON E, FRAYSSE L, SJ?VALL-LARSEN S, et al.Whole gene family expression and drought stress regulation of aquaporins［J］.Plant Mol Biol, 2005, 59（3）: 469 - 484.

［7］LIAN Hongli, YU Xin, YE Qin, et al.The role of aquaporin RWC3 in drought avoidance in rice［J］.Plant Cell Physiol, 2004, 45（4）: 481 - 489.

［8］LI Guowei, PENG Yanhui, YU Xin, et al.Transport functions and expression analysis of vacuolar membrane aquaporins in response to various stresses in rice［J］.J Plant Physiol, 2008, 165（18）: 1879 - 1888.

［9］JOHANSON U, KARLSSON M, JOHANSSON I, et al.The complete set of genes encoding major intrinsic proteins in Arabidopsis provides a framework for a new nomenclature for major intrinsic protein in plants［J］.Plant Physiol, 2001, 126（4）: 1358 - 1369.

［10］CHAUMONT F, BARRIEU F, WOJCIK E, et al.Aquaporins constitute a large and highly divergent protein family in maize［J］.Plant Physiol, 2001, 125（3）: 1206 - 1215.

［11］SUGA S, IMAGAWA S, MAESHIMA M.Specificity of the accumulation of mRNAs and proteins of the plasma membrane and tonoplast aquaporins in radish organs［J］.Planta, 2001, 212（2）: 294 - 304.

［12］丁貴杰，周志春，王章榮，等.馬尾松紙漿用材林培育與利用［M］.北京：中國(guó)林業(yè)出版社，2006：111.

［13］諶紅輝，丁貴杰.馬尾松造林密度效應(yīng)研究［J］.林業(yè)科學(xué)，2004，40（1）：92 - 98.CHEN Honghui, DING Guijie.Study on planting density effects for Masson pine plantation［J］.Sci Silv Sin, 2004, 40（1）: 92 - 98.

［14］施積炎，丁貴杰，袁小鳳.不同家系馬尾松苗木水分參數(shù)的研究［J］.林業(yè)科學(xué)，2004，40（3）：51 - 55.SHI Jiyan, DING Guijie, YUAN Xiaofeng.Studies on water parameters in Pinus massoniana seedlings of different families［J］.Sci Silv Sin, 2004, 40（3）: 51 - 55.

［15］徐向華，丁貴杰.馬尾松適應(yīng)低磷脅迫的生理生化響應(yīng)［J］.林業(yè)科學(xué)，2006，42（9）：24 - 28.XU Xianghua, DING Guijie.Physiological and biochemical responses of Pinus massoniana to low phosphorus stress ［J］.Sci Silv Sin, 2006, 42（9）: 24 - 28.

［16］何佩云，丁貴杰，諶紅輝.連栽馬尾松人工林土壤肥力比較研究［J］.林業(yè)科學(xué)研究，2011，24（3）：357 - 362.HE Peiyun, DING Guijie, CHEN Honghui.Comparison on soil fertilities of Masson pine plantations of different generations［J］.For Res, 2011, 24（3）: 357 - 362.

［17］丁貴杰.馬尾松人工紙漿材林采伐年齡初步研究［J］.林業(yè)科學(xué), 2000, 36（1）: 15 - 20.DING Guijie.The preliminary study on optimum cutting age of pulpwood stand for Masson pine plantation［J］.Sci Silv Sin, 2000, 36（1）: 15 - 20.

［18］諶紅輝，丁貴杰，溫恒輝，等.造林密度對(duì)馬尾松林分生長(zhǎng)與效益的影響研究［J］.林業(yè)科學(xué)研究，2011，24 （4）：470 - 475.CHEN Honghui, DING Guijie, WEN Henghui, et al.Effects of planting density on growth and economic benefit of Masson pine plantation［J］.For Res, 2011, 24（4）: 470 - 475.

［19］王冰梅，郭晉隆，葉冰瑩，等.馬尾松銀松素合酶基因啟動(dòng)子區(qū)的克隆及特征分析［J］.亞熱帶農(nóng)業(yè)研究，2008，4（4）：292 - 296.WANG Bingmei, GUO Jinlong, YE Bingying, et al.Molecular cloning and analysis of pinosylvin synthase gene promoter from Pinus massoniana［J］.Subtrop Agric Res, 2008, 4（4）: 292 - 296.

［20］李擎天，趙宇，周綺云，等.珠眉海棠水通道蛋白MzPIP1;1基因的克隆與表達(dá)分析［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，17（3）：63 - 68.LI Qingtian, ZHAO Yu, ZHOU Qiyun, et al.Cloning and expression analysis of MzPIP1;1 gene from Malus zumi Mats ［J］.J China Agric Univ, 2012, 17（3）: 63 - 68.

［21］CUI Xianghuan, HAO Fushun, CHEN Hui, et al.Expression of the Vicia faba VfPIP1 gene in Arabidopsis thaliana plants improves their drought resistance［J］.J Plant Res, 2008, 121（2）: 207 - 214.

［22］ZHOU Shiyi, HU Wei, DENG Xiaomin, et al.Overexpression of the wheat aquaporin gene, TaAQP7, enhances drought tolerance in transgenic tobacco［J］.PLoS One, 2012, 7（12）: e52439.doi: 10.1371/journal.pone.0052439.

［23］PFAFFL M W.A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR［J］.Nucleic Acids Res, 2001, 29（9）: 2002 - 2007.

［24］王垠，劉關(guān)君，閻秀峰，等.西伯利亞蓼PsPIP1基因的克隆及其在NaHCO3脅迫下的表達(dá)［J］.遺傳，2008，30（12）：1621 - 1628.WANG Yin, LIU Guanjun, YAN Xiufeng, et al.Cloning of PsPIP1 gene from Polygonum sibiricum Laxm.and analysis of its expression in response to NaHCO3［J］.Hereditas, 2008, 30（12）: 1621 - 1628.

［25］JOHANSSON I, KARLSSON M, JOHANSON U, et al.The role of aquaporins in cellular and whole plant water balance［J］.Biochim Biophys Acta Biomembr, 2000, 1465（1/2）：324 - 342.

［26］HENZLER T, STEUDLE E.Reversible closing of water channels in charainternodes provides evidence for acomposite transport mode of the plasma membrance［J］.J Exp Bot, 1995, 46（2）: 199 - 209.

［27］艾雪，褚懷亮，李雪芹，等.山核桃水通道蛋白CcPIP同源基因克隆與表達(dá)分析［J］.福建林學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，29（3）：252 - 257.AI Xue, CHU Huailiang, LI Xueqin, et al.The analysis of Carya carthayensis plasma membrane intrinsic protein gene CcPIP clone and expression［J］.J Fujian Coll For, 2009, 29（3）: 252 - 257.

［28］林江波，王偉英，鄒暉，等.中國(guó)水仙水通道蛋白基因cDNA克隆、序列分析與表達(dá)［J］.福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，26（3）：371 - 376.LIN Jiangbo, WANG Weiying, ZOU Hui, et al.Cloning, sequence analysis and expression of cDNA encoding aquaporin NtPIP1 of Narcissus tazetta var.chinensis［J］.Fujian J Agric Sci, 2011, 26（3）: 371 - 376.

［29］CHAUMONT F, MOSHELION M, DANIELS M J.Regulation of plant aquaporin activity［J］.Biol Cell, 2005, 97（10）: 749 - 764.

［30］LI Liang, WANG Weiqi, HUANG Shan, et al.Cloning and function analysis of a plasma membrane intrinsic protein gene, GmPIP in soybean（Glycine max L.Merr）［J］.Australian J Crop Sci, 2014, 8（5）: 738 - 746.

［31］MA Pengda, LIU Jingying.Isolation and characterization of a novel plasma membrane intrinsic protein gene, LcPIP1, in Leymus chinensis that enhances salt stress tolerance in Saccharomyces cerevisiae［J］.Appl Biochem Biotechnol, 2012, 166（2）: 479 - 485.

［32］王云霄，張穎，江璐玎，等.麻瘋樹(shù)水通道蛋白新基因JcPIP干旱脅迫下的功能分析［J］.熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2008，16（4）：289 - 295.WANG Yunxiao, ZHANG Ying, JIANG Luding, et al.Cloning of a new aquaporin gene（JcPIP）from Jatropha curcas and analysis of its function under drought stress［J］.J Trop & Subtrop Bot, 2008, 16（4）: 289 - 295.

［33］張軍鋒，鄧西平，慕小倩.植物的水通道蛋白［J］.植物生理學(xué)通訊，2002，38（1）：88 - 91 ZHANG Junfeng, DENG Xiping, MU Xiaoqian.Plant aquaporin［J］.Plant Physiol Commun, 2002, 38（1）: 88 - 91.

［34］劉迪秋，王繼磊，葛鋒，等.植物水通道蛋白生理功能的研究進(jìn)展［J］.生物學(xué)雜志，2009，26（5）：63 - 66.LIU Diqiu, WANG Jilei, GE Feng, et al.Advances in the physiological functions of plant aquaporins［J］.J Biol, 2009, 26（5）: 63 - 66.

［35］王為，王長(zhǎng)彪，陳浩東，等.棉花水通道蛋白序列生物信息學(xué)初步分析［J］.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，25（1）：14 - 20.WANG Wei, WANG Changbiao, CHEN Haodong, et al.Preliminary bioinformatics analysis of aquaporin sequences available in cotton［J］.Acta Agric Zhejiang, 2013, 25（1）: 14 - 20.

［36］BOTS M, FERON R, UEHLEIN N, et al.PIP1 and PIP2 aquaporins are differentially expressed during tobacco anther and stigm a development［J］.J Exp Bot, 2005, 56（409）: 113 - 121.

［37］祝藝懿，韓淵懷，李正國(guó)，等.紅樹(shù)林植物木欖水通道基因的克隆和表達(dá)［J］.植物生理學(xué)通訊，2007，43 （3）：438 - 442.ZHU Yiyi, HAN Yuanhuai, LI Zhengguo, et al.Cloning and expression of a new aquaporin gene from Bruguiera gymnorhiza（L.）Lam［J］.Plant Physiol Comm, 2007, 43（3）: 438 - 442.

［38］劉悅霞，梁衛(wèi)紅，張利娟.水稻葉片中水通道蛋白基因OsAQP的表達(dá)分析［J］.中國(guó)水稻科學(xué)，2008，22 （5）：545 - 547.LIU Yuexia, LIANG Weihong, ZHANG Lijuan.Expression analysis on OsAQP gene in rice leaves［J］.Chin J Rice Sci, 2008, 22（5）: 545 - 547.

［39］XU Yi, HU Wei, LIU Juhua, et al.A banana aquaporin gene, MaPIP1;1, is involved in tolerance to drought and salt stresses［J］.BMC Plant Biol, 2014, 14（1）: 59.doi:10.1186/1471-2229-14-59.

Cloning of the PmPIP1 gene from Pinus massoniana and its expression with drought stress

CAI Qiong1,2, DING Guijie1,2, WEN Xiaopeng3
（1.Institute of Forest Resources and Environment, Guiyang 550025, Guizhou, China; 2.College of Forestry, Guizhou University, Guiyang 550025, Guizhou, China; 3.Guizhou Key Laboratory of Agricultural Bioengineering, Guizhou University, Guiyang 550025, Guizhou, China）

Abstract:The aquaporin（AQP）gene plays an important role in plants adapting to abiotic stresses.To predict the AQP gene function and provide basal data for mechanism of Pinus massoniana’s drought resistance, the sequence characteristics of the AQP gene from P.massoniana were analyzed and its expression profiling was studied after drought-stress treatment.The AQP gene was cloned using reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）and rapid-amplification of complementary deoxyribonucleic acid（cDNA）ends（RACE）.The expression of the AQP gene was then performed using quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction（qRT-PCR）.The full-length cDNA of the AQP gene from P.massoniana, designated PmPIP1 with a registered number in GenBank KF582038, was obtained.Results of the sequence analysis showed that the sizebook=192,ebook=13of PmPIP1 was 1 301 bp, containing an 867 bp open reading frame that encoded 288 amino acid residues with 30.86 kDa molecular weight and an 8.48 isoelectric point, a 99 bp 5′terminal untranslated regions（UTR）, and a 335 bp 3′terminal UTR.The PmPIP1 3D structure had a strong similarity to Spinacia oleracea（2b5fA）.PmPIP1 exhibited a typical structure with six transmembrane domains, and had the consensus sequence HINPAVTFG of membrane intrinsic protein（MIP）family and two highly conserved peptides Asn-Pro-Ala（NPA）.The evolutionary analysis revealed that PmPIP1 shared a 95% identity with Picea abies and belonged to PIPs.The PmPIP1 expression patterns with drought conditions showed that drought did induce PmPIP1.In conclusion, cloning of the PmPIP1 gene from P.massoniana enriched the plant aquaporin gene database, and the qRT-PCR analysis indicated that the PmPIP1 gene may be involved in the response related to drought stress.［Ch, 8 fig.1 tab.39 ref.］

Key words:botany; Pinus massoniana; aquaporin; cloning; expression

作者簡(jiǎn)介：蔡瓊，從事林木栽培生理生態(tài)與分子生物學(xué)研究。E-mail：dukecq@sina.com。通信作者：丁貴杰，教授，博士生導(dǎo)師，從事森林培育和人工林穩(wěn)定性等研究。E-mail：gjdinggzu@126.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31260183）；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2015BAD09B0102）；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（“863”計(jì)劃）項(xiàng)目（2011AA10020301）；貴州省重大專項(xiàng)（黔科合重大專項(xiàng)字［2012］6001號(hào)）；貴州省人才基地建設(shè)項(xiàng)目（黔人領(lǐng)發(fā)［2009］9號(hào)）

收稿日期：2015-04-10；修回日期：2015-05-18

doi:10.11833/j.issn.2095-0756.2016.02.002

中圖分類號(hào)：S791.248

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：2095-0756（2016）02-0191-10